In vitro Sintesi di mRNA modificata per l'induzione di espressione della proteina nelle cellule umane

L'obiettivo generale di questa procedura è la sintesi in vitro di mRNA modificato per l'induzione dell'espressione proteica nelle cellule. Ciò si ottiene amplificando prima l'inserto plasmidico o la sequenza di DNA codificante e aggiungendo una coda di poli T di 120 timidina utilizzando la reazione a catena della polimerasi. Il secondo passo è la trascrizione in vitro del DNA generato in mRNA con code di poliadenina.

Successivamente, il DNA stampo viene rimosso mediante il trattamento di D'S della miscela di reazioni di trascrizione in vitro. La fase finale è il trattamento con fosfatasi antartica dell'mRNA prodotto per rimuovere cinque fosfati primari. In definitiva, le cellule vengono trasfettate dall'mRNA generato, complessi lipidici.

La microscopia a fluorescenza e l'analisi della citometria a flusso vengono utilizzate per mostrare la sintesi di GFP potenziata nelle cellule. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il transfetto virale, è la mancanza di integrazione nel genoma della cellula ospite, che previene il rischio di oncogenesi. Questo metodo può aiutare a produrre proteine mancanti o difettose nelle cellule e può essere utilizzato per il trattamento vaccinale delle malattie genetiche.

E nel campo della medicina rigenerativa, a dimostrare la procedura sarà Steinle, uno studente laureato del mio laboratorio. Prima dell'inizio di questa procedura, i plasmidi contenenti le sequenze di DNA codificanti o CDS richieste sono stati amplificati in e coli e isolati come descritto nel testo del protocollo. In questo esempio, il CDS di interesse è la proteina fluorescente verde potenziata o EGFP per amplificare e aggiungere simultaneamente un dettaglio poli al CDS di EGFP.

Preparare una miscela PCR come descritto nel testo del protocollo. Posizionare la provetta per PCR in un termociclatore ed eseguire il protocollo di ciclo PCR descritto nel testo del protocollo. Al termine della reazione PCR, pulire la reazione PCR utilizzando un kit di purificazione PCR disponibile in commercio e diluire il DNA utilizzando 20 microlitri di acqua priva di nucleasi.

Per verificare la qualità del prodotto PCR, eseguire l'elettroforesi su gel di DNA e visualizzare le bande di DNA su un sistema di imaging. Durante la trascrizione in vitro o IVT dovrebbe essere rilevata una chiara banda di DNA con una lunghezza di circa 1.100 paia di basi. Il DNA generato in precedenza sarà trascritto in mRNA.

Preparare la miscela analogica del cappuccio NTP come mostrato qui. Mescolare accuratamente la miscela analogica del tappo NTP mediante vortex. Quindi farla girare Assemblare brevemente la miscela di reazione IVT come descritto in questa tabella.

Miscelare accuratamente la miscela di reazione IVT pipettandola delicatamente su e giù. Quindi centrifugare brevemente la provetta per PCR per raccogliere la miscela sul fondo della provetta. Incubare la miscela di reazione IVT a 37 gradi Celsius per tre ore in un termomiscelatore.

Dopo tre ore, rimuovere il DNA stampo aggiungendo un microlitro di DNA alla miscela di reazione IVT. Mescolando bene e incubando a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Purificare la miscela di reazione utilizzando un kit di purificazione dell'RNA e diluire due volte il MR NA modificato dalla membrana della colonna di rotazione con 40 microlitri di acqua priva di nucleasi, l'mRNA modificato generato dall'IVT deve essere trattato con fosfatasi per rimuovere cinque trifosfati primari, che possono portare all'attivazione immunitaria.

Per iniziare questa procedura, aggiungere nove microlitri di 10 tampone di reazione alla fosfatasi antartica a 79 microlitri di una soluzione di mRNA purificata. Successivamente, aggiungere due microlitri di fosfatasi antartica e mescolare delicatamente il campione. Incubare la miscela a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Dopo 30 minuti, purificare la miscela di reazione utilizzando un kit di purificazione dell'RNA e diluire due volte l'mRNA modificato dalla membrana della colonna di spin con 50 microlitri di acqua priva di nucleasi. Dopo aver misurato la concentrazione dell'mRNA modificato, regolare la concentrazione a 100 nanogrammi per microlitro aggiungendo acqua priva di nucleasi. Controlla la qualità dell'mRNA modificato sintetizzato mediante elettroforesi su gel di RNA e visualizza i divieti di ladder e mRNA su un illuminatore trans UV.

Dovrebbe essere rilevata una banda di mRNA chiara con una lunghezza di circa 1.100 paia di basi. Preparare le cellule HEC 2 9 3 per la trasfezione con l'mRNA modificato sintetizzato mediante placcatura due volte. Centrare le cinque cellule per pozzetto di una piastra a 12 pozzetti incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius in un incubatore cellulare Il giorno successivo, la cellula dovrebbe aver raggiunto l'80-90% di confluenza.

Generare il plesso lipo per la trasfezione. Preparare una quantità sufficiente di miscela di trasfezione per la trasfettazione di tutti i pozzetti: ogni pozzetto di una piastra a 12 pozzetti richiede 2,5 microgrammi di mRNA modificato, due microlitri di reagente di trasfezione lipidica e 473 microlitri di opt one. Ridurre il terreno sierico.

Miscelare delicatamente i componenti mediante pipettaggio come controllo negativo. Preparare una miscela di trasfezione senza Mr.NA, incubare le miscele di trasfezione a temperatura ambiente per 20 minuti per generare lipo plex. Per la trasfezione.

Lavare le celle con 500 microlitri di DPBS per. Aggiungere 500 microlitri di miscela di trasfezione a ciascun pozzetto della piastra a 12 pozzetti, incubare le cellule per quattro ore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica dopo quattro ore, aspirare la miscela di trasfezione e aggiungere un millilitro di coltura cellulare completa. Medio alle cellule in ogni pozzetto.

Incubare le cellule per 24 ore nell'incubatore cellulare. Successivamente eseguire l'analisi microscopica a fluorescenza delle cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza per preparare le cellule alla citometria a flusso. Rimuovere il terreno di coltura cellulare dai pozzetti e lavare ogni pozzetto con uno dei DPBS senza calcio e magnesio.

Aggiungere 500 microlitri di TRIPSIN EDTA per pozzetto per staccare le cellule dalla superficie delle piastre di coltura cellulare. Successivamente, aggiungere 500 microlitri di soluzione neutralizzante della tripsina per pozzetto per centrifugare la tryin inactivate le cellule staccate per cinque minuti a 300 volte G di temperatura ambiente. Dopo aver rimosso il supinato di Reese, sospendere il palato cellulare in 150 microlitri di soluzione di fissazione cellulare e trasferire la sospensione cellulare in una provetta per citometria a flusso.

Analizzare la percentuale di cellule che esprimono EGFP e l'intensità della fluorescenza utilizzando la media geometrica dell'intensità della fluorescenza. L'espressione proteica nel tempo è valutata anche mediante analisi di citometria a flusso delle cellule che esprimono EGFP a uno, due e tre giorni dopo la trasfezione come descritto nel testo del protocollo, la funzionalità dell'mRNA EGFP generato è stata testata mediante trasfezione di cellule HEC 2 9 3. La produzione di EGFP nelle cellule è stata rilevata 24 ore dopo la trasfezione utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Qui, un'immagine di contrasto facciale delle cellule è mostrata accanto a un'immagine a fluorescenza delle cellule. L'espressione di EGFP nelle cellule è stata rilevata anche mediante citometria a flusso 24 ore dopo la trasfezione. La linea rosa rappresenta le cellule senza mRNA, trasfezione e la linea blu rappresenta le cellule EGFP positive.

Dopo la trasfezione dell'mRNA di EGFP, il 93,91% di tutte le cellule misurate era positivo e la media geometrica dell'intensità della fluorescenza era di 720,16. La durata dell'espressione proteica nelle cellule HC 2 93 è stata valutata misurando l'espressione di EGFP uno, due e tre giorni dopo l'mRNA. L'espressione della proteina di trasfezione era più alta nelle cellule 24 ore dopo la trasfezione.

La quantità è stata ridotta di 1,6 volte ogni giorno successivo, ma anche dopo tre giorni, le cellule contenevano EGFP una volta padroneggiato. Questa tecnica può essere eseguita in due giorni se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come produrre MRNA modificato stabilizzato per l'induzione dell'espressione proteica desiderata nelle cellule.