High Yield Espressione di proteine ​​ricombinanti umane con il Transient Trasfezione delle cellule HEK293 in sospensione

L'obiettivo generale di questa procedura è esprimere glicoproteine di mammifero con una glicosilazione appropriata di tipo mammaliano, indirizzando le proteine ricombinanti verso il reticolo endoplasmatico e il percorso secretorio mediato dall'apparato di Golgi. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nell'ambito dell'immunologia, come ad esempio qual è il ruolo di una specifica struttura, i modelli nella conformazione e il potenziale di attivazione immunitaria di anticorpi e frammenti di anticorpi. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nell'utilizzo di cellule umane per esprimere proteine umane, il che garantisce il corretto ambiente cellulare necessario per ripiegare e modificare in modo appropriato le proteine bersaglio.

Lo shaker incubatore per l'allestimento delle colture cellulari deve essere impostato a 135 RPM, umidità 80%, anidride carbonica 8% e 37 gradi Celsius almeno un'ora prima dell'inoculo della coltura. Accendere la lampada UV della cappa biologica, preriscaldare le bottiglie del mezzo sigillato A e del mezzo B in un bagno termostatato a 37 gradi Celsius. Spegnere le luci UV e sterilizzare la cappa biologica con una soluzione di etanolo al 70% e acqua.

Sterilizzare un matraccio da 125 millilitri con tappo forato, pipette, pipettatori e bottiglie di mezzo di coltura preriscaldate spruzzando una soluzione al 70% di etanolo in acqua. Posizionare questi elementi nella cappa a sicurezza biologica per tutta la durata della procedura. Tutti gli oggetti devono essere sterilizzati in questo modo prima di essere introdotti nella cappa a sicurezza biologica.

Preparare un mezzo di coltura fresco per una coltura di 30 millilitri prelevando 26 millilitri del mezzo A e tre millilitri del mezzo B e trasferendoli nel becher Erlenmeyer da 125 millilitri. Mescolare agitando delicatamente. Riscaldare in un bagno a 37 °C una provetta di cellule HEK 293F precedentemente congelate a -80 °C fino a scongelamento parziale. Questa operazione richiede circa un minuto e le cellule non devono essere completamente scongelate.

Successivamente, sterilizzare l'esterno della provetta con la soluzione di etanolo al 70% in acqua e trasferirla all'interno della cappa a sicurezza biologica. Utilizzando una pipetta da un millilitro, prelevare la sospensione cellulare e trasferirla nel matraccio Erlenmeyer da 125 millilitri contenente 29 millilitri di mezzo di coltura fresco. Chiudere il coperchio del matraccio di coltura e posizionare il matraccio nello shaker incubatore per 24 ore.

24 ore dopo l'inoculo della coltura. Verificare la densità cellulare, sterilizzare il flacone di coltura con una soluzione di etanolo al 70% e acqua e trasferirlo nella cappa a sicurezza biologica. Utilizzando una pipetta da un millilitro e un pipettatore, prelevare lentamente 100 microlitri della coltura e trasferirli in un tubo einor sterile da 0,5 millilitri.

Chiudere il coperchio del fiasco di coltura e riposizionare il fiasco nell'agitatore ad incubarore il più rapidamente possibile. Mescolare 7,5 microlitri di una soluzione di trian blu con 7,5 microlitri di cellule. Agitare vigorosamente, quindi trasferire 7,5 microlitri della miscela su un vetrino per conta.

Accendere il contatore automatico di cellule e inserire la lamella di conteggio nella camera di carico. Il lettore automatico si attiva e le cellule vengono contate automaticamente in unità di numero di cellule per millilitro e percentuale di vitalità. Determinare il volume della coltura del donatore necessario da trasferire in un mezzo di coltura fresco per ottenere una densità cellulare di 300.000 cellule vive per millilitro.

Preparare un mezzo di coltura fresco come indicato in precedenza, trasferendo 23 millilitri di mezzo A e tre millilitri di mezzo B in un nuovo fiasco da coltura da 125 millilitri. Successivamente, rimuovere le bottiglie di riserva del mezzo A e del mezzo B dalla cappa a sicurezza biologica per ridurre il rischio di contaminazione. Recuperare quindi il fiasco di coltura cellulare HEK 293 F dall'incubatore.

Nebulizzare con la soluzione di etanolo al 70% in acqua e posizionare all'interno della cappa a sicurezza biologica utilizzando una pipetta nuova. Prelievarre l'aliquota corretta di cellule dalla coltura e trasferirla nel flacone contenente mezzo di coltura fresco. Trasferire entrambe le colture dalla cappa a sicurezza biologica all'incubatore agitatore.

Coltivare le cellule fino a una densità approssimativa di due a tre milioni di cellule vitali per millilitro prima della trasfezione. Verificare la densità cellulare come mostrato in precedenza e determinare la quantità di cellule necessaria per la trasfezione. Utilizzando una pipetta sierologica sterile.

Trasferire il volume appropriato di sospensione cellulare in un tubo da centrifuga da 250 millilitri. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 100 volte G per cinque minuti. Dopo la sterilizzazione, trasferire il tubo contenente il pellet cellulare all'interno della cappa a sicurezza biologica.

Utilizzare una pipetta sterile per decantare il soprannatante costituito dal mezzo di coltura usato. Ri-sospendere vigorosamente le cellule pellettizzate pipettando su e giù con 10 millilitri di mezzo di coltura fresco e trasferire in un flacone preparato contenente mezzo di coltura per la trasfezione fresco. Avvitare il tappo sul flacone da coltura cellulare con valvola di ventilazione e incubare il flacone nello shaker dell'incubatrice per 15 minuti fino a un'ora, mentre le cellule sono in incubazione.

Diluire il DNA plasmidico e le soluzioni stock di POLIETERAMMINA o PEI utilizzando mezzo di coltura fresco fino a una concentrazione finale di 0,5 microgrammi per microlitro. Rimuovere il flacone di coltura con le cellule disperse dall'incubatore agitatore e trasferirlo nella cappa a sicurezza biologica; aggiungere quindi, mediante micropipetta, 300 microlitri di DNA plasmidico alla coltura e mescolare delicatamente agitando manualmente; successivamente, aggiungere 900 microlitri di PEI alla coltura e mescolare nuovamente. Infine, aggiungere 3,8 millilitri di mezzo di coltura fresco.

Trasferire il matraccio nello shaker incubatore per 24 ore. 24 ore dopo la trasfezione, il coltura cellulare deve essere diluito. Per preparare il mezzo di diluizione, utilizzare prima una pipetta sierologica sterile da un millilitro per prelevare un millilitro di PREWARM acido valproico 220 millimolare o VPA e trasferirlo in un tubo sterile da 50 millilitri.

Successivamente, utilizzare una pipetta sierologica sterile per aggiungere cinque millilitri di mezzo B preriscaldato e 44 millilitri di mezzo A preriscaldato alla soluzione di VPA. Questo produce 50 millilitri di mezzo di coltura fresco con una concentrazione finale di 4,4 millimolare di VPA. Recuperare la coltura transfetta dall'incubatrice.

Sterilizzare l'esterno del pallone e posizionare il pallone all'interno della cappa a sicurezza biologica. Aggiungere il mezzo di diluizione preparato alla coltura. Trasferire il pallone di nuovo nello shaker-incubatore per ulteriori quattro-cinque giorni dopo la trasfezione.

Monitorare la vitalità cellulare quotidianamente seguendo la procedura dimostrata in precedenza. È inoltre necessario conservare ogni giorno aliquote per l'analisi dell'espressione proteica, a partire dal quinto o sesto giorno dopo la trasfezione o qualora la vitalità cellulare scenda al di sotto del 50%. Raccogliere le cellule centrifugando le cellule insieme al mezzo a 1000 × g per cinque minuti. Recuperare il surnatante, che conterrà la proteina secreta, e aggiungere cinque millilitri di una soluzione di candeggina al 10% al pellet di cellule HEK, quindi smaltire il tutto come materiale biologicamente pericoloso.

Successivamente, la proteina viene purificata dal sopranatante raccolto. Questo sistema di espressione ha generato un'elevata resa di proteine glicosilate, come illustrato da questo tipico profilo di espressione di IgG1-Fc dopo la transfezione transitoria di cellule HEK293F. La purificazione per affinità mediante una colonna proteica per IgG1-Fc o una colonna al nichel per GFP marcata con istidina e recettore FcγRIIIa ha prodotto proteine ad alta purezza.

Questo sistema ha espresso in modo efficiente IgG marcata isotopicamente in un singolo FC in questo spettro NMR bidimensionale che correla la frequenza di risonanza dei nuclei di idrogeno e l'azoto ammidico direttamente legato. Sono stati osservati segnali ben dispersi provenienti da 15 atomi. Diverse forme glicosidiche sono state prodotte utilizzando cellule HEK 293F e HEK 293S in diverse condizioni di coltura, come dimostrato da analisi di spettrometria di massa con ionizzazione mediante desorbimento laser assistita da matrice.

IgG con un FC espressa da cellule HEK 293S, contenente glicani di una forma con cinque unità di mannosio più due residui di N-acetilglucosamina, mentre i glicani privi di fucosio espressi dal materiale di HEK 293F erano forme complesse biantennarie con fucosio centrale e prevalentemente con terminazioni in N-acetilglucosamina o, in piccola proporzione, forme mono- o di-sialilate. L'aggiunta di un inibitore della glicosilazione durante un'espressione condotta utilizzando cellule HEK 293F ha mostrato una riduzione superiore al 90% nell'incorporazione di fucosio. Una volta acquisita padronanza, l'instaurazione della transfezione transitoria può essere completata in 1,5 ore al primo giorno e in 15 minuti al secondo giorno. Dopo un periodo di espressione di quattro-sei giorni, la soluzione contenente la proteina può essere raccolta in 15 minuti.

Infine, la purificazione della proteina richiederà circa 1,5 ore. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di mantenere una coltura stabile prima della trasfezione, trasfettando cellule in attiva crescita e aggiungendo il DNA prima di aggiungere il PEI. A seguito di questa procedura, altri metodi come la caratterizzazione funzionale della proteina mediante una serie di tecniche biofisiche possono essere eseguiti per analizzare la struttura e la funzione della glicoproteina espressa dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia per esplorare la relazione struttura-attività dell'IgG e della glicosilazione in vitro e in vivo. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare e purificare le glicoproteine utilizzando la nostra combinazione di cellule K 2 93 F e il vettore PZ N due.