Name: High Yield Espressione di proteine ricombinanti umane con il Transient Trasfezione delle cellule HEK293 in sospensione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Impara a esprimere glicoproteine umane con glicosilazione corretta utilizzando cellule HEK293 in sospensione. Questo metodo consente di studiare la struttura degli anticorpi e il potenziale di attivazione immunitaria in immunologia.

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Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dalle sovvenzioni K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) e P01GM107012 (KWM) dal National Institutes of Health, e da fondi del Roy J. Carver Dipartimento di Biochimica, Biofisica e Biologia Molecolare presso la Iowa State University . Il contenuto di questo lavoro è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale della NIH.

Questo protocollo è sufficiente per l&#39;espressione utilizzando HEK293F o cellule HEK293S. 1. Istituzione cellulare <ol><li> Cultura Inoculazione Nota: Tutte le procedure di coltura di manipolazione devono essere effettuate in una struttura BSL-2 ed ogni articolo portato nel cabinet biosicurezza devono essere sterilizzati a spruzzo con etanolo al 70% in soluzione acquosa. <ol><li> Azionare l&#39;agitatore incubatore a 135 giri al minuto, l&#39;80% di umidità e al 8,0% di CO 2 e 37 ° C. Turn &quot;on&quot; la lampada UV del cabinet biosicurezza, almeno 1 ora prima di lavorare. Preriscaldare le bottiglie sigillate Piano A e Piano B in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Sterilizzare 125 ml palloni crescita Erlenmeyer con tappo ventilato, pipette, pipette, e le bottiglie media preriscaldate a spruzzo con l&#39;etanolo al 70% in soluzione acquosa. Posizionare questi elementi nell&#39;armadio biosicurezza. Nota: Sterilizzare solo la plastica rivestimento esterno 125 ml Erlenmeyer pallone di coltura, e quindi rimuovere solo quando is all&#39;interno dell&#39;armadio biosicurezza. </li><li> Per una cultura 30 ml, prelevare 26 ml di terreno A e 3 mL di terreno B (10% della coltura finale) e trasferire nel pallone 125 ml coltura Erlenmeyer e delicatamente mescolare agitando (qui di seguito definito come terreno di coltura fresco). </li><li> Trasferimento una fiala di cellule contenenti cellule HEK293F, congelati a -80 ° C, sul ghiaccio e passare alla stanza cultura. Nota: cellule HEK293F sono forniti ad una densità di 1 x 10 7 cellule / ml. </li><li> Riscaldare leggermente il flaconcino in bagno d&#39;acqua a 37 ° C per scongelare parzialmente le cellule (ca. un min e cellule non deve essere completamente scongelato). Sterilizzare l&#39;esterno del flaconcino con la etanolo al 70% in soluzione acquosa e spostarlo nel cabinet biosicurezza. </li><li> Utilizzando 1 ml pipetta, ritirare la sospensione cellulare (circa 0,7 ml) e trasferire nella beuta da 125 ml contenente 29 ml di terreno di coltura fresco. Chiudere il coperchio del pallone di coltura e spostarlo nello shaker incubate. </li></ol&gt; </li><li> Manutenzione delle cellule: Controllare densità cellulare, vitalità e Passages cellulari <ol><li> Controllare la densità delle cellule dopo 24 ore di scongelamento della cultura seguendo il protocollo di seguito. Nota: le cellule sono coltivate per 24 ore dopo lo scongelamento per assicurare la crescita delle cellule essenziali e la vitalità di&gt; 80%. </li><li> Sterilizzare il pallone di coltura con etanolo al 70% in soluzione acquosa e spostarla nella biosicurezza. </li><li> Con una pipetta 1 ml e pipetta, ritirare lentamente 100 ml di coltura in sospensione e trasferimento in una sterile ml eppendorf tubo 0.5. Chiudere e trasferire il pallone di coltura di nuovo nel shaker appena possibile. </li><li> Mescolare 7,5 ml di una soluzione Trypan Blue con 7,5 ml di cellule. Mescolare energicamente con 7,5 ml di / miscela blue Trypan cellulare e trasferirlo alla slitta conteggio. </li><li> Accendere il contaglobuli automatico e posizionare il vetrino di conteggio nella camera di caricamento. Il lettore automatico viene attivata e le cellule vengono contate automaticamente nelle unitàdel numero di cellule per ml redditività e cento </li><li> Determinare il volume della coltura donatore richiesta per il trasferimento di un mezzo di coltura fresco ad una densità di cellule 0,3 x 10 6 cellule / ml in diretta. Nota: vedere un esempio di calcolo in materiali supplementari. </li><li> Ripetere i punti 1.1.2 e 1.1.3 del protocollo &quot;1,1 Cultura Inoculazione&quot; di cui sopra per preparare materiali necessari per terreno di coltura fresco. </li><li> Trasferire medio A (23 ml) e medio B (3 ml) ad una beuta da 125 ml di coltura fresco. Rimuovere le boccette di medio A e B Media dal cabinet biosicurezza. Nota: Gli stock di bottiglie di media, non devono essere conservati nell&#39;armadio biosicurezza allo stesso tempo come le cellule HEK 293F. Ciò limita la possibilità di contaminazione delle bottiglie stock medi. </li><li> Rimuovere la coltura cellulare HEK293 dall&#39;incubatore e spruzzo con etanolo al 70% in soluzione acquosa. Usando una nuova pipetta, ritirare l&#39;aliquota di cellule (4 ml, questo volume è stato determinato in funzione to passo 1.2.6) dalla cultura e trasferirlo nel pallone contenente terreno di coltura fresco. </li><li> Trasferire entrambe le culture dal cabinet biosicurezza sul dispositivo agitatore incubatore impostato in base al 1.1.1. Crescere le cellule ad una densità approssimativa di 2-3 x 10 6 cellule / ml in diretta. Nota: Il tempo approssimativo raddoppio delle cellule è di 32 ore. Ci vorranno 3-4 giorni per raggiungere questa densità. Incubare le cellule per 3-4 passaggi di avere stabile modello di crescita delle cellule prima del primo trasfezione. </li></ol></li></ol> 2. Preparare Materiali per Trasfezione <ol><li> Preparazione Cellule HEK293 (1 ° giorno) <ol><li> Cellule sottocolture ad una densità di 1 x 10 6 cellule / ml in acqua dolce Piano B 24 h prima della transfezione secondo punto 1.2. Nota: il volume della coltura trasfezione sarà dipendente dal numero di cellule. Volumi trasfezione più grande (&gt; 20 ml) richiederanno un maggior volume di cultura in questa fase. </li></ol></li><li> Preparazione Stgreggi di Materiali <ol><li> Preparare soluzione stock di polyethylenimine lineare (PEI) ad una concentrazione di 1 mg / ml in un tampone contenente 25 mM 4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic (HEPES) e NaCl 150 mM (pH 7,5). Sciogliere completamente PEI; questo potrebbe richiedere 30-60 minuti a temperatura ambiente. Sterilizzare attraverso 0,22 micron filtro per siringa e conservare a -20 ° C per un uso a lungo termine. </li><li> Preparare sterili DNA plasmidico (come indicato ai punti 2.2.2.1-2.2.2.4). La procedura di costruzione plasmide è descritto altrove 42. Una breve procedura per la preparazione del DNA è spiegato qui: <ol><li> Grow una coltura di cellule di Escherichia coli chimicamente competenti trasformate con il vettore pGEn2 in 1 L di terreno LB (Tryptone- 10 g / L, lievito Estratto di 5 g / L e cloruri di sodio 10 g / L) supplementato con 100 mg / ml ampicillina. E. coli è cresciuto a 37 ° C in un non-umidificato, scuotendo incubatrice. </li><li> Purificare il DNA pGEn2 codifica vettore obiettivo plasmide secondo la manuprotocollo di purificazione del DNA del costruttore. </li><li> Per garantire la completa sterilità del DNA plasmide, effettuare le isopropanolo precipitazioni e risospensione fasi finali delle procedure di estrazione del DNA all&#39;interno dell&#39;armadio biosicurezza. </li><li> Aggiungere il volume di isopropanolo (indicato nel kit miniprep) al DNA eluito e centrifugare a 10.000 x g per 10 min. Sterilizzare l&#39;esterno del contenitore DNA con etanolo al 70% in soluzione di acqua e trasferirla all&#39;interno dell&#39;armadio biosicurezza. Eliminare il surnatante isopropanolo con una pipetta e aria asciugare il pellet di DNA. Una volta asciutto, risospendere il pellet in sterile tampone Tris 10 mM, pH 8,0. </li></ol></li><li> Preparare soluzione stock di 220 valproico mm (VPA) Acido in acqua e sterilizzare in passaggio attraverso un filtro sterile 0,22 micron. Conservare la soluzione a -20 ° C fino all&#39;utilizzo. </li></ol></li></ol> 3. Stabilire una trasfezione transiente <ol><li> Transfection (giorno 0) <ol><li> Controllare la densità cellulare, seguendo i punti 1.2.2 tramite 1.2.5 di &quot;1.2. Manutenzione delle cellule&quot; di cui sopra. Determinare la quantità di cellule per trasfezione (2,5-3,0 x 10 6 cellule / ml in diretta con la vitalità&gt; 95%). Vedere un esempio di calcolo in materiali supplementari. </li><li> Trasferire il volume delle cellule di coltura di sospensione calcolati nel passaggio precedente (qui 67 ml) in una provetta da centrifuga da 250 ml con una pipetta sierologica sterile. Raccogliere le cellule per centrifugazione per 5 min a 100 x g. </li><li> Nel frattempo, preparare un terreno di coltura fresco trasfezione seguente passo 1.1.3 secondo &quot;1.1. Culture inoculazione&quot; di cui sopra. Vedere i materiali di complemento per un esempio di calcolo. Inoltre, il trasferimento 5 ml di terreno di coltura fresco per una provetta sterile da 15 ml e mettere da parte. </li><li> Tubi di trasferimento contenente le cellule pellet nel biosicurezza dopo sterilizzazione all&#39;esterno dei tubi con etanolo al 70% in soluzione acquosa e utilizzare una pipetta sterile per decantare the surnatante costituito da terreno di coltura trascorso. </li><li> Vigorosamente risospendere le cellule pellet pipettando su e giù con 10 ml di terreno di coltura fresco e trasferimento al pallone con terreno di coltura fresco trasfezione (preparato nel passaggio 3.1.3). Avvitare il tappo sul pallone di coltura di cellule ventilati e spostare il pallone incubatore (come indicato in 1.1.1) per 15 minuti-1 ora con agitazione. </li><li> Durante questo tempo, diluire il DNA plasmidico e scorte PEI utilizzando terreno di coltura fresco (utilizzando il volume 5 ml prelevato dal passo 3.1.3) ad una concentrazione finale di 0,5 mg / mL. Vedere i calcoli di esempio in materiali supplementari per determinare la quantità di DNA e PEI. Trasferire il pallone di coltura con le cellule disperse nel cabinet biosicurezza. </li><li> Aggiungere plasmide DNA (300 ml di 0,5 mg / mL) alla cultura utilizzando micro-pipetta e mescolare agitando delicatamente manuale. Aggiungere PEI (900 ml di 0,5 mg / mL) alla cultura, mescolare delicatamente agitando. Aggiungere 3,8 ml di cul frescomedio ture, dal punto 3.1.3, sopra e pallone trasferimento agitatore incubatore per 24 ore. </li><li> Pulire il cabinet biosicurezza in base al punto 1.1. </li></ol></li><li> Diluizione (giorno 1) (Per un volume trasfezione 50 ml) <ol><li> Incubare la cultura transfettate per 24 ore. </li><li> Prelevare 1 ml di preriscaldata 220 mm Acido valproico (VPA, preparato secondo al punto 2.2.3.) Con una sterile da 1 ml pipetta sierologica e trasferirlo in una provetta sterile da 50 ml. </li><li> Prelevare 5,0 ml di preriscaldata medio B e 44 ml di medium A preriscaldata ed aggiungere alla soluzione VPA usando una pipetta sierologica sterile per preparare 50 ml di terreno di coltura fresco con una concentrazione finale di 4,4 mM di VPA. </li><li> Spostare cultura transfettati nell&#39;armadio biosicurezza dopo la sterilizzazione l&#39;esterno del pallone con un etanolo al 70% in soluzione acquosa, aggiungere il medium di diluizione preparata e trasferire la fiaschetta al shaker incubata. </li></ol></li><li> Espressione e Harvest (Giorni 2-6) <ol><li> Incubare le cellule per altri 4-5 giorni (5-6 giorni totali da trasfezione). </li><li> Ritirare aliquote di terreno di coltura seguito passo 1.2.2. a 1.2.5. descritto in &quot;1.2. Manutenzione delle cellule,&quot; al di sopra utilizzando una sterile da 1 ml pipetta sierologica, per monitorare le cellule vitalità e salvare aliquote per analizzare l&#39;espressione di proteine ​​ad ogni giorno mediante SDS-PAGE (vedi sezione 5, sotto). </li><li> Celle di raccolta dopo 5-6 giorni di centrifugazione le cellule più medium a 1.000 g per 5 min. Inoltre, raccogliere il surnatante se la vitalità delle cellule scende al di sotto del 50% (vedere i passi 1.2.2-1.2.5). </li><li> Eliminare il surnatante che conterrà proteina secreta. Aggiungere 5 ml di candeggina al 10% al pellet di cellule HEK e scartare come un rischio biologico. </li></ol></li></ol> 4. purificazione delle proteine <ol><li> Preparare una colonna con 5 ml di proteina A sefarosio-. Equilibrare la colonna con 5 volumi di colonna di tampone A (20 mM di 3- (N-morfolino) propansolfonico (MOPS acido), pH 7,4, 100 mM NaCl). </li><li> Centrifugare il surnatante raccolto con proteina espressa ad alta velocità (14.000 g per 10 minuti) per rimuovere i detriti rimanenti. Raccogliere per decantazione in una nuova provetta. Eliminare il pellet come un rischio biologico. </li><li> Raccogliere un&#39;aliquota 10 ml del surnatante e inoltre raccogliere un piccolo campione ad ogni passo purificazione della proteina di analizzare il campione mediante SDS-PAGE (descritto nella Sezione 5). Caricare il surnatante chiarificato e raccogliere il flusso attraverso. </li><li> Lavare la colonna con 3 volumi di tampone A colonna ed eluire la proteina con volumi 5-colonna di glicina 100 mM, pH 3,0. Raccogliere l&#39;eluato in provette contenenti metà volume di 1 M tampone TRIS, pH di 8,0 per neutralizzare rapidamente il pH. </li><li> Lavare la colonna con 10 volumi di colonna di tampone A e conservare per uso futuro. </li><li> Buffer scambiare la proteina eluita con almeno un eccesso di 10 volte di tampone A con 10 kDa peso molecolare di cut-off filtri centrifughi. Nota: non concentrare il campione eluito aun volume molto basso (&lt;2 ml) nel tampone eluito. Utilizza i filtri centrifughi per scambiare il buffer con tampone A. </li><li> Conservare purificato la proteina a 4 ° C fino all&#39;utilizzo successivo. Nota: proteina espressa nel supernatante può essere purificato mediante colonne di affinità selezionati sulla base di proprietà della proteina o l&#39;uso di tag di affinità. Per una tipica procedura di purificazione, Proteina Una colonna può essere utilizzato per i frammenti Fc di IgG o colonna o nichel può essere utilizzato per le proteine ​​espresse con un tag di poli-istidina. Qui, è una descrizione delle fasi di purificazione per IgG1-Fc utilizzando una colonna di Proteina A. </li></ol> 5. Analisi di proteine ​​mediante SDS-PAGE <ol><li> Diluire le aliquote (7,5 mL) di ciascun campione con un volume uguale di tampone 2x carico (0,125 M Tris, pH 8,0, 4% SDS, 10% β-mercaptoetanolo, 20% glicerolo, e 0,01% blu di bromofenolo). </li><li> Far bollire la miscela a 90 ° C per 5 minuti utilizzando un blocco di calore o bagnomaria. Centrifugare i campioni a 10.000 g for 1 min. Caricare il gel preparata con 5 ml di proteine ​​marcatore e 14 ml di campioni per le analisi con una pipetta 20 microlitri con una punta monouso. </li><li> Eseguire un gel a 25 milliampere per 60 min. Terminata la fase di elettroforesi è completa, il gel in un contenitore con 1 L di acqua e microonde per 5 min. </li><li> Macchia il gel con soluzione colorante (40% etanolo, acido acetico 10% e 0,1% Coomassie blue brillante) per 2 ore e Decolorare in acqua. </li></ol> 6. glicani Analisi per spettrometria di massa <ol><li> Analizzare glicani come descritto in precedenza 44. In breve, 75 mg di IgG1-Fc è stato tripsinizzate, poi trattato dal PNGaseF per la liberazione di glicani 45. Glicani rilasciati sono stati permethylated e analizzati utilizzando laser-desorbimento di ionizzazione spettrometria assistita dalla matrice a tempo di volo di massa (MALDI-TOFMS). </li></ol> 7. Adeguamenti protocollo per scenari speciali <ol><li> Etichettatura proteine ​​con 15 N-etichettati Aminoacidi (per un volume trasfezione 50 ml) <ol><li> Erogare 5 mg di ciascun amminoacido in un singolo flaconcino di vetro sterili. Risospendere con 4 ml di acqua in autoclave (nota Tyr non completamente solubilizzare, a differenza di Lys e fenilalanina). Sterilizzare la soluzione in autoclave a 121 ° C per 15 min. Lasciare che la soluzione per raffreddare approssimativamente a 50-60 ° C. </li><li> Per un volume trasfezione 50 ml, seguire passo 3.1.3 secondo &quot;3.1 Stabilire una trasfezione transiente&quot;. Vedere la sezione Materiali supplementari per un esempio con volumi adeguati. </li><li> Per la trasfezione, seguire i passi di &quot;3. Stabilire una trasfezione transiente&quot; utilizzando terreno di coltura fresco sostituito con residui di amminoacidi etichettati come preparato in precedenza. </li><li> Dopo 24 ore di trasfezione, il giorno della diluizione coltura, prelevare 5,0 ml di preriscaldata Piano B, 40 ml di medium A preriscaldata e un fresco autoclavato 4 ml aliquota della miscela di aminoacidi (preparata come al punto 7.1.1. Sopra) e aggiungere 1ml preriscaldata soluzione madre di soluzione VPA per preparare 50 ml di terreno di coltura fresco diluizione con una concentrazione finale di 4,4 mm di VPA. Aggiungere questo mezzo per la coltura trasfezione usando una pipetta sierologica sterile. </li><li> Trasferire la cultura transfettati nell&#39;armadio biosicurezza dopo la sterilizzazione l&#39;esterno del pallone con un etanolo al 70% in soluzione acquosa, aggiungere il medium di diluizione preparata e trasferire la fiaschetta al shaker incubata. Nota: Media A è un mezzo privo di siero chimica definita. Così, è possibile preparare una formulazione diversa. Contattare il fornitore per ottenere un costume Media Una preparazione che manca di alcuni aminoacidi. E &#39;possibile avere tutti gli amminoacidi lasciati fuori, però, preferiamo utilizzare mezzo che mancano solo pochi selezionati residui perché un mezzo di abbandono completo sarebbe necessario un aggiustamento di osmolarità dopo l&#39;integrazione. Abbiamo scelto un mezzo di dropout Lys-Tyr-Phe che può essere integrata e non richiede regolazioni osmolarità. Furthermore, Medium Un fornitore non condividere liberamente le concentrazioni dei componenti di media; abbiamo usato 100 mg / l per ogni Lys, Tyr e fenilalanina con successo. I volumi del mezzo transfezione ed espressione devono essere adattati per tener conto delle aggiunte aminoacidi. Qui ci sono le modifiche al protocollo di cui sopra per l&#39;etichettatura degli isotopi </li></ol></li><li> Integrare il Trasfezione con una piccola molecola <ol><li> Preparare 100 soluzione madre mM di 2-deossi-2-fluoro-l-fucosio utilizzando acqua in autoclave e sterilizzare questa soluzione con un filtro da 0,22 micron. </li><li> Per una cultura 50 ml, aggiungere 125 microlitri (a 250 pM) della soluzione fucosio analogico al trasfezione e diluizione media. Nota: abbiamo trascurato di compiere un ulteriore regolazione del volume, perché l&#39;aggiunta del sostituente in questa concentrazione conti solo il 0,25% del totale del volume .It cultura è possibile modificare l&#39;espressione con piccole molecole inibitrici della lavorazione glicano. Qui si descrivono le condizioni di cui 2-deoxy-2-fluoro-l-fucosio, un inibitore di fucosilazione glycan. Abbiamo trovato&gt; 90% di riduzione fucosilazione aggiungendo analogico fucosio ad una concentrazione di 250 mM di trasfezione e diluizione media. </li></ol></li></ol>

Tutti gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti in questo manoscritto.

Questo protocollo illustra l&#39;espressione della proteina tramite la trasfezione transiente di cellule HEK293F o S. Le condizioni ottimali di trasfezione stabilite nei laboratori Barb e Moremen utilizzano una combinazione critica di concentrazioni di densità delle cellule e reagenti per ottenere un&#39;elevata efficienza di trasfezione. Considerazioni critiche in sede di attuazione di questo protocollo sono: il mantenimento di una cultura stabile prima di trasfezione (con la cultura coerente tempi raddoppio); trasfezi...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/53568">High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension</a>. The Authors section was updated. from:
Ganesh P. Subedi1 
Roy W. Johnson2 
Heather A. Moniz2 
Kelley W. Moremen2 
Adam Barb1 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University 
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia
to
Ganesh P. Subedi1 
Roy W. Johnson2 
Heather A. Moniz2 
Kelley W. Moremen2 
Adam W. Barb1 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University 
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/53568">High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension</a>. The Authors section was updated.

Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

Produrre rese elevate di proteine ​​umane opportunamente piegati e post-traduzionali modificati per l&#39;analisi dettagliata della struttura e della funzione rimane una sfida significativa. Un gran numero di sistemi di espressione sono disponibili che producono proteine ​​ricombinanti con funzione e il comportamento di tipo nativo. Sistemi di espressione batterici, prevalentemente ceppi Escherichia coli, rappresentano gli strumenti più accessibili e più comunemente utilizzati in ambito di ricerca, grazie alla semplicità di questi sistemi di espressione, però lieviti, piante, insetti e mammiferi sono anche descritti 1-4. Tuttavia, la maggior parte di questi sistemi sono incapaci di appropriate modificazione post-traduzionale di proteine ​​bersaglio. Un interesse fondamentale dei laboratori Barb e Moremen sta producendo proteine ​​eucariotiche con un&#39;adeguata glicosilazione. Molte proteine ​​umane richiedono glicosilazione appropriato per il corretto funzionamento (vedi punto 5). Il eucarioticamacchine glicosilazione è ampia e in grado di fare una vasta gamma di modifiche, tra cui sia asparagina (N) - e serina / treonina (O) linked glicani complessi 6. Si stima che&gt; 50% di proteine ​​umane sono N-glicosilata 7. Glicani sono componenti essenziali di molte proteine, tra cui gli anticorpi monoclonali terapeutici, eritropoietina, e fattori di coagulazione del sangue come fattore IX, per citarne alcuni. Anche se esistono diversi metodi per preparare adeguatamente le proteine ​​N-glicosilata e vanno dal puramente sintetica 8-10, a chemoenzimatica 11-14 o il recupero dai sistemi ricombinanti ingegnerizzati 15-20, non a caso, sistemi di espressione umane hanno finora dimostrato di essere il più robusto metodi per generare proteine ​​umane. Molti glicoproteine ​​umani terapeutiche sono prodotte in sistemi ricombinanti utilizzando cellule di mammifero. Sistemi di nota sono l&#39;ovaio di criceto cinese (CHO), mouse mieloma (NS0), Baby Hamster Kidney (BHK), embrionale umano Rene (HEK-293) e linee di cellule retiniche umane che sono impiegati in adesione o la sospensione di coltura per la produzione di proteine ​​4,21,22. Tuttavia, sistemi di espressione di proteine ​​di mammifero hanno richiesto la generazione di linee cellulari stabili, terreni di crescita costosi e substrato assistita procedure di trasfezione 23. Trasfezione di cellule di mammifero è realizzato con l&#39;ausilio di numerosi agenti, tra cui fosfati di calcio 24,25, polimeri cationici (DEAE-destrano, polibrene, polilisina, polyethylimine (PEI)) o caricati positivamente liposomi cationici 26-29. PEI è un policationico, carica, lineare o ramificato polimero (25 kDa) 26 che forma un complesso stabile con il DNA ed è endocitosi. Dopo acidificazione del endosome, PEI è pensato a gonfiarsi, portando alla rottura di endosomi e liberazione del DNA nel citoplasma 26,30. Fino a poco tempo, trasfezione transiente in suspensisulla cultura è stata effettuata previo formazione del complesso DNA / PEI seguita tramite aggiunta alla coltura cellulare 29. Tuttavia, Würm e collaboratori hanno riportato un protocollo altamente efficiente ottimizzato per la produzione di proteine ​​ricombinanti in cellule HEK293 che formavano un complesso DNA / PEI in situ 31,32. Ciò ha evitato preparazione, sterilizzazione del complesso, e scambio di tamponi in un terreno di coltura. Ulteriore ottimizzazione includendo plasmidi di espressione di miglioramento ha portato ad aumenti di rendimento significativo 33. Qui è un metodo che si basa su questi progressi ed è ampiamente applicabile. Condizioni di espressione può anche essere modificati per influenzare la composizione N-glicani. La linea cellulare HEK293S, con una delezione del gene che blocca trasformazione di N-glicani in una fase intermedia, porta alla espressione di proteine ​​con uniformi N-glicani composto da 2 residui N-acetilglucosamina più cinque residui di mannosio (Man 5 GlcNAc 2) 34, 35. Queste cellulemanca la transferasi N-acetylglucosaminyl I (GntI) gene che è richiesto per N-glicani lavorazione a valle 36,37. L&#39;uso di inibitori glicosiltransferasi compreso kifunensine, analoghi di acido sialico e fucosio analogico e 2-deossi-2-fluoro-fucosio ha effetti simili e limiti di lavorazione N-glicani 38-41. Il protocollo qui riportato utilizza il vettore pGEn2 come mostrato in Figura 1 42,43, PEI assistito trasfezione transiente in cellule di mammifero (linee HEK293F o cellule HEK293S), e il recupero di alte rese di proteine ​​opportunamente glicosilata. Questo sistema è robusto e può ospitare diversi fattori tra cui marcatura isotopica e l&#39;ingegneria glycan per la produzione di grandi titoli di proteine ​​ricombinanti.

<table><tbody><tr><td>Armadio di biosicurezza&nbsp;</td><td>NuAire, Inc.</td><td>CellGard ES NU-S475-400</td><td>Classe II, Tipo A2 Agitatore di incubazione per cabina di sicurezza biologica</td></tr><tr><td></td><td>INFORS HT</td><td></td><td>Multitron Cell</td></tr><tr><td>Medium A: Espressione FreeStyle Medium&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12338-018</td><td></td></tr><tr><td>Medium B: ExCell 293 Terreno senza siero&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>14571C</td><td></td></tr><tr><td>125 Erlenmeyer Flask con tappo ventilato</td><td>Corning Incorporated/Life Sciences</td><td>431143</td><td></td></tr><tr><td>250 Erlenmeyer Flask con tappo ventilato</td><td>Corning Incorporated/Life Sciences</td><td>431144</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle HEK 293F Cells</td><td>Life Technologies</td><td>R790-07</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Pipetta sierologica monouso</td><td>Fisher Scietific</td><td>13-676-10B</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipetta sierologica monouso</td><td>Fisher Scietific</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Pipetta sierologica monouso</td><td>Fisher Scietific</td><td>13-676-10K</td><td></td></tr><tr><td>Pipettor (Pipet-Aid XP)</td><td>Drummond Scientific</td><td>161263</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>SV30084.01</td><td></td></tr><tr><td>Conteggio dei vetrini&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Contatore di celle automatizzato&nbsp;</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimmina (PEI)</td><td>Polysciences Inc.</td><td>23966</td><td>Preparare la soluzione madre alla concentrazione di 1 mg/ml in un tampone contenente 25 mM di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico (HEPES) e 150 mM di NaCl (pH 7,5). Sciogliere completamente il PEI; sterilizzare fino a 0,22 &mu; M filtrare e conservare a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico (HEPES)</td><td>EMD Chemicals Inc.</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa da 25 mm, 0,22 &; M</td><td>Fisher Scietific</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>Trisaminomethane (Tris base)</td><td>Fisher Scietific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Blue</td><td>Stratagene</td><td>222249</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Fisher Scietific</td><td>BP1421-2</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Fluka Analytical&nbsp;</td><td>92144</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>BDH sostanze chimiche</td><td>BDH8014</td><td></td></tr><tr><td>Kit di purificazione plasmidico</td><td>QIAGEN</td><td>12145</td><td></td></tr><tr><td>Valproic (VPA)</td><td>SIGMA</td><td>P4543</td><td>Preparare una soluzione madre di 220 mM&nbsp; in acqua, sterilizzare per passaggio attraverso un filtro sterile da 0,22 mm e conservare a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>EW-17707-65</td><td></td></tr><tr><td>Proteina A-Sefarosio</td><td>colonna SIGMA</td><td>P9424</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA superflow</td><td>QIAGEN</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>3-(N-morfolino)acido propansolfofonico (MOPS)</td><td>Fisher Scietific</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Fisher Scietific</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>10 kDa cut-off del peso molecolare Amicon&reg; Filtri ultra centrifughi&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>UFC901096</td><td></td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato</td><td>ALDRICH</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercaptoetanolo</td><td>ALDRICH</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>SIGMA</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein All Blue Standards</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0373</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico, glaciale&nbsp;</td><td>Fisher Scietific</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>coomassie blu brillante</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>161-0406</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15N marcato L-tirosina</td><td>ALDRICH</td><td>332151</td><td></td></tr><tr><td>15N marcato L-lisina</td><td>ALDRICH</td><td>592900</td><td></td></tr><tr><td>Non marcato L-Fenilalanina</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>13C6-Glucosio</td><td>ALDRICH</td><td>389374</td><td></td></tr><tr><td>2- deossi-2-fluoro-l-fucosio&nbsp;</td><td>SANTA CRUZ Biotecnologia</td><td>sc-283123</td><td></td></tr></tbody></table>

high yield espressione di proteine ​​ricombinanti umane con il transient trasfezione delle cellule hek293 in sospensione

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

L&#39;arte di produrre proteine ​​ricombinanti con complesse modificazioni post-traslazionali rappresenta una sfida importante per gli studi di struttura e funzione. L&#39;istituzione rapida ed elevata recupero da linee cellulari di mammiferi transiente transfettate indirizzi questa barriera ed è un mezzo efficace per esprimere le proteine ​​che sono naturalmente incanalati attraverso l&#39;ER e Golgi-mediata via secretoria. Qui è un protocollo per l&#39;espressione della proteina con il HEK293F umano e linee cellulari HEK293S transfettate con un vettore di espressione di mammifero progettato per rese elevate di proteine. L&#39;applicabilità di questo sistema è dimostrata utilizzando tre glicoproteine ​​rappresentative che hanno espresso con rese tra 95-120 mg di proteina purificata recuperato per litro di cultura. Queste proteine ​​sono la FcγRIIIa umana e sialyltransferase α2-6 ratto, ST6GalI, sia espressa con una fusione GFP N-terminale, così come la immunoglobulina umana non modificato G1 Fc. Questo robusto sistema utilizes un mezzo privo di siero che è adattabile per l&#39;espressione di proteine ​​e carboidrati per studi strutturali mediante spettrometria di massa e spettroscopia di risonanza magnetica nucleare isotopicamente arricchiti. Inoltre, la composizione della N-glicani può essere regolato aggiungendo una piccola molecola di evitare talune modifiche glicani in modo che non riduca la resa.

Espressione della proteina ad alto livello e la purezza Questo sistema di espressione ottimizzato generato un alto rendimento di proteine ​​glicosilate. Un modello tipico è mostrato nell&#39;espressione di IgG1-Fc (Figura 1). In questo caso, Giorno 0 è il giorno trasfezione seguito da Day 1 (diluizione) e nei giorni successivi della cultura fino al giorno 5. espressione della proteina viene analizzata utilizza...

La produzione su scala di laboratorio di proteine eucariotiche con appropriate modifiche post-traduzionali rappresenta un ostacolo significativo. Ecco un protocollo robusto con rapida instaurazione e inversione di tendenza per l'espressione proteica utilizzando un sistema di espressione nei mammiferi. Questo sistema supporta la selettività degli amminoacidi, la marcatura selettiva delle proteine e i modulatori di piccole molecole della composizione dei glicani.

High Yield Espressione di proteine ​​ricombinanti umane con il Transient Trasfezione delle cellule HEK293 in sospensione

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è esprimere glicoproteine di mammifero con una glicosilazione appropriata di tipo mammaliano, indirizzando le proteine ricombinanti verso il reticolo endoplasmatico e il percorso secretorio mediato dall'apparato di Golgi. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nell'ambito dell'immunologia, come ad esempio qual è il ruolo di una specifica struttura, i modelli nella conformazione e il potenziale di attivazione immunitaria di anticorpi e frammenti di anticorpi. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nell'utilizzo di cellule umane per esprimere proteine umane, il che garantisce il corretto ambiente cellulare necessario per ripiegare e modificare in modo appropriato le proteine bersaglio.Lo shaker incubatore per l'allestimento delle colture cellulari deve essere impostato a 135 RPM, umidità 80%, anidride carbonica 8% e 37 gradi Celsius almeno un'ora prima dell'inoculo della coltura. Accendere la lampada UV della cappa biologica, preriscaldare le bottiglie del mezzo sigillato A e del mezzo B in un bagno termostatato a 37 gradi Celsius. Spegnere le luci UV e sterilizzare la cappa biologica con una soluzione di etanolo al 70% e acqua.Sterilizzare un matraccio da 125 millilitri con tappo forato, pipette, pipettatori e bottiglie di mezzo di coltura preriscaldate spruzzando una soluzione al 70% di etanolo in acqua. Posizionare questi elementi nella cappa a sicurezza biologica per tutta la durata della procedura. Tutti gli oggetti devono essere sterilizzati in questo modo prima di essere introdotti nella cappa a sicurezza biologica.Preparare un mezzo di coltura fresco per una coltura di 30 millilitri prelevando 26 millilitri del mezzo A e tre millilitri del mezzo B e trasferendoli nel becher Erlenmeyer da 125 millilitri. Mescolare agitando delicatamente. Riscaldare in un bagno a 37 °C una provetta di cellule HEK 293F precedentemente congelate a -80 °C fino a scongelamento parziale. Questa operazione richiede circa un minuto e le cellule non devono essere completamente scongelate.Successivamente, sterilizzare l'esterno della provetta con la soluzione di etanolo al 70% in acqua e trasferirla all'interno della cappa a sicurezza biologica. Utilizzando una pipetta da un millilitro, prelevare la sospensione cellulare e trasferirla nel matraccio Erlenmeyer da 125 millilitri contenente 29 millilitri di mezzo di coltura fresco. Chiudere il coperchio del matraccio di coltura e posizionare il matraccio nello shaker incubatore per 24 ore.24 ore dopo l'inoculo della coltura. Verificare la densità cellulare, sterilizzare il flacone di coltura con una soluzione di etanolo al 70% e acqua e trasferirlo nella cappa a sicurezza biologica. Utilizzando una pipetta da un millilitro e un pipettatore, prelevare lentamente 100 microlitri della coltura e trasferirli in un tubo einor sterile da 0,5 millilitri.Chiudere il coperchio del fiasco di coltura e riposizionare il fiasco nell'agitatore ad incubarore il più rapidamente possibile. Mescolare 7,5 microlitri di una soluzione di trian blu con 7,5 microlitri di cellule. Agitare vigorosamente, quindi trasferire 7,5 microlitri della miscela su un vetrino per conta.Accendere il contatore automatico di cellule e inserire la lamella di conteggio nella camera di carico. Il lettore automatico si attiva e le cellule vengono contate automaticamente in unità di numero di cellule per millilitro e percentuale di vitalità. Determinare il volume della coltura del donatore necessario da trasferire in un mezzo di coltura fresco per ottenere una densità cellulare di 300.000 cellule vive per millilitro.Preparare un mezzo di coltura fresco come indicato in precedenza, trasferendo 23 millilitri di mezzo A e tre millilitri di mezzo B in un nuovo fiasco da coltura da 125 millilitri. Successivamente, rimuovere le bottiglie di riserva del mezzo A e del mezzo B dalla cappa a sicurezza biologica per ridurre il rischio di contaminazione. Recuperare quindi il fiasco di coltura cellulare HEK 293 F dall'incubatore.Nebulizzare con la soluzione di etanolo al 70% in acqua e posizionare all'interno della cappa a sicurezza biologica utilizzando una pipetta nuova. Prelievarre l'aliquota corretta di cellule dalla coltura e trasferirla nel flacone contenente mezzo di coltura fresco. Trasferire entrambe le colture dalla cappa a sicurezza biologica all'incubatore agitatore.Coltivare le cellule fino a una densità approssimativa di due a tre milioni di cellule vitali per millilitro prima della trasfezione. Verificare la densità cellulare come mostrato in precedenza e determinare la quantità di cellule necessaria per la trasfezione. Utilizzando una pipetta sierologica sterile.Trasferire il volume appropriato di sospensione cellulare in un tubo da centrifuga da 250 millilitri. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 100 volte G per cinque minuti. Dopo la sterilizzazione, trasferire il tubo contenente il pellet cellulare all'interno della cappa a sicurezza biologica.Utilizzare una pipetta sterile per decantare il soprannatante costituito dal mezzo di coltura usato. Ri-sospendere vigorosamente le cellule pellettizzate pipettando su e giù con 10 millilitri di mezzo di coltura fresco e trasferire in un flacone preparato contenente mezzo di coltura per la trasfezione fresco. Avvitare il tappo sul flacone da coltura cellulare con valvola di ventilazione e incubare il flacone nello shaker dell'incubatrice per 15 minuti fino a un'ora, mentre le cellule sono in incubazione.Diluire il DNA plasmidico e le soluzioni stock di POLIETERAMMINA o PEI utilizzando mezzo di coltura fresco fino a una concentrazione finale di 0,5 microgrammi per microlitro. Rimuovere il flacone di coltura con le cellule disperse dall'incubatore agitatore e trasferirlo nella cappa a sicurezza biologica; aggiungere quindi, mediante micropipetta, 300 microlitri di DNA plasmidico alla coltura e mescolare delicatamente agitando manualmente; successivamente, aggiungere 900 microlitri di PEI alla coltura e mescolare nuovamente. Infine, aggiungere 3,8 millilitri di mezzo di coltura fresco.Trasferire il matraccio nello shaker incubatore per 24 ore. 24 ore dopo la trasfezione, il coltura cellulare deve essere diluito. Per preparare il mezzo di diluizione, utilizzare prima una pipetta sierologica sterile da un millilitro per prelevare un millilitro di PREWARM acido valproico 220 millimolare o VPA e trasferirlo in un tubo sterile da 50 millilitri.Successivamente, utilizzare una pipetta sierologica sterile per aggiungere cinque millilitri di mezzo B preriscaldato e 44 millilitri di mezzo A preriscaldato alla soluzione di VPA. Questo produce 50 millilitri di mezzo di coltura fresco con una concentrazione finale di 4,4 millimolare di VPA. Recuperare la coltura transfetta dall'incubatrice.Sterilizzare l'esterno del pallone e posizionare il pallone all'interno della cappa a sicurezza biologica. Aggiungere il mezzo di diluizione preparato alla coltura. Trasferire il pallone di nuovo nello shaker-incubatore per ulteriori quattro-cinque giorni dopo la trasfezione.Monitorare la vitalità cellulare quotidianamente seguendo la procedura dimostrata in precedenza. È inoltre necessario conservare ogni giorno aliquote per l'analisi dell'espressione proteica, a partire dal quinto o sesto giorno dopo la trasfezione o qualora la vitalità cellulare scenda al di sotto del 50%. Raccogliere le cellule centrifugando le cellule insieme al mezzo a 1000 × g per cinque minuti. Recuperare il surnatante, che conterrà la proteina secreta, e aggiungere cinque millilitri di una soluzione di candeggina al 10% al pellet di cellule HEK, quindi smaltire il tutto come materiale biologicamente pericoloso.Successivamente, la proteina viene purificata dal sopranatante raccolto. Questo sistema di espressione ha generato un'elevata resa di proteine glicosilate, come illustrato da questo tipico profilo di espressione di IgG1-Fc dopo la transfezione transitoria di cellule HEK293F. La purificazione per affinità mediante una colonna proteica per IgG1-Fc o una colonna al nichel per GFP marcata con istidina e recettore FcγRIIIa ha prodotto proteine ad alta purezza.Questo sistema ha espresso in modo efficiente IgG marcata isotopicamente in un singolo FC in questo spettro NMR bidimensionale che correla la frequenza di risonanza dei nuclei di idrogeno e l'azoto ammidico direttamente legato. Sono stati osservati segnali ben dispersi provenienti da 15 atomi. Diverse forme glicosidiche sono state prodotte utilizzando cellule HEK 293F e HEK 293S in diverse condizioni di coltura, come dimostrato da analisi di spettrometria di massa con ionizzazione mediante desorbimento laser assistita da matrice.IgG con un FC espressa da cellule HEK 293S, contenente glicani di una forma con cinque unità di mannosio più due residui di N-acetilglucosamina, mentre i glicani privi di fucosio espressi dal materiale di HEK 293F erano forme complesse biantennarie con fucosio centrale e prevalentemente con terminazioni in N-acetilglucosamina o, in piccola proporzione, forme mono- o di-sialilate. L'aggiunta di un inibitore della glicosilazione durante un'espressione condotta utilizzando cellule HEK 293F ha mostrato una riduzione superiore al 90% nell'incorporazione di fucosio. Una volta acquisita padronanza, l'instaurazione della transfezione transitoria può essere completata in 1,5 ore al primo giorno e in 15 minuti al secondo giorno. Dopo un periodo di espressione di quattro-sei giorni, la soluzione contenente la proteina può essere raccolta in 15 minuti.Infine, la purificazione della proteina richiederà circa 1,5 ore. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di mantenere una coltura stabile prima della trasfezione, trasfettando cellule in attiva crescita e aggiungendo il DNA prima di aggiungere il PEI. A seguito di questa procedura, altri metodi come la caratterizzazione funzionale della proteina mediante una serie di tecniche biofisiche possono essere eseguiti per analizzare la struttura e la funzione della glicoproteina espressa dopo il suo sviluppo.Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia per esplorare la relazione struttura-attività dell'IgG e della glicosilazione in vitro e in vivo. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare e purificare le glicoproteine utilizzando la nostra combinazione di cellule K 2 93 F e il vettore PZ N due.

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