Name: Appartamento con pavimento Platform aria sollevata: Un nuovo metodo per la combinazione di Comportamento con microscopia o Elettrofisiologia su Awake liberi di muoversi Roditori (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 2 s
Description: Scopri come eseguire registrazioni ottiche ed elettrofisiologiche in topi svegli e liberi di muoversi utilizzando una gabbia domestica mobile sollevata ad aria. Questo metodo riduce lo stress e migliora la qualità dei dati.

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Gli autori ringraziano il Prof. Eero Castren per i suoi preziosi commenti sul manoscritto. Il lavoro è sostenuto da finanziamenti L&#39;Accademia di Finlandia, il Centro per la Mobilità Internazionale della Finlandia, e il finlandese Graduate School of Neuroscience (cervello e della mente Dottorato).

<ol><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR-dependent+synapse+formation+underlies+the+rapid+antidepressant+effects+of+NMDA+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists.</a> Science. 329, 959-964 (2010).</li>
<li>Sitdikova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+suppresses+early+cortical+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+and+Translational+Neurology%22%5BJournal%5D)">Isoflurane suppresses early cortical activity.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 1 (1), 15-26 (2013).</li>
<li>Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+miniature+head-mounted+two-photon+microscope.+high-resolution+brain+imaging+in+freely+moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A miniature head-mounted two-photon microscope. high-resolution brain imaging in freely moving animals.</a> Neuron. 31, 903-912 (2001).</li>
<li>Piyawattanametha, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+brain+imaging+using+a+portable+2.9+g+two-photon+microscope+based+on+a+microelectromechanical+systems+scanning+mirror%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+letters%22%5BJournal%5D)">In vivo brain imaging using a portable 2.9 g two-photon microscope based on a microelectromechanical systems scanning mirror.</a> Optics letters. 34, 2309-2311 (2009).</li>
<li>Sawinski, J., Wallace, D. J., Greenberg, D. S., Grossmann, S., Denk, W., Kerr, J. N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visually+evoked+activity+in+cortical+cells+imaged+in+freely+moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Visually evoked activity in cortical cells imaged in freely moving animals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19557-19562 (2009).</li>
<li>Fee, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+stabilization+of+electrodes+for+intracellular+recording+in+awake+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Active stabilization of electrodes for intracellular recording in awake behaving animals.</a> Neuron. 27, 461-468 (2000).</li>
<li>Greenberg, D., Houweling, A., Kerr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+imaging+of+ongoing+neuronal+activity+in+the+visual+cortex+of+awake+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Population imaging of ongoing neuronal activity in the visual cortex of awake rats.</a> Nat Neurosci. 11 (7), 749-751 (2008).</li>
<li>Fujiwara-Tsukamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reinforcing+operandum%3A+rapid+and+reliable+learning+of+skilled+forelimb+movements+by+head-fixed+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Reinforcing operandum: rapid and reliable learning of skilled forelimb movements by head-fixed rodents.</a> Journal of Neurophysiology. 108, 1781-1792 (2012).</li>
<li>Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Resolution+Functional+Imaging+in+Behaving+Rats+Using+Voluntary+Head+Restraint%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cellular Resolution Functional Imaging in Behaving Rats Using Voluntary Head Restraint.</a> Neuron. 80, 371-384 (2013).</li>
<li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nat Neurosci. 13, 1433-1440 (2010).</li>
<li>Parry, T. J., McElligott, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+restraining+awake+rats+using+head+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Physiolog+%26+behavior%22%5BJournal%5D)">A method for restraining awake rats using head immobilization.</a> Physiolog & behavior. 53 (5), 1011-1015 (1993).</li>
<li>Brecht, M., Schneider, M., Sakmann, B., Margrie, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whisker+movements+evoked+by+stimulation+of+single+pyramidal+cells+in+rat+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Whisker movements evoked by stimulation of single pyramidal cells in rat motor cortex.</a> Nature. 427 (6976), 704-710 (2004).</li>
<li>Van Looij, M. A. J., Liem, S. -S., van der Burg, H., van der Wees, J., De Zeeuw, C. I., van Zanten, B. G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+conventional+anesthesia+on+auditory+brainstem+responses+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Impact of conventional anesthesia on auditory brainstem responses in mice.</a> Hearing research. 193, 75-82 (2004).</li>
<li>Hentschke, H., Schwarz, C., Antkowiak, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortex+is+the+major+target+of+sedative+concentrations+of+volatile+anaesthetics%3A+strong+depression+of+firing+rates+and+increase+of+GABAA+receptor-mediated+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neocortex is the major target of sedative concentrations of volatile anaesthetics: strong depression of firing rates and increase of GABAA receptor-mediated inhibition.</a> The European journal of neuroscience. 21, 93-102 (2005).</li>
<li>Margrie, T. W., Brecht, M., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo%2C+low-resistance%2C+whole-cell+recordings+from+neurons+in+the+anaesthetized+and+awake+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%3A+European+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain.</a> Pflugers Archiv: European journal of physiology. 444, 491-498 (2002).</li>
<li>Crochet, S., Petersen, C. C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlating+whisker+behavior+with+membrane+potential+in+barrel+cortex+of+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Correlating whisker behavior with membrane potential in barrel cortex of awake mice.</a> Nat Neurosci. 9, 608-610 (2006).</li>
<li>Houweling, A. R., Brecht, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+report+of+single+neuron+stimulation+in+somatosensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Behavioural report of single neuron stimulation in somatosensory cortex.</a> Nature. 451, 65-68 (2008).</li>
<li>Poulet, J. F. A., Petersen, C. C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+brain+state+regulates+membrane+potential+synchrony+in+barrel+cortex+of+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Internal brain state regulates membrane potential synchrony in barrel cortex of behaving mice.</a> Nature. 454, 881-885 (2008).</li>
<li>Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+stereotaxic+recordings+of+neuronal+activity+in+awake%2C+head-restrained+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice.</a> Journal of neuroscience methods. 178, 75-79 (2009).</li>
<li>De Kock, C. P. J., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiking+in+primary+somatosensory+cortex+during+natural+whisking+in+awake+head-restrained+rats+is+cell-type+specific%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16446-16450 (2009).</li>
<li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake%2C+mobile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56, 43-57 (2007).</li>
<li>Hentschke, H., Haiss, F., Schwarz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+signals+rapidly+switch+tactile+processing+in+rat+barrel+cortex+during+whisker+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+cortex%22%5BJournal%5D)">Central signals rapidly switch tactile processing in rat barrel cortex during whisker movements.</a> Cerebral cortex. 16, 1142-1156 (2006).</li>
<li>Stüttgen, M. C., Rüter, J., Schwarz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+psychophysical+channels+of+whisker+deflection+in+rats+align+with+two+neuronal+classes+of+primary+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Two psychophysical channels of whisker deflection in rats align with two neuronal classes of primary afferents.</a> J. neuroscience. 26, 7933-7941 (2006).</li>
<li>Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+activity+in+barrel+cortex+underlying+vibrissa-based+object+localization+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice.</a> Neuron. 67, 1048-1061 (2010).</li>
<li>Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuating+and+sensory-induced+vasodynamics+in+rodent+cortex+extend+arteriole+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extend arteriole capacity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (20), 8473-8478 (2011).</li>
<li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461, 941-946 (2009).</li>
<li>Chen, G., King, J. A., Burgess, N., O’Keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+vision+and+movement+combine+in+the+hippocampal+place+code%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">How vision and movement combine in the hippocampal place code.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 378-383 (2013).</li>
<li>Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice-specific+sequences+in+parietal+cortex+during+a+virtual-navigation+decision+task%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task.</a> Nature. 484 (7392), 62-68 (2012).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term , high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 19-22 (2009).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Trachtenberg, J. T., de Paola, V., Svoboda, K., Wilbrecht, L., Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Neocortical+Neurons+through+a+Chronic+Cranial+Window%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging Neocortical Neurons through a Chronic Cranial Window.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (2012).</li>
<li>Garaschuk, O., Milos, R. -I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+bulk-loading+of+fluorescent+indicators+for+two-photon+brain+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo.</a> Nat Protoc. 1 (1), 380-386 (2006).</li>
<li>Barry, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JPCalc%2C+a+software+package+for+calculating+liquid+junction+potential+corrections+in+patch-clamp%2C+intracellular%2C+epithelial+and+bilayer+measurements+and+for+correcting+junction+potential+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements.</a> Journal of neuroscience methods. 51 (1), 107-116 (1994).</li>
<li>Golshani, P., Gonçalves, J. T., Khoshkhoo, S., Mostany, R., Smirnakis, S., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internally+mediated+developmental+desynchronization+of+neocortical+network+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Internally mediated developmental desynchronization of neocortical network activity.</a> The Journal of neuroscience. 29 (35), 10890-10899 (2009).</li>
<li>Polack, P. -O., Friedman, J., Golshani, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+brain+state-dependent+gain+modulation+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of brain state-dependent gain modulation in visual cortex.</a> Nat Neurosci. 16 (9), 1331-1339 (2013).</li>
<li>Schwarz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+head-fixed+behaving+rat--procedures+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Somatosensor.%2C+%26+motor+research%22%5BJournal%5D)">The head-fixed behaving rat--procedures and pitfalls.</a> Somatosensor., & motor research. 27, 131-148 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Per meglio comprendere la fisiologia del cervello e patologia, la ricerca deve essere eseguita su una varietà di livelli di complessità di preparazione, utilizzando le tecniche più appropriate per ciascun preparato. Allo stato attuale, una vasta gamma di metodologie neuroscienze (da full-body fMRI alla microscopia STED sub-organello) sono facilmente applicati agli animali anestetizzati, mentre esperimenti su animali svegli e comportarsi hanno rappresentato una sfida metodologica significativo. Qui, un nuovo approccio è descritto in cui un animale da laboratorio, pur essendo fermamente testa fissa, in grado di muoversi un homecage mobile-aria alzato ed esplorare il suo ambiente concreto in condizioni senza stress. La preparazione animale testa fissa comportarsi qui presentato offre una serie di vantaggi importanti. In primo luogo, i dati elettrofisiologici o di imaging ottenuti con questo metodo sono compromessi né dalla anestesia né da stress vincolare indotta. Posizionamento del mouse in casa mobilegabbia è veloce e non richiede l&#39;anestesia l&#39;animale, anche transitoriamente. In secondo luogo, la homecage aria sollevata assicura la stabilità meccanica necessaria per quantificare i cambiamenti in fine morfologia neuronale e registrare cella singola attività elettrofisiologica in animali svegli. Infine, il design del homecage mobile è più compatta rispetto al tapis roulant sferica, consentendo il posizionamento della homecage mobile sotto un microscopio verticale standard per due fotoni imaging o registrazione patch-clamp in cervello sveglio del mouse. Fissazione testa ferma nel homecage mobile richiede l&#39;impianto di un supporto metallico a quattro ali appositamente progettato, con una apertura circolare al centro per l&#39;accesso ottica o elettrica alla regione cerebrale sottostante. Questi supporti metallici sono attaccati al cranio mediante una combinazione di colla, cemento dentale e di una vite avvitata nell&#39;osso cranio. Questa procedura chirurgica è stata sviluppata sulla base di un gran numero di precedentementeprocedure pubblicate, ed è stato trovato per causare un preparato finestra cranica stabile e riproducibile. Per gli esperimenti in vivo elettrofisiologiche, una finestra a forma di mezzaluna 34, una piccola craniotomia dimensioni (inferiore a 0,5 mm) 32, e una preparazione copertura in vetro forato 35 sono state utilizzate. Qui, il &quot;invertito&quot; finestra del cranio è stato impiantato sia con un grande (diametro 3,5 mm) o piccole (diametro inferiore a 0,5 mm) craniotomia. Riducendo al minimo movimento del cervello è fondamentale per le registrazioni singola cellula stabili, è per questo che è consigliabile eseguire craniotomie di piccole dimensioni per esperimenti di elettrofisiologia. Dopo l&#39;impianto della finestra cranica per esperimenti di imaging ottico, gli animali possono recuperare per almeno 2 o 3 settimane, durante il quale la finestra perde prima transitoriamente la sua trasparenza e poi riacquisisce essa (con una resa del 50-70%, a seconda background genetico del ceppo mouse). La trasparenza della finestra cranica e la stabilitàlità del cemento &quot;tappo&quot; dentale attaccato al cranio può essere verificata mediante un microscopio binoculare regolare e ispezione fisica durante la movimentazione degli animali. Al termine del periodo di recupero di 2-3 settimane, gli animali che presentano segni di infiammazione residua post-operativa o difetti meccanici in cemento dentale dovrebbero essere escluse dagli esperimenti e terminati. L&#39;età ottimale per iniziare la formazione del topo è di 2-4 mesi (corrispondente al peso di 20-40 g). Negli animali giovani, ancoraggio del cemento &quot;tappo&quot; dentale al cranio può essere inaffidabile, che può diminuire la sua resistenza alle sollecitazioni meccaniche che viene imposto dal locomozione del mouse testa fissa nel homecage mobile. Sebbene topi maschi e femmine appaiono ugualmente disposti a spostarsi in homecage mobile, c&#39;è una tendenza per ottenere una migliore percentuale di intervalli cranici recuperare la loro trasparenza nei topi femmina (dati non mostrati). Quindi, per to garantire un equilibrato mix di generi nella coorte di animali selezionati per l&#39;imaging, l&#39;impianto finestre craniche in circa il 30% più topi maschi è raccomandato. Interazioni sociali sono noti per migliorare il benessere degli animali e ridurre lo stress, quindi è consigliabile che fratellini siano gestiti e addestrati in parallelo e tenuti insieme in gabbie di stabulazione in gruppo. In contrasto con le procedure pubblicate per la preparazione treadmill sferica 13, il metodo che utilizza la homecage mobile non richiede anestetizzare il mouse al momento del fissaggio testa. Questa differenza è importante perché consente di escludere eventuali effetti residui che anche una breve e &quot;leggera&quot; episodio anestesia rischia di avere sulle misurazioni fisiologiche ottenute poco dopo. Infatti, anche se negli studi in cui la fissazione di testa è stato fatto sotto anestesia e gli esperimenti reali sono state avviate dopo un breve periodo di attesa 13, non si puòescludere eventuali effetti a lungo termine del breve episodio anestesia sui dati sperimentali. Altri studi si sono basati sulla privazione di acqua per assuefazione sistematica degli animali a testa di fissaggio e usato ricompensa acqua come mezzo di motivare l&#39;animale a rimanere immobile 36. Tuttavia, il metodo di fissazione testa ricompensa a base limita la scelta dei test comportamentali applicabili e, soprattutto, occupa una delle associazioni stimolo-ricompensa ben consolidati. Al contrario, il metodo di topo assuefazione alla testa di fissaggio in homecage mobile non richiede privazione di acqua e successiva premio. Completando la homecage mobile con un sistema di erogazione di acqua è consigliato per gli esperimenti di lunga durata. Le sessioni di addestramento di animali ed esperimenti qui presentate sono state fatte durante il giorno (8:00-06:00), che corrisponde al periodo fisiologicamente passivo per quei topi che vengono tenuti sotto il piano della luce di 12 ore standard (lillum na su alle 6 del mattino e si spegne alle 06:00). Poiché l&#39;assunzione di acqua è direttamente associato con l&#39;attività del topo, durante i topi periodo passivi non richiedono erogazione acqua se la durata di una sessione di allenamento / immagini / registrazione non superi 2 ore. Oltre alla tempistica e la durata delle sessioni di formazione, si ha la necessità di affrontare la questione del numero ottimale di sedute necessarie per abituare gli animali homecage mobile. A tal fine, due criteri sono stati utilizzati per valutare lo stress indotto dalla testa le procedure di fissaggio: i) la perdita di peso, e ii) il livello di attività locomotoria. Come mostrato in Figura 6, la perdita di peso raggiunge il livello medio del 6% sulla formazione giorno 2, ed è completamente invertito giornata di formazione 4 (Figura 6A). Coerentemente con le dinamiche di pesatura, il livello di attività locomotoria degli animali testa-fisso viene soppresso il primo giorno di formazione, ma stabilizza dopo giorno formazione 4 (Figura 6D). In base a queste misurazioni, si sugt che la durata minima del periodo di formazione mouse su homecage cellulare è di 4 giorni, come descritto nel presente protocollo. L&#39;uso del-aria sollevata, homecage mobili TV a pavimento permette di aggiungere compiti complessi (sensomotorie, percettive e cognitive) ai paradigmi di formazione per topi testa-fisso. Nel presente studio vengono presentati due protocolli di test comportamentali. Entrambi i protocolli utilizzano tracce olfattive e possono essere combinati con longitudinali immagini / registrazioni nella corteccia mouse. Anche se il homecage cellulare viene prodotta con materiali non assorbenti, bisogna comunque tenere conto di possibili interferenze tra l&#39;odore del dispositivo e prova di odore (s). Un altro fattore che può interferire con visuali / segnali tattili di un esperimento comportamentale è la giunzione tra la parete e l&#39;inserto, che non è perfetta e può, quindi, essere percepito dal l&#39;animale come un punto di riferimento. Vale la pena notare qui che, al fine di minimizzare lo stress dell&#39;animale durante tale integrazionerventions il posizionamento di un cotone odore presentando alla parete homecage mobile, sperimentatore dovrebbero praticare effettuare tali interventi il ​​più rapidamente possibile, evitando manipolazione prolungata della gabbia carbonio. Strategie per romanzo presentazione odore / oggetto alternative sono concepibili, ad esempio, ponendo soluzione a base di idrogel gocce o oggetti (quali chip alimentari) su piccole mensole fissate alla superficie interna della parete della gabbia carbonio all&#39;altezza compatibile con posizionamento testa dell&#39;animale. Homecage Mobile consente di animali testa-fisso per eseguire una vasta gamma di movimenti bidimensionali tra cui locomozione orizzontale, situp, governare, sbattere, leccare, naso frugando, i movimenti delle zampe anteriori qualificati, e toccante parete con arti anteriori, come illustrato nel presente studio . Utilizzando homecage mobile e protocolli qui presentati, i ricercatori possono studiare il sistema neuronale sensomotoria con un alto livello di controllo sia la condizione di stimolaziones e alle letture comportamentali. Inoltre, studi di capacità cognitive nei topi svegli possono essere eseguite durante il condizionamento, la navigazione spaziale e compiti decisionali. Ci sono diverse limitazioni pratiche di questo metodo. In primo luogo, è necessaria una notevole quantità di aria in pressione per raggiungere la potenza-homecage sollevamento ed effettuare esperimenti di lunga durata. In secondo luogo, la homecage cellulare nella sua attuale implementazione è solo 18 cm di diametro, e quindi fornisce una relativamente piccola e semplice spazio rispetto alla realtà virtuale, dove un ambiente sperimentale complesso può essere progettato senza limitazioni spaziali. In terzo luogo, durante il baffo stimolazione ed esperimenti a base di ricompensa-qui presentati, un dispositivo è stato utilizzato che limita la possibilità al muro contatto per il mouse. Aggiunta di un canale visivo o sensoriale esterno stimolazione (ad esempio un proiettore di luce-eye diretto) richiederebbe la progettazione di un dispositivo più ergonomico e compatto rispetto aii multipli a schermo o dome-proiezione soluzioni che sono stati utilizzati negli esperimenti tapis roulant sferiche. In sintesi, l&#39;uso dei topi testa fissa spostano nella homecage mobile-aria sollevata facilita notevolmente gli studi che combinano livelli cellulari, molecolari e comportamentali di osservazione e manipolazione in un singolo esperimento. Le applicazioni specifiche qui illustrati sono due fotoni di imaging microscopico, intrinseco di imaging segnale ottico e registrazioni di patch-clamp in topi Comportarsi non anestetizzati. Si prevede che questo approccio aprirà nuovi orizzonti nella sperimentazione su svegli, comportandosi mouse e servire come un utile strumento sia per lo sviluppo di farmaci e la ricerca di base delle funzioni cerebrali.

Una tendenza emozionante recente nelle Neuroscienze è sviluppare approcci sperimentali per cellulare e molecolare sondaggio delle reti neuronali nel cervello di veglia, comportandosi roditori. Tali approcci tenere la promessa di gettare nuova luce sui processi neurofisiologici che sono alla base della funzione motoria, integrazione sensomotoria, la percezione, l&#39;apprendimento, la memoria, così come la progressione del pregiudizio, neurodegenerazione e le malattie genetiche. Inoltre, la registrazione dal cervello di animali svegli promettente nello sviluppo di nuovi agenti terapeutici e trattamenti. Vi è una crescente consapevolezza che l&#39;anestesia, che è stato comunemente usato in esperimenti neurofisiologici, può influenzare i meccanismi di base della funzione cerebrale, che potrebbe condurre alla erronea interpretazione dei risultati sperimentali. Così, la ketamina anestetico ampiamente usato aumenta rapidamente la formazione di nuove spine dendritiche e migliora la funzione sinaptica 1; un altro anestetici comunemente usatiic isoflurano a livelli di anestesia chirurgica sopprime completamente l&#39;attività corticale spontanea nei ratti appena nati e blocca oscillazioni mandrino-burst in animali adulti 2. Attualmente, solo un numero limitato di approcci abilitare esperimenti in topi non anestetizzati mediante due fotoni di imaging microscopico o patch-clamp. Questi approcci possono essere suddivisi in preparazioni liberi di muoversi e di testa-fisso. L&#39;attrattiva unica di un preparato animale muoversi liberamente è che permette la valutazione del comportamento naturale, compresi i movimenti di tutto il corpo durante la navigazione. Un modo per l&#39;immagine all&#39;interno del cervello di un roditore muoversi liberamente è quello di collegare un microscopio da testa miniaturizzata o fibroscopio 3-5. Tuttavia, i dispositivi miniaturizzati tendono ad avere prestazioni ottiche limitato rispetto alla microscopia a due fotoni obiettivo a base, e non possono essere facilmente combinato con intere registrazioni cella patch-clamp 6. Il exiSoluzioni sting per la testa di fissazione di un roditore svegli si sono affidati principalmente sia sulla contenzione fisica 7,8 o sulla formazione l&#39;animale a esporre poggiatesta volontaria 9. Un altro approccio popolare è consentire arti dell&#39;animale per spostare appoggiandolo su, ad esempio, un tapis roulant sferico 10; questo approccio è spesso combinato con la realtà virtuale generata dal computer. Esperimenti di elettrofisiologia sui topi testa fissa sono in gran parte utilizzato le registrazioni extracellulari e sono stati utilizzati per studiare regolazione centrale della funzione cardiovascolare 11, effetti dell&#39;anestesia sull&#39;attività neuronale 12, la risposta uditiva del tronco encefalico 13 e di elaborazione delle informazioni 14. Le pionieristiche registrazioni intracellulari / cellule intere negli animali Comportarsi sveglio sono stati eseguiti negli anni 2000 e si sono concentrati su attività neurale legati alla percezione e movimento 15-20. Intorno allo stesso tempo, sono stati pubbli i primi studi di imaging microscopici sui topi svegliaccertata, dove microscopia a due fotoni è stato utilizzato nella corteccia sensoriale di ratti fisicamente trattenuto 7 e su topi in esecuzione su un tapis roulant sferico 21. Vivo studi di microscopia e di elettrofisiologia successive hanno dimostrato che un preparato fissazione testa può essere combinato con successo con paradigmi comportamentali basati sui movimenti degli arti anteriori, il riconoscimento degli odori, sbattere, e leccare 8,22-25. Topi immessi sul tapis roulant sferico possono essere addestrati per navigare l&#39;ambiente visivo virtuale generato da un computer 10,26. Registrazioni intracellulari / extracellulari dimostrato che, in un animale testa fissa navigazione tale ambiente virtuale, attivazione delle cellule di posizione ippocampali può essere rilevata 27. In un ambiente visivo virtuale, i topi mostrano normale movimento legate theta ritmo nel potenziale campo locale e theta fase di precessione durante il movimento attivo 27. Recentemente, il activit spaziale e temporaley modelli di popolazioni neuronali sono stati registrati otticamente in topi durante la lavorazione compiti di decisione memoria in un ambiente virtuale 28. Pur avendo abilitato ricerca d&#39;avanguardia, il design tapis roulant sferico ha diverse limitazioni intrinseche. In primo luogo, l&#39;animale deve spostare su una superficie illimitato di una palla di aria alzato rotante, che pone ostacoli materiali come muri o barriere. Questa limitazione è solo in parte compensato dalla &quot;realtà virtuale&quot; generati dal computer, perché input visivo è probabilmente meno efficace su topi e ratti rispetto all&#39;ingresso sensoriale tattile (ad esempio, baffo tasto o leccare), che queste specie naturalmente affidano on. In secondo luogo, la notevole curvatura della superficie della sfera può essere scomodo per i topi di laboratorio utilizzati per camminare su un pavimento piatto nelle loro gabbie. Infine, il diametro pura della palla (almeno 200 mm nei topi e 300 mm per ratti) rende la dimensione verticale della sfericaDispositivo tapis roulant relativamente grande. Questo rende difficile conciliare treadmill sferica con la maggioranza di configurazioni microscopia disponibili in commercio, e spesso richiede la costruzione di una nuova configurazione intorno al treadmill mediante telai microscopio su misura. Qui, un nuovo metodo è descritto in cui un topo testa fissa può muoversi un homecage mobile-aria alzato che dispone di un pavimento piatto e pareti tangibili, ed esplorare l&#39;ambiente fisico in condizioni di senza stress. Questo articolo illustra le procedure di formazione del mouse e la fissazione di testa, e fornisce esempi rappresentativi dove microscopia a due fotoni, imaging ottico intrinseca e patch-clamp registrazioni vengono eseguite nel cervello di topi Comportarsi sveglio.

<table><tbody><tr><td>Pinzette, acciaio inossidabile, 115 mm</td><td>XYtronic</td><td>XY-2A-SA</td><td></td></tr><tr><td>Tagliaanimali, rasatrice</td><td>Aesculap</td><td>Isis GT420</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio binoculare</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura biologico con termoforo in acciaio inossidabile</td><td>Supertech</td><td>TMP-5b</td><td></td></tr><tr><td>Lama microchirurgica smussata</td><td>BD</td><td>REF </td><td></td>374769</tr><tr><td>Tubo in borosilicato con filamento</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF120-69-10</td><td>Per la produzione di pipette</td></tr><tr><td>patch Fotocamera&nbsp;</td><td>Foscam</td><td>FI8903W</td><td>Visibilità notturna</td></tr><tr><td>Carprofene</td><td>Pfizer</td><td>Rimadyl vet</td><td></td></tr><tr><td>Cemento dentale</td><td>DrguDent, Dentsply</td><td>REF 640 200 271</td><td></td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>FaunaPharma</td><td>Rapidexon vet</td><td></td></tr><tr><td>Trapani monouso</td><td>Meisinger</td><td>HP 310104001001008</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeco' s PBS 10x</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pinze, 110 mm</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Lubrificante per gli occhi</td><td>Novartis</td><td>Viscotears</td><td>Per la protezione degli occhi durante il funzionamento e come soluzione viscosa per immersione&nbsp;</td></tr><tr><td>Controllo del trapano Foredom</td><td>Foredom&nbsp;</td><td>FM3545</td><td></td></tr><tr><td>Manipolo per micro motori Foredom</td><td></td><td>MH-145</td><td></td></tr><tr><td>Supporto in metallo a quattro ali</td> Supporto per testa <td>Neurotar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>per topi</td><td>Narishige</td><td>SG-4N</td><td>Assemblato su strumento stereotassico</td></tr><tr><td>Spugna di collagene emostatico</td><td>Avitene, Ultrafoam BARD</td><td>Ref 1050050</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Intervet</td><td>Ketaminol veterinario</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-Sil&nbsp;</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mai Tai DeepSee laser</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro pinza per medicazione, 105 mm</td><td>Aesculap</td><td>BD302R</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per microelettrodi</td><td>Narishige</td><td>PC-10H</td><td>Estrattore verticale per la produzione di pipette in vetro</td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Sensapex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini bullone</td><td>Centrostyle</td><td>Ref. 00343 acciaio inox M1.0x4.5</td><td></td></tr><tr><td>Mobile Homecage</td><td>Neurotar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiphoton Laser Scanning Microscopio</td><td>Olympus</td><td>FV1000MPE</td><td></td></tr><tr><td>Tamponi non tessuti, 5 x 5</td><td>Molnlycke Health Care</td><td>Mesoft</td><td>Tamponi chirurgici Colla</td></tr><tr><td>poliacrilica</td><td>Henkel</td><td>Loctite 401</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetto rotondo</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td></td><td>1.5 spessore</td></tr><tr><td>Strumento stereotassico per piccoli animali</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per iride da studente, dritte 11,5 cm</td><td>FST</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Bayer Health Care</td><td>Rompun veterinario</td><td></td></tr></tbody></table>

appartamento con pavimento platform aria sollevata: un nuovo metodo per la combinazione di comportamento con microscopia o elettrofisiologia su awake liberi di muoversi roditori

Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents

E &#39;ampiamente riconosciuto che l&#39;uso di anestetici generali può minare la pertinenza dei dati elettrofisiologici o microscopiche ottenute dal cervello di un animale vivo. Inoltre, il lungo recupero dall&#39;anestesia limita la frequenza degli episodi ripetuti di registrazione / di imaging in studi longitudinali. Quindi, nuovi metodi che permettano registrazioni stabili da topi Comportarsi non anestetizzati sono tenuti a far avanzare i campi delle neuroscienze cellulari e cognitive. Soluzioni esistenti spaziano dalla mera contenzione fisica ad approcci più sofisticati, come il tapis roulant lineari e sferici usati in combinazione con la realtà virtuale generata dal computer. Qui, un nuovo metodo è descritto in cui un topo testa fissa può muoversi un homecage mobile-aria alzato ed esplorare il suo ambiente in condizioni di senza stress. Questo metodo permette ai ricercatori di effettuare test comportamentali (ad esempio, l&#39;apprendimento, assuefazione o di riconoscimento romanzo oggetto) in contemporanea condue fotoni di imaging microscopico e / o patch-clamp, tutti combinati in un singolo esperimento. Questo video-articolo descrive l&#39;uso del dispositivo di fissaggio testa animale sveglio (homecage mobile), dimostra le procedure di assuefazione animale, ed esemplifica una serie di possibili applicazioni del metodo.

Il metodo presentato qui è inteso per l'imaging microscopico o monocellulari registrazioni elettrofisiologiche in Svegliatevi, topi testa fissa ma altrimenti liberamente in movimento e si comportano. L'animale può muoversi in due dimensioni in un vero e proprio (al contrario di virtuale), l'ambiente tangibile e familiare, mentre il cranio degli animali è fissato saldamente al braccio di fissaggio testa. Abituare i topi al homecage mobile-aria sollevata consiste di 4-6 giorni di sessioni di formazione di 2 ore due volte al giorno (Figura 1). Gli animali addestrati possono essere usati negli esperimenti immediatamente. Uno studio tipico comprende un certo numero di sessioni di imaging o sessioni di registrazione patch-clamp che sono distanziati a intervalli che vanno da poche ore a diversi giorni o settimane. È importante sottolineare che entrambe le registrazioni ottiche ed elettrofisiologiche possono essere eseguite contemporaneamente stimoli cognitivi o comportamentali e letture, in un singolo esperimento. Per valutare la stabilità meccanicatesta di fissaggio del mouse nella homecage mobile, le sequenze di immagini di navi corticali etichettati con destrano fluorescente coniugato e dei dendriti corticali esprimenti YFP sono stati raccolti mentre gli animali sperimentali sono state navigando il homecage mobile (Figura 2). Gli spostamenti massimi del cervello durante la locomozione dell'animale non hanno in genere superano 1-1,5 micrometri. Tali spostamenti sono verificati nelle direzioni orizzontale e molto raramente provocato uno spostamento rilevabile del piano dell'immagine, rendendo superflua qualsiasi correzione di artefatti di movimento. Stabile fissazione testa homecage mobile consente la quantificazione delle singole spine dendritiche in animali svegli con la stessa affidabilità in topi anestetizzati. Densità delle spine dendritiche, la morfologia e il fatturato possono essere monitorati durante gli studi longitudinali con più sessioni di imaging eseguiti ad intervalli che vanno da poche ore a diversi giorni o settimane. L'usabilità del mobile homecage per l'imaging ottico funzionale è stato testato in corteccia somatosensoriale di topi svegli utilizzando due approcci: i) microscopia a due fotoni sui topi transgenici Thy1-GCaMP3 e ii) intrinseca di imaging segnale ottico in topi wild-type. Ca 2 + immagini sono state eseguite a livello 2/3, che contiene corpi cellulari di molti neuroni fluorescente, così come i loro dendriti e assoni (Figura 3). Le trame di fluorescenza-over-time provenienti da regioni selezionate di interesse (ROI) sono mostrati in figura 3, dimostrando l'attività neuronale spontanea (misurata come aumenti transitori GCaMP3 fluorescenza) durante la navigazione attiva del mouse nella homecage mobile. Imaging ottico basato su segnali intrinseci permette la mappatura della distribuzione spaziale dei domini funzionali. Figura 4 illustra i cambiamenti ondulatori nel livello di ossigenazione del sangue (che riflettono attivazione neuronale regionale) che propagano lungo corteccia somatosensoriale in risposta a vibrissa stimolazione alla frequenza di 0,05 Hz. Per testare la fattibilità di registrazioni di patch-clamp con homecage mobile, abbiamo usato 2-3 mesi di età topi C57BL/6J. Layer 2/3 neuroni nella corteccia somatosensoriale sono stati registrati in configurazione da cellula intera utilizzando la modalità morsetto corrente. Registrazione patch-clamp nel cervello di topi sveglio testa fissa sulle homecage mobile era essenzialmente simile ai non vedenti di patch-clamp in fettine cerebrali. Circa il 50% dei tentativi provocato formazione gigaseal successo, di cui più del 70% ha prodotto la registrazione cellula intera configurazione stabile. Non sono stati osservati eventi di perdere il contatto gigaseal dovuti allo spostamento meccanico delle cellule. Figura 5 illustra un frammento di 60 secondi di un rappresentante di 10 minuti lungo di registrazione corrente-clamp correlata con episodi di attivo (in esecuzione) di topo e (a riposo) stati passivi. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src='"/' files width='"600"'> Figura 1. Metodo della testa di fissaggio di topi sveglio nel homecage mobile. A) Presentazione del progetto homecage mobile-aria sollevata e illustrazioni del concetto generale. B) Schema di un tipico temporale sperimentale. Lo studio inizia con l'impianto della finestra cranica due settimane prima abituare il mouse per movimentazione e confezionamento, che è seguita da otto allenamenti due volte al giorno. Lo studio tipico include un numero di sessioni di imaging o sessioni di registrazione patch clamp che sono distanziati a intervalli che vanno da poche ore a diversi giorni o settimane. Entrambe le misure ottiche ed elettrofisiologiche può essere fatto in parallelo con stimoli e letture cognitive o comportamentali all'interno di un singolo esperimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 2. Esempio di due fotoni di imaging microscopico su topi svegli movimento intorno al homecage mobile. A, B) vascolare corticale, etichettato con il destrano Red coniugato 70 kDa Texas. Il diametro dei singoli segmenti di flotta è misurata tracciando nel tempo il profilo delle linee tracciate tra il lume del vaso durante i periodi di riposo di topo e in esecuzione (A). Il tasso di flusso di sangue nelle arterie e vene viene misurata mediante scansione lineare lungo le linee tracciate parallelamente alla parete del serbatoio (B). C, D) Belle dettagli di morfologia neuronale visualizzato nel cervello di topi transgenici che esprimono YFP in sottopopolazione di neuroni sotto il promotore Thy1. Ricostruzione tridimensionale dei neuroni piramidali corteccia somatosensoriale del mouse (C). Le immagini di un dendritica branch acquisito in una veglia, comportandosi del mouse sono sufficientemente stabili per la quantificazione dei singoli spine morfologia dendritica (D). E) Quantificazione del movimento cerebrale causato da movimenti del mouse. Più grandi spostamenti di ampiezza correlano con i periodi di funzionamento del mouse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig3highres.jpg" width="600"> Figura 3. Esempio di attività della popolazione neuronale in veglia Thy1-GCaMP3 del mouse si muove intorno al homecage mobile. A) l'immagine a due fotoni di strato corticale II / III neuroni. ROI, per esempio neuronali corpi cellulari, dendriti e assoni sono mostrati in giallo. B) Af / F tracce della fluorescenza GCaMP3 dal ROI mostrati in A (tempo di serie registrata a 1.5 sec / frame). C) ingrandita in regione ripreso a 65 msec / telaio. D) Fluorescenza dal ROI gialli in C tracciato nel corso del tempo, mostra i transitori aumenti (rosso) in fluorescenza GCaMP3 che corrispondono all'azione potenziali indotti Ca 2 + episodi afflusso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig3highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig4highres.jpg" width="600"> Figura 4. Esempio di mappatura della distribuzione spaziale delle risposte funzionali nella corteccia di un mouse sveglio mediante l'imaging segnali ottici intrinseci. A) Visione luminosa campo dei vasi sanguigni superficiali attraverso la finestra cranica. B) Entità mappa della attività di base in mobile homecage durante un episodio di 6 minuti. C) mappa Entità dell'attività neuronale si propaga lungo corteccia somatosensoriale in risposta alla stimolazione vibrissa ad una frequenza di 0,05 Hz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig4highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig5highres.jpg" width="600"> Figura 5. Esempio di whole-cell patch-clamp registrazione nella corteccia di un mouse sveglio spostamento in homecage mobile. A) di registrazione corrente-clamp da un neurone nello strato corticale del mouse 2/3. 0,5 sec, iniezione di corrente da 100 pA (di seguito indicato la traccia), si traduce in uno scoppio di potenziali d'azione. La cella ha mostrato adattamento frequenza caratteristica spike per i neuroni piramidali. B) Continuo registrazione corrente-clampdal medesimo neurone correlata con l'attività del mouse 'locomotoria (mostrato in rosa sopra la traccia). Attività spontanea Rappresentante dello strato di 2/3 dei neuroni durante i periodi di mouse del riposo (C) e in esecuzione (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig5highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig6highres.jpg" width="600"> Figura 6. Perdita di peso degli animali e dell'attività locomotoria nei topi head-fixed/non-fixed durante le sessioni di formazione in homecage mobile. A) il peso degli animali (media + SD,%) prima di allenamenti. Si noti che la perdita di peso è completamente annullata dalla 7-8 ° allenamento. B) traiettoria del mouse locomozione orizzontale rispetto al homecage mobile,che è stato estrapolato dal movimento tracciato della homecage mobile durante 8 ª sessione di formazione. C) i movimenti cingolati di un mouse non-head-fisso esplorare la gabbia rotonda durante l'8 ª sessione di formazione. D) Durata della testa fissa (cerchio) e non fisso (triangolo) il movimento topi durante 1-4 ° giorno di allenamento (media + SD,%). Si noti che, il giorno 4, i topi testa-fisso non presentano né congelamento (come il giorno 1), né un eccesso di attività locomotoria. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig6highres.jpg" target="_blank">cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Questo metodo crea un ambiente familiare tangibile per il mouse per navigare ed esplorare durante microscopiche di imaging o unicellulari registrazioni elettrofisiologiche, che richiedono ferma fissazione della testa dell&#39;animale.

Appartamento con pavimento Platform aria sollevata: Un nuovo metodo per la combinazione di Comportamento con microscopia o Elettrofisiologia su Awake liberi di muoversi Roditori

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a ...

Ciao, sono Hel Lin, una studentessa post-laurea presso il Near Science Center, università di Helsinki. Oggi io e i miei colleghi vi mostreremo come eseguire registrazioni ottiche ed elettrofisiologiche in animali svegli con la testa, ma per il resto in movimento libero e comportarsi in modo libero. Il nostro metodo crea un ambiente tangibile e familiare in cui il mouse può navigare ed esplorare.Durante l'imaging microscopico o le registrazioni elettrofisiologiche di singole cellule, che richiedono una fissazione salda della testa dell'animale, impiantamo una finestra cranica cronica e abituiamo il topo a una gabbia per case mobili trasportata in aereo, che scivola sotto i piedi dell'animale. Durante la locomozione su una superficie piana, la gabbia della casa mobile può essere posizionata sotto un microscopio verticale standard per l'imaging a due fotoni o inserita in una configurazione elettrofisiologica per le registrazioni di patch clamp nel cervello di un topo sveglio. Tutte le procedure sperimentali qui presentate sono state approvate dal comitato etico locale.Impiantamo finestre craniche secondo i protocolli pubblicati con piccole modifiche al momento dell'impianto della finestra cranica. L'animale viene lasciato riprendersi per almeno due o tre settimane durante questo periodo di recupero, la finestra normalmente riacquista la sua trasparenza. Sono esclusi dagli esperimenti gli animali con segni di infiammazione residua post operatoria.Addestrare gli animali selezionati per uno studio ad abituarli alla fissazione della testa. Nella gabbia della casa mobile, maneggia il mouse con calma per cinque-10 minuti, evitando movimenti bruschi e rumori, quindi rimettilo nella gabbia di casa. Ripetere la procedura due o tre volte a intervalli disuguali.La gabbia per case mobili consente il fissaggio della testa senza anestetizzare l'animale prima del fissaggio della testa. Usa uno straccio per avvolgere il mouse due o tre volte a intervalli disuguali. Assicurati che l'animale rimanga calmo mentre è avvolto.In caso contrario, ripetere la procedura fino a quando il mouse non si è completamente abituato. Iniziare l'addestramento due volte al giorno dei topi sulla gabbia della casa mobile il giorno successivo al completamento della manipolazione. Pesare gli animali prima di ogni sessione di addestramento.Gli animali che mostrano una perdita di peso superiore al 10% dovrebbero essere esclusi dallo studio. Regolare la posizione del braccio di fissaggio della testa in modo che corrisponda alle dimensioni dell'animale addestrato. Collegare la presa d'aria del dispositivo gabbia per case mobili all'uscita dell'aria pressurizzata standard da laboratorio.Assicurarsi che la pressione dell'aria sia sufficiente per il libero galleggiamento della gabbia domestica trasportata per via aerea. Inizia l'addestramento degli animali abituati nella gabbia della casa mobile. Immobilizza il topo avvolgendolo nello straccio.Inserire il supporto metallico fissato alla testa dell'animale nel braccio di fissaggio della testa e fissarlo saldamente serrando le viti. Attiva il flusso d'aria per far levitare la gabbia domestica trasportata in aria. Rimuovi lo straccio e lascia che il topo esplori la gabbia di casa.Durante la prima sessione di addestramento, i topi possono mostrare un comportamento di congelamento e tremore e l'erezione della coda. Per abituare l'animale al rumore, fornire un'esposizione costante ai suoni ambientali utilizzando, ad esempio, una traduzione radio o musica e voce registrate durante tutte le sessioni di addestramento e durante gli esperimenti. Per evitare lo stress cronico, utilizzare un'illuminazione a luce intensa durante la prima ora della sessione di allenamento.Dopo la prima ora, conduci l'addestramento al buio e usa una telecamera a infrarossi per monitorare il comportamento dell'animale. Al termine della sessione di addestramento, liberare l'animale dal braccio di fissaggio della testa perdendo le viti. Rimetti l'animale nella gabbia di casa per almeno due ore prima della sessione di addestramento successiva.Tenere il mouse in una gabbia con due o più altri topi ridurrà il livello di stress. Opzionalmente, è possibile posizionare la gabbia trasportata ad aria insieme all'animale nella sua gabbia di casa. Questo arricchirà l'ambiente e potrebbe rafforzare l'abitazione dell'animale nella gabbia della casa mobile.Durante l'ultima sessione di allenamento, i topi sono abituati alla fissazione della testa e dovrebbero mostrare un comportamento senza stress navigando con calma intorno alla gabbia domestica trasportata per via aerea. In assenza di luce visibile, la traiettoria della locomozione del mouse può essere tracciata monitorando i movimenti della gabbia con una telecamera nel vicino infrarosso o con un mouse ottico del computer. Durante le sessioni di allenamento prolungate che durano più di una o due ore, prendere in considerazione la possibilità di fornire al topo acqua potabile, manualmente o utilizzando un portapipetta attaccato al telaio della gabbia della casa mobile.Il diagramma seguente riassume la sequenza temporale di un tipico studio sperimentale. Lo studio inizia con l'impianto della finestra cranica due settimane prima della manipolazione del topo e continua con otto sessioni di allenamento due volte al giorno. Lo studio tipico include una serie di sessioni di imaging o sessioni di registrazione con patch clamp distanziate tra poche ore e diversi giorni o settimane.Sia gli esperimenti ottici che quelli elettrofisiologici possono essere eseguiti in parallelo con stimoli cognitivi o comportamentali e letture. La microscopia a due fotoni è un'esclusiva tecnologia ottica non lineare che consente la visualizzazione in tempo reale di strutture cellulari e persino subcellulari negli strati corticali profondi del cervello di un roditore. Per eseguire un esperimento di imaging al microscopio a due fotoni, posizionare un animale addestrato nella gabbia della casa mobile, regolare i tappi per proteggere l'ottica del microscopio da danni accidentali.Pulire il vetro di copertura della finestra cranica per rimuovere le particelle di polvere. Far cadere un liquido di immersione sul vetro di copertura. Si consiglia di utilizzare la soluzione di viscere perché l'acqua evapora rapidamente.La piattaforma può essere posizionata sopra un tipico tavolo ottico motorizzato utilizzando la modalità ad ampio campo del microscopio a fluorescenza e un filtro di emissione a passaggio lungo. Valuta la vascolarizzazione cerebrale e seleziona una regione di interesse. Per visualizzare la vascolarizzazione corticale iniettare nella vena caudale di un animale fissato e immobilizzato la testa, un 70 chilo Dalton, Texas rosso coniugato testo Tran.Questa sequenza di immagini mostra una registrazione time-lapse di luoghi e arterie nella corteccia di un topo che si comporta mentre naviga intorno alla gabbia della casa mobile. Tracciando il profilo delle linee tracciate attraverso il lume del vaso, è possibile misurare le variazioni del diametro del vaso e la motilità dei singoli segmenti del vaso. La velocità del flusso sanguigno nelle arterie e nelle vene può essere misurata mediante scansione lineare lungo le linee tracciate parallelamente alla parete del vaso. Bene.I dettagli della morfologia dei neuroni possono essere visualizzati in topi transgenici che esprimono YFP nella sottopopolazione di neuroni sotto il promotore di Taiwan. Questi due Zack confrontano la stabilità dell'imaging tra animali anestetizzati e svegli. Il pannello laterale destro mostra i dendriti dell'animale anestetizzato con una miscela di ketamina xilazina.Mentre il pannello laterale sinistro mostra un'immagine di dendriti in un animale sveglio che cammina intorno alla gabbia di una casa mobile. La morfologia individuale della colonna vertebrale negli animali svegli può essere analizzata con la stessa affidabilità e precisione dei topi anestetizzati. Lo spostamento del cervello durante la corsa degli animali non supera in genere da uno a un micrometro e mezzo.Questi movimenti si verificano in direzione orizzontale e molto raramente provocano uno spostamento del piano di imaging, rendendo superflua la correzione degli artefatti di movimento. Nella maggior parte dei casi, la capacità di monitorare cronicamente l'attività neuronale nel cervello vivente sveglio è essenziale per comprendere l'organizzazione e la funzione del sistema nervoso. Utilizzando i tre topi transgenici tie one G Camp, immaginiamo l'attività neuronale spontanea nei topi svegli che si comportano nella gabbia della casa mobile.Questa sequenza di immagini in time lapse mostra esempi rappresentativi di picchi di calcio nei corpi cellulari neuronali, niti e assoni. L'imaging ottico basato su segnali intrinseci consente di mappare la distribuzione spaziale dei domini funzionali per eseguire un esperimento di imaging ottico intrinseco. Posizionare l'animale addestrato nella gabbia domestica posizionata sotto l'obiettivo della telecamera.Pulire il vetro di copertura dalla polvere. Metti una goccia di glicerolo e coprilo con un vetrino coprioggetti rotondo da cinque millimetri. Regola la posizione di una telecamera ad alta velocità.Posizionare un manipolatore con un tubo di soffiaggio dell'aria opposto alla vibrazione controlaterale. Usa le luci verdi per visualizzare la mappa della nave. Focalizza più in profondità nella corteccia, circa 400 micrometri sotto i vasi corticali.Posiziona un filtro passa-banda davanti alla fotocamera e illumina la corteccia con una luce rossa. Lasciare che il mouse si adotti alla piattaforma per almeno 30 minuti. Registra l'attività di base durante un episodio di sei minuti.Stimolare la vibrazione ogni 10 secondi con sbuffi d'aria per un periodo totale di sei minuti. Questa immagine illustra l'attività neurale che si propaga lungo la corteccia somatosensoriale in risposta alla stimolazione con vibrazione alla frequenza di 0,05 hertz. Per eseguire registrazioni elettrofisiologiche su singola cellula, posizionare l'animale addestrato impiantato con una finestra cranica rovesciata nella gabbia della casa mobile.Lentamente e con attenzione, rimuovere il vetro di copertura dal supporto metallico. Rinfrescare il tampone corticale e pulire la finestra cranica dai detriti con un tampone emostatico. Posizionare l'elettrodo di terra nel tampone corticale.Riempire la pipetta patch clamp con soluzione intracellulare. Applicare una pressione positiva alla pipetta di registrazione utilizzando un micromanipolatore motorizzato, approfondire la pipetta nella corteccia e ottenere un contatto di tenuta giga con la cellula di interesse. Dopo la registrazione, rimuovere la pipetta, rinfrescare il tampone corticale e chiudere la finestra cranica con la colla in un vetro di copertura al supporto metallico.L'uso di una gabbia domestica trasportata per via aerea consente di combinare l'imaging e l'elettrofisiologia con paradigmi comportamentali classici come l'apprendimento, la riabilitazione o il comportamento correlato all'ansia. L'olfatto è un importante input sensoriale per i topi e può essere utilizzato per la stimolazione nei test di memoria e per la valutazione della reazione alla novità. Per eseguire un test di assuefazione disaolfattiva, posizionare l'animale addestrato nella gabbia della casa mobile e lasciarlo adottare.Per 30 minuti, attacca un pezzo di cotone pulito imbevuto di acqua di rubinetto alla parete interna della gabbia della casa mobile utilizzando un nastro biadesivo. Dopo cinque minuti, sostituisci il cotone pulito sulla parete della gabbia domestica con uno nuovo imbevuto di un liquido contenente l'odore di vaniglia. Ripeti le esposizioni di cinque minuti all'odore di vaniglia tre volte con intervalli di cinque minuti tra le sessioni.Per misurare il livello di interesse all'odore. Conta il tempo cumulativo che l'animale trascorre rivolto verso la zona bersaglio e il tempo totale di movimento della gabbia della casa mobile. Durante l'ultima quinta sessione, presenta un odore socialmente significativo.Inumidisci il nuovo applicatore di cotone con alcune gocce di urina di topi del sesso opposto. Per valutare la reazione alla novità, dividere la gabbia della casa mobile in quattro zone. Attacca due pezzi di cotone uno di fronte all'altro. Colore.Codificarli con pennarelli sul lato esterno delle pareti della gabbia domestica durante la prima prova. Metti due pezzi di cotone puliti. Quindi sostituirli entrambi con del cotone imbevuto di un estratto all'1% di vaniglia.Durante la terza prova, metti il cotone alla vaniglia nella zona numero uno e il pezzo di cotone imbevuto di un estratto di banana all'1% nella zona. Numero due, per misurare la preferenza per l'assenza di odore. Calcola il tempo che gli animali trascorrono affrontando l'assenza di odore come percentuale del tempo cumulativo rivolto verso altre zone.Ciao, sono Leo Kiro, ricercatore principale presso il Neuroscience Center University di Helsinki. Spero che ti sia piaciuto guardare il video e che lo abbia trovato utile. Abbiamo lavorato con twofold sulla microscopia in vivo negli ultimi cinque anni, e l'uso della medicina generale ed estetica è sempre stata una grande preoccupazione perché l'estetica interferisce con la funzione cerebrale, con il flusso sanguigno e tutto il resto.E oggi sono felice che possiamo lavorare su animali svegli ed eseguire esperimenti di imaging microscopico stabile e convalidare e verificare i risultati che avevamo precedentemente ottenuto negli animali anestetizzati. Sono sicuro che l'uso delle gabbie per case mobili e i metodi che abbiamo presentato oggi aumenteranno la rilevanza della ricerca in vivo in generale e porteranno a risultati nuovi e rivoluzionari, e non vedo l'ora di farlo.

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La procedura è descritta per manipolare l'attività dei neuroni cerebrali corticali piramidali optogenetically mentre l'elettroencefalogramma, elettromiogramma, e cerebrale concentrazione di lattato sono monitorati. Registrazioni sperimentali vengono eseguite su cavo-frenati topi, mentre subiscono spontanee sonno / veglia cicli. Optogenetic apparecchiatura è assemblata nel nostro laboratorio, apparecchi registrazione è commercialmente disponibile.

Elettroencefalografia simultanea, in tempo reale misura della concentrazione di lattato e la manipolazione Optogenetic di attività neuronale nella corteccia cerebrale Rodentia

Questo protocollo descrive la progettazione e l'impianto chirurgico di un meccanismo di contenimento della testa per monitorare l'attività neuronale nelle strutture cerebrali sub-corticali nei ratti allertati.  Delinea le procedure per isolare i singoli neuroni nella configurazione juxtacellulare e per identificare in modo efficiente le loro posizioni anatomiche.

Monitoraggio Juxtacellular e localizzazione dei singoli neuroni nelle strutture cerebrali Sub-corticali di Alert, Rats Testa-trattenuto

Vengono fornite istruzioni per la costruzione a basso costo e l'impianto chirurgico di un montaggio elettroencefalografico cronico transcranico ad alta densità nei topi. Vengono inoltre descritte le tecniche di registrazione, estrazione ed elaborazione dei segnali.

Ad alta densità elettroencefalografico Acquisizione in un modello di roditore Utilizzando risorse a basso costo e open-source

Qui esempiamo una procedura per l'esecuzione di immagini su larga scala Ca 2+ con risoluzione cellulare su più strati corticali in topi liberamente spostati. Centinaia di cellule attive possono essere osservate simultaneamente utilizzando un microscopio a testa in miniatura accoppiato con una sonda a prisma implantato.

Corticale multistrato Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging nei mouse con movimento libero con sonde a prisma e microscopia a fluorescenza miniaturizzata

Una connessione wireless, sistema bidirezionale per registrazioni neurale multicanale e stimolazione a comportarsi liberamente ratti è stato introdotto. Il sistema è leggero e compatto, avendo così un impatto minimo sul repertorio del comportamento umano. Inoltre, questo sistema bidirezionale fornisce un sofisticato strumento per valutare le relazioni causali tra pattern di attivazione del cervello e comportamento.

Una connessione Wireless, interfaccia bidirezionale per registrazione In Vivo e la stimolazione dell'attività neurale a comportarsi liberamente ratti

Il protocollo qui presentato fornisce informazioni sull'elettroencefalografia simultanea (EEG) e sulla valutazione comportamentale in tempo reale. Abbiamo discusso tutti i passaggi coinvolti in questo protocollo come soluzione attraente per i ricercatori in molti campi delle neuroscienze, in particolare nelle aree di apprendimento e memoria.

Monitoraggio simultaneo dell'elettrofisiologia wireless e del test comportamentale della memoria come strumento per studiare la neurogenesi ippocampale

Qui viene presentato un protocollo per l'impianto di una finestra cranica cronica per l'imaging longitudinale delle cellule cerebrali in topi svegli e trattenuti dalla testa.

Impianto di una finestra cranica per l'imaging ripetuto in vivo in topi svegli

Abbiamo sviluppato un'unica piattaforma per tracciare il comportamento degli animali durante due attività di apprendimento associativo dipendenti dalla fibra di arrampicata. Il design a basso costo consente l'integrazione con esperimenti optogenetici o di imaging diretti verso l'arrampicata dell'attività cerebellare associata alle fibre.

Una piattaforma flessibile per il monitoraggio dell'apprendimento associativo sensoriale dipendente dal cervelletto

Viene descritta una nuova procedura dettagliata per l'imaging funzionale di ratti svegli e fissati con la testa.

Protesi alla testa per il neuroimaging di ratti svegli e fissati con la testa

Il protocollo descrive la metodologia di registrazione extracellulare nella corteccia motoria (MC) per rivelare le proprietà elettrofisiologiche extracellulari in topi coscienti che si muovono liberamente, nonché l'analisi dei dati dei potenziali di campo locale (LFP) e dei picchi, utile per valutare l'attività neurale della rete alla base dei comportamenti di interesse.

Registrazione extracellulare multicanale in topi che si muovono liberamente

Qui presentiamo un sistema di impianto di sonde leggero ed economico per l'elettrofisiologia cronica nei roditori, ottimizzato per la facilità d'uso, il recupero della sonda, la versatilità sperimentale e la compatibilità con il comportamento.

L'impianto DREAM: un sistema implantare leggero, modulare ed economico per l'elettrofisiologia cronica in topi con testa fissa e a comportamento libero

Scopri come eseguire registrazioni ottiche ed elettrofisiologiche in topi svegli e liberi di muoversi utilizzando una gabbia domestica mobile sollevata ad aria. Questo metodo riduce lo stress e migliora la qualità dei dati.

Appartamento con pavimento Platform aria sollevata: Un nuovo metodo per la combinazione di Comportamento con microscopia o Elettrofisiologia su Awake liberi di muoversi Roditori (Video) | JoVE Journal

Appartamento con pavimento Platform aria sollevata: Un nuovo metodo per la combinazione di Comportamento con microscopia o Elettrofisiologia su Awake liberi di muoversi Roditori

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