High Yield Espressione di proteine ​​ricombinanti umane con il Transient Trasfezione delle cellule HEK293 in sospensione

La produzione su scala di laboratorio di proteine eucariotiche con appropriate modifiche post-traduzionali rappresenta un ostacolo significativo. Ecco un protocollo robusto con rapida instaurazione e inversione di tendenza per l'espressione proteica utilizzando un sistema di espressione nei mammiferi. Questo sistema supporta la selettività degli amminoacidi, la marcatura selettiva delle proteine e i modulatori di piccole molecole della composizione dei glicani.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di esprimere glicoproteine di mammifero con un'appropriata glicosilazione dei mammiferi indirizzando le proteine ricombinanti alla via secretoria mediata da ER e GOGI. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in immunologia, come ad esempio qual è il ruolo di una specifica, i modelli nella struttura e il potenziale di attivazione immunitaria degli anticorpi e dei frammenti di anticorpi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza cellule umane per esprimere proteine umane, il che fornisce il missionario cellulare appropriato per ripiegare e modificare correttamente le proteine bersaglio.

L'agitatore dell'incubatore per l'insediamento delle cellule deve essere azionato a 135 giri/min, 80% di umidità, 8% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius almeno un'ora prima dell'inoculazione della coltura. Accendere la lampada UV della cabina di biosicurezza, preriscaldare le bottiglie sigillate del mezzo A e del mezzo B in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Spegni le luci UV e sterilizza la cabina di biosicurezza con una soluzione di etanolo al 70% e acqua.

Sterilizzare un pallone di crescita erlenmeyer da 125 millilitri con pipette con tappo ventilato, pipettatori e flaconi di terreno di preriscaldamento spruzzando con una soluzione acquosa al 70% di etanolo. Posizionare questi elementi nella cabina di biosicurezza durante questa procedura. Tutti gli articoli devono essere sterilizzati in questo modo prima di essere portati nella cabina di biosicurezza.

Preparare il terreno di coltura fresco per una coltura da 30 millilitri prelevando 26 millilitri di terreno A e tre millilitri di terreno B e trasferendoli nel pallone di erlenmeyer da 125 millilitri. Mescolare agitando delicatamente, scaldando, una fiala di cellule HEK 2 93 F precedentemente congelate a meno 80 gradi Celsius in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per scongelare parzialmente le cellule. Questo richiede circa un minuto e le cellule non devono essere completamente scongelate.

Quindi, sterilizzare l'esterno della fiala con la soluzione acquosa di etanolo al 70% e spostarla nella cappa di biosicurezza. Utilizzando una pipetta da un millilitro, prelevare la sospensione cellulare e trasferirla nel pallone di erlenmeyer da 125 millilitri contenente 29 millilitri di terreno di coltura fresco. Chiudere il coperchio del pallone di coltura e posizionare il pallone nell'agitatore dell'incubatrice per 24 ore.

24 ore dopo l'inoculazione della coltura. Controllare la densità cellulare, sterilizzare il pallone di coltura con la soluzione di etanolo al 70% e acqua e spostarlo nella cappa di biosicurezza. Utilizzando una pipetta da un millilitro e un pipettatore, prelevare lentamente 100 microlitri di coltura e trasferirli in una provetta sterile da 0,5 millilitri.

Chiudere il coperchio del pallone di coltura e rimetterlo nell'agitatore dell'incubatrice il prima possibile. Mescolare 7,5 microlitri di una soluzione di trian blue con 7,5 microlitri di cellule. Mescolare energicamente e poi trasferire 7,5 microlitri di miscela in un vetrino contatore.

Accendere il contacelle automatico e posizionare il vetrino di conteggio nella camera di caricamento. Il lettore automatico viene attivato e le cellule vengono contate automaticamente in unità di numero di cellule per millilitro e percentuale di vitalità. Determinare il volume della coltura del donatore necessario per il trasferimento in un terreno di coltura fresco per ottenere una densità cellulare di 300.000 cellule vive per millilitro.

Preparare il terreno di coltura fresco come mostrato in precedenza trasferendo 23 millilitri di terreno A e tre millilitri di terreno B in un pallone di coltura fresco da 125 millilitri. Successivamente, rimuovere i flaconi di riserva del terreno A e del mezzo B dalla cabina di biosicurezza per ridurre il rischio di contaminazione. Recuperare il pallone per colture cellulari HEK 2 93 F dall'incubatore.

Spruzzarlo con la soluzione di etanolo al 70% e acqua e metterlo nella cabina di biosicurezza utilizzando una nuova pipetta. Prelevare l'aliquota corretta di cellule dalla coltura e trasferirla nel matraccio contenente la coltura fresca. Medio. Trasferire entrambe le colture dalla cabina di biosicurezza all'agitatore dell'incubatore.

Far crescere le cellule fino a una densità approssimativa di 2-3 milioni di cellule vive per millilitro prima della trasfezione. Controllare la densità cellulare come dimostrato in precedenza e determinare la quantità di cellule per la trasfezione. Utilizzando una pipetta sierologica sterile.

Trasferire il volume appropriato di sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 250 millilitri. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 100 volte G per cinque minuti. Dopo la sterilizzazione, trasferire la provetta contenente le cellule pellettate nella cappa di biosicurezza.

Utilizzare una pipetta sterile per decantare il surnatante costituito da quello consumato. Il terreno di coltura riinvia energicamente le cellule pellettate pipettando su e giù utilizzando 10 millilitri di terreno di coltura fresco e trasferiscono in un pallone preparato contenente coltura di trasfezione fresca. Medio. Avvitare il tappo del pallone di coltura cellulare ventilato e incubare il pallone nell'agitatore dell'incubatore per 15 minuti - un'ora mentre le cellule sono in incubazione.

Diluire le scorte plasmatiche di DNA e POLIETERAMMINA o PEI utilizzando un terreno di coltura fresco fino a una concentrazione finale di 0,5 microgrammi per microlitro. Rimuovere il pallone di coltura con le cellule disperse dall'agitatore dell'incubatore e portarlo nella cabina di biosicurezza utilizzando una micropipetta e 300 microlitri di DNA plasmatico nella coltura e mescolare con una delicata agitazione manuale a 900 microlitri di PEI nella coltura e mescolare di nuovo. Quindi a 3,8 millilitri di terreno di coltura fresco.

Trasferire il pallone nell'agitatore dell'incubatrice per 24 ore. 24 ore dopo la trasfezione, la coltura cellulare deve essere diluita. Per preparare prima il terreno di diluizione, utilizzare una pipetta sierologica sterile da un millilitro per prelevare un millilitro di acido valproico PREWARM 220 millimolare o VPA e trasferirlo in una provetta sterile da 50 millilitri.

Quindi, utilizzare una pipetta sierologica sterile per aggiungere cinque millilitri di terreno di preriscaldamento B e 44 millilitri di terreno di preriscaldamento A alla soluzione di VPA. Ciò si traduce in 50 millilitri di terreno di coltura fresco con una concentrazione finale di 4,4 millimolari di VPA. Recuperare la coltura trasfettata dall'incubatore.

Sterilizzare l'esterno del pallone e posizionare il pallone nell'armadio di biosicurezza. Aggiungere il terreno di diluizione preparato alla coltura. Trasferire nuovamente il pallone nell'agitatore dell'incubatrice per altri quattro o cinque giorni dopo la trasfezione.

Monitorare quotidianamente la vitalità cellulare con la procedura dimostrata in precedenza. Le aliquote devono anche essere conservate ogni giorno per l'analisi dell'espressione proteica, da cinque a sei giorni dopo la trasfezione o se la vitalità cellulare scende al di sotto del 50%Raccogliere le cellule centrifugando le cellule più il terreno a 1000 volte G per cinque minuti. Raccogli il surnatante che conterrà le proteine secrete a cinque millilitri di una soluzione di candeggina al 10% nel pellet di cellule HEK e scartalo come rischio biologico.

Successivamente, le proteine vengono purificate dal surnatante raccolto. Questo sistema di espressione ha generato un'elevata resa di proteine glicosilate illustrata da questo tipico pattern di espressione di IgG un fc dopo la trasfezione transitoria di cellule HK 2 93 F. La purificazione per affinità utilizzando una colonna proteica per IgG una FC o una colonna di nichel per istamina marcata GFP con il recettore gamma FC tre A ha portato a proteine con elevata purezza.

Questo sistema esprime in modo efficiente IgG arricchito isotopicamente una FC in questo spettro NMR bidimensionale che correla la frequenza di risonanza dei nuclei di idrogeno e l'ammide azoto direttamente legato. Sono stati osservati segnali ben dispersi in 15 atomi. Diverse forme di glico sono state prodotte con cellule HEK 2 93 F e HEK 2 93 s in diverse condizioni di coltura, come dimostrato dalle analisi di spettrometria di massa a ionizzazione di DESORBIMENTO laser assistita da matrice.

IgG uno FC espresso da cellule HEK 2 93 s, ospitate e glicani che erano di una forma con cinque anos più due residui di N acetil glucosamina che non contenevano glicani di glucosio FU da HEK 2 93 F erano forme complesse di itinerario di tipo bi con glucosio FU centrale e per lo più aventi N terminale acetil glucosamina o una piccola percentuale di forme mono o dilatate. L'aggiunta di un inibitore della glicanografia a un'espressione condotta utilizzando cellule HEK 2 93 F ha mostrato una riduzione superiore al 90% dell'incorporazione di fuco. Una volta padroneggiata, la determinazione della trasfezione transitoria può essere completata in 1,5 ore il primo giorno e in 15 minuti il secondo giorno. Dopo un periodo di espressione da quattro a sei giorni, la soluzione contenente la proteina può essere raccolta in 15 minuti.

Infine, la purificazione della proteina richiederà circa 1,5 ore durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere una coltura stabile prima della trasfezione, di trasfettare le cellule in crescita attiva e di aggiungere il DNA prima di aggiungere il PEI. Seguendo questa procedura. Altri metodi, come la caratterizzazione funzionale delle proteine, utilizzando una serie di tecniche biofisiche, possono essere eseguiti per sondare la struttura e la funzione della glicoproteina espressa dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia per esplorare la relazione struttura-attività di IgG e glicosilazione in vitro e in vivo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare e purificare le glicoproteine utilizzando la nostra combinazione di cellule K 2 93 F e il vettore PZ N due.