Appartamento con pavimento Platform aria sollevata: Un nuovo metodo per la combinazione di Comportamento con microscopia o Elettrofisiologia su Awake liberi di muoversi Roditori

Ciao, sono Hel Lin, una studentessa post-laurea presso il Near Science Center, università di Helsinki. Oggi io e i miei colleghi vi mostreremo come eseguire registrazioni ottiche ed elettrofisiologiche in animali svegli con la testa, ma per il resto in movimento libero e comportarsi in modo libero. Il nostro metodo crea un ambiente tangibile e familiare in cui il mouse può navigare ed esplorare.

Durante l'imaging microscopico o le registrazioni elettrofisiologiche di singole cellule, che richiedono una fissazione salda della testa dell'animale, impiantamo una finestra cranica cronica e abituiamo il topo a una gabbia per case mobili trasportata in aereo, che scivola sotto i piedi dell'animale. Durante la locomozione su una superficie piana, la gabbia della casa mobile può essere posizionata sotto un microscopio verticale standard per l'imaging a due fotoni o inserita in una configurazione elettrofisiologica per le registrazioni di patch clamp nel cervello di un topo sveglio. Tutte le procedure sperimentali qui presentate sono state approvate dal comitato etico locale.

Impiantamo finestre craniche secondo i protocolli pubblicati con piccole modifiche al momento dell'impianto della finestra cranica. L'animale viene lasciato riprendersi per almeno due o tre settimane durante questo periodo di recupero, la finestra normalmente riacquista la sua trasparenza. Sono esclusi dagli esperimenti gli animali con segni di infiammazione residua post operatoria.

Addestrare gli animali selezionati per uno studio ad abituarli alla fissazione della testa. Nella gabbia della casa mobile, maneggia il mouse con calma per cinque-10 minuti, evitando movimenti bruschi e rumori, quindi rimettilo nella gabbia di casa. Ripetere la procedura due o tre volte a intervalli disuguali.

La gabbia per case mobili consente il fissaggio della testa senza anestetizzare l'animale prima del fissaggio della testa. Usa uno straccio per avvolgere il mouse due o tre volte a intervalli disuguali. Assicurati che l'animale rimanga calmo mentre è avvolto.

In caso contrario, ripetere la procedura fino a quando il mouse non si è completamente abituato. Iniziare l'addestramento due volte al giorno dei topi sulla gabbia della casa mobile il giorno successivo al completamento della manipolazione. Pesare gli animali prima di ogni sessione di addestramento.

Gli animali che mostrano una perdita di peso superiore al 10% dovrebbero essere esclusi dallo studio. Regolare la posizione del braccio di fissaggio della testa in modo che corrisponda alle dimensioni dell'animale addestrato. Collegare la presa d'aria del dispositivo gabbia per case mobili all'uscita dell'aria pressurizzata standard da laboratorio.

Assicurarsi che la pressione dell'aria sia sufficiente per il libero galleggiamento della gabbia domestica trasportata per via aerea. Inizia l'addestramento degli animali abituati nella gabbia della casa mobile. Immobilizza il topo avvolgendolo nello straccio.

Inserire il supporto metallico fissato alla testa dell'animale nel braccio di fissaggio della testa e fissarlo saldamente serrando le viti. Attiva il flusso d'aria per far levitare la gabbia domestica trasportata in aria. Rimuovi lo straccio e lascia che il topo esplori la gabbia di casa.

Durante la prima sessione di addestramento, i topi possono mostrare un comportamento di congelamento e tremore e l'erezione della coda. Per abituare l'animale al rumore, fornire un'esposizione costante ai suoni ambientali utilizzando, ad esempio, una traduzione radio o musica e voce registrate durante tutte le sessioni di addestramento e durante gli esperimenti. Per evitare lo stress cronico, utilizzare un'illuminazione a luce intensa durante la prima ora della sessione di allenamento.

Dopo la prima ora, conduci l'addestramento al buio e usa una telecamera a infrarossi per monitorare il comportamento dell'animale. Al termine della sessione di addestramento, liberare l'animale dal braccio di fissaggio della testa perdendo le viti. Rimetti l'animale nella gabbia di casa per almeno due ore prima della sessione di addestramento successiva.

Tenere il mouse in una gabbia con due o più altri topi ridurrà il livello di stress. Opzionalmente, è possibile posizionare la gabbia trasportata ad aria insieme all'animale nella sua gabbia di casa. Questo arricchirà l'ambiente e potrebbe rafforzare l'abitazione dell'animale nella gabbia della casa mobile.

Durante l'ultima sessione di allenamento, i topi sono abituati alla fissazione della testa e dovrebbero mostrare un comportamento senza stress navigando con calma intorno alla gabbia domestica trasportata per via aerea. In assenza di luce visibile, la traiettoria della locomozione del mouse può essere tracciata monitorando i movimenti della gabbia con una telecamera nel vicino infrarosso o con un mouse ottico del computer. Durante le sessioni di allenamento prolungate che durano più di una o due ore, prendere in considerazione la possibilità di fornire al topo acqua potabile, manualmente o utilizzando un portapipetta attaccato al telaio della gabbia della casa mobile.

Il diagramma seguente riassume la sequenza temporale di un tipico studio sperimentale. Lo studio inizia con l'impianto della finestra cranica due settimane prima della manipolazione del topo e continua con otto sessioni di allenamento due volte al giorno. Lo studio tipico include una serie di sessioni di imaging o sessioni di registrazione con patch clamp distanziate tra poche ore e diversi giorni o settimane.

Sia gli esperimenti ottici che quelli elettrofisiologici possono essere eseguiti in parallelo con stimoli cognitivi o comportamentali e letture. La microscopia a due fotoni è un'esclusiva tecnologia ottica non lineare che consente la visualizzazione in tempo reale di strutture cellulari e persino subcellulari negli strati corticali profondi del cervello di un roditore. Per eseguire un esperimento di imaging al microscopio a due fotoni, posizionare un animale addestrato nella gabbia della casa mobile, regolare i tappi per proteggere l'ottica del microscopio da danni accidentali.

Pulire il vetro di copertura della finestra cranica per rimuovere le particelle di polvere. Far cadere un liquido di immersione sul vetro di copertura. Si consiglia di utilizzare la soluzione di viscere perché l'acqua evapora rapidamente.

La piattaforma può essere posizionata sopra un tipico tavolo ottico motorizzato utilizzando la modalità ad ampio campo del microscopio a fluorescenza e un filtro di emissione a passaggio lungo. Valuta la vascolarizzazione cerebrale e seleziona una regione di interesse. Per visualizzare la vascolarizzazione corticale iniettare nella vena caudale di un animale fissato e immobilizzato la testa, un 70 chilo Dalton, Texas rosso coniugato testo Tran.

Questa sequenza di immagini mostra una registrazione time-lapse di luoghi e arterie nella corteccia di un topo che si comporta mentre naviga intorno alla gabbia della casa mobile. Tracciando il profilo delle linee tracciate attraverso il lume del vaso, è possibile misurare le variazioni del diametro del vaso e la motilità dei singoli segmenti del vaso. La velocità del flusso sanguigno nelle arterie e nelle vene può essere misurata mediante scansione lineare lungo le linee tracciate parallelamente alla parete del vaso. Bene.

I dettagli della morfologia dei neuroni possono essere visualizzati in topi transgenici che esprimono YFP nella sottopopolazione di neuroni sotto il promotore di Taiwan. Questi due Zack confrontano la stabilità dell'imaging tra animali anestetizzati e svegli. Il pannello laterale destro mostra i dendriti dell'animale anestetizzato con una miscela di ketamina xilazina.

Mentre il pannello laterale sinistro mostra un'immagine di dendriti in un animale sveglio che cammina intorno alla gabbia di una casa mobile. La morfologia individuale della colonna vertebrale negli animali svegli può essere analizzata con la stessa affidabilità e precisione dei topi anestetizzati. Lo spostamento del cervello durante la corsa degli animali non supera in genere da uno a un micrometro e mezzo.

Questi movimenti si verificano in direzione orizzontale e molto raramente provocano uno spostamento del piano di imaging, rendendo superflua la correzione degli artefatti di movimento. Nella maggior parte dei casi, la capacità di monitorare cronicamente l'attività neuronale nel cervello vivente sveglio è essenziale per comprendere l'organizzazione e la funzione del sistema nervoso. Utilizzando i tre topi transgenici tie one G Camp, immaginiamo l'attività neuronale spontanea nei topi svegli che si comportano nella gabbia della casa mobile.

Questa sequenza di immagini in time lapse mostra esempi rappresentativi di picchi di calcio nei corpi cellulari neuronali, niti e assoni. L'imaging ottico basato su segnali intrinseci consente di mappare la distribuzione spaziale dei domini funzionali per eseguire un esperimento di imaging ottico intrinseco. Posizionare l'animale addestrato nella gabbia domestica posizionata sotto l'obiettivo della telecamera.

Pulire il vetro di copertura dalla polvere. Metti una goccia di glicerolo e coprilo con un vetrino coprioggetti rotondo da cinque millimetri. Regola la posizione di una telecamera ad alta velocità.

Posizionare un manipolatore con un tubo di soffiaggio dell'aria opposto alla vibrazione controlaterale. Usa le luci verdi per visualizzare la mappa della nave. Focalizza più in profondità nella corteccia, circa 400 micrometri sotto i vasi corticali.

Posiziona un filtro passa-banda davanti alla fotocamera e illumina la corteccia con una luce rossa. Lasciare che il mouse si adotti alla piattaforma per almeno 30 minuti. Registra l'attività di base durante un episodio di sei minuti.

Stimolare la vibrazione ogni 10 secondi con sbuffi d'aria per un periodo totale di sei minuti. Questa immagine illustra l'attività neurale che si propaga lungo la corteccia somatosensoriale in risposta alla stimolazione con vibrazione alla frequenza di 0,05 hertz. Per eseguire registrazioni elettrofisiologiche su singola cellula, posizionare l'animale addestrato impiantato con una finestra cranica rovesciata nella gabbia della casa mobile.

Lentamente e con attenzione, rimuovere il vetro di copertura dal supporto metallico. Rinfrescare il tampone corticale e pulire la finestra cranica dai detriti con un tampone emostatico. Posizionare l'elettrodo di terra nel tampone corticale.

Riempire la pipetta patch clamp con soluzione intracellulare. Applicare una pressione positiva alla pipetta di registrazione utilizzando un micromanipolatore motorizzato, approfondire la pipetta nella corteccia e ottenere un contatto di tenuta giga con la cellula di interesse. Dopo la registrazione, rimuovere la pipetta, rinfrescare il tampone corticale e chiudere la finestra cranica con la colla in un vetro di copertura al supporto metallico.

L'uso di una gabbia domestica trasportata per via aerea consente di combinare l'imaging e l'elettrofisiologia con paradigmi comportamentali classici come l'apprendimento, la riabilitazione o il comportamento correlato all'ansia. L'olfatto è un importante input sensoriale per i topi e può essere utilizzato per la stimolazione nei test di memoria e per la valutazione della reazione alla novità. Per eseguire un test di assuefazione disaolfattiva, posizionare l'animale addestrato nella gabbia della casa mobile e lasciarlo adottare.

Per 30 minuti, attacca un pezzo di cotone pulito imbevuto di acqua di rubinetto alla parete interna della gabbia della casa mobile utilizzando un nastro biadesivo. Dopo cinque minuti, sostituisci il cotone pulito sulla parete della gabbia domestica con uno nuovo imbevuto di un liquido contenente l'odore di vaniglia. Ripeti le esposizioni di cinque minuti all'odore di vaniglia tre volte con intervalli di cinque minuti tra le sessioni.

Per misurare il livello di interesse all'odore. Conta il tempo cumulativo che l'animale trascorre rivolto verso la zona bersaglio e il tempo totale di movimento della gabbia della casa mobile. Durante l'ultima quinta sessione, presenta un odore socialmente significativo.

Inumidisci il nuovo applicatore di cotone con alcune gocce di urina di topi del sesso opposto. Per valutare la reazione alla novità, dividere la gabbia della casa mobile in quattro zone. Attacca due pezzi di cotone uno di fronte all'altro. Colore.

Codificarli con pennarelli sul lato esterno delle pareti della gabbia domestica durante la prima prova. Metti due pezzi di cotone puliti. Quindi sostituirli entrambi con del cotone imbevuto di un estratto all'1% di vaniglia.

Durante la terza prova, metti il cotone alla vaniglia nella zona numero uno e il pezzo di cotone imbevuto di un estratto di banana all'1% nella zona. Numero due, per misurare la preferenza per l'assenza di odore. Calcola il tempo che gli animali trascorrono affrontando l'assenza di odore come percentuale del tempo cumulativo rivolto verso altre zone.

Ciao, sono Leo Kiro, ricercatore principale presso il Neuroscience Center University di Helsinki. Spero che ti sia piaciuto guardare il video e che lo abbia trovato utile. Abbiamo lavorato con twofold sulla microscopia in vivo negli ultimi cinque anni, e l'uso della medicina generale ed estetica è sempre stata una grande preoccupazione perché l'estetica interferisce con la funzione cerebrale, con il flusso sanguigno e tutto il resto.

E oggi sono felice che possiamo lavorare su animali svegli ed eseguire esperimenti di imaging microscopico stabile e convalidare e verificare i risultati che avevamo precedentemente ottenuto negli animali anestetizzati. Sono sicuro che l'uso delle gabbie per case mobili e i metodi che abbiamo presentato oggi aumenteranno la rilevanza della ricerca in vivo in generale e porteranno a risultati nuovi e rivoluzionari, e non vedo l'ora di farlo.