Name: Confocale Time lapse imaging come un metodo efficiente per la valutazione citocompatibilità di compositi dentali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Scopri come valutare la citocompatibilità di compositi dentali con microscopia confocale 3D e time-lapse imaging. Questo metodo consente il monitoraggio in tempo reale del comportamento cellulare senza alterare la struttura.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Le aziende Saremco Dental Switzerland e Olympus Microsystems France sono grate per il loro sostegno finanziario. Saremco Dental è anche riconosciuta per la generosa donazione dei compositi dentali ELS a bassissimo restringimento. Gli autori desiderano inoltre esprimere il loro apprezzamento al dottor Simon Banks del dipartimento di Chimica (University College London) per la sua assistenza nella revisione dell'inglese.

Il protocollo consiste di tre fasi principali: la prima fase comprende la preparazione dell&#39;estratto composito di coltura; la seconda riguarda la primaria gengivali umani fibroblasti (HGF) coltura cellulare, il contatto delle cellule con estratti compositi e colorazione delle cellule; il terzo passo consiste confocale e l&#39;analisi del segnale fluorescente. Per i tessuti gengivali prendere, il protocollo è stato approvato in conformità con la legislazione francese, il consenso informato e del comitato etico locale. 1. composito Estratti Preparazione Utilizzare modificato medie Aquila Dulbecco (DMEM) come mezzo di eluizione. Assicurarsi che il rapporto tra la superficie dei campioni e il volume del mezzo di estrazione è al livello più basso dei requisiti ISO 10993/12. La procedura è descritta di recente 11 e descritto brevemente qui di seguito: <ol><li> Formare campioni sferici del composito dentale non polimerizzato utilizzando una presa su misuraER. La dimensione del supporto è di 2 mm di raggio, che è in accordo con la profondità di polimerizzazione generalmente consigliata nel trattamento clinico orale. </li><li> Preparare pozzetti della piastra, contenenti ciascuna 1 ml di terreno di coltura (DMEM), con una miscela al 5% di penicillina / streptomicina e 1% di amfotericina ma senza siero bovino fetale (FBS). </li><li> Campioni Cure all&#39;interno del pozzetto contenente mezzo DMEM con una lampada a luce LED con un cm -2 intensità di 1.070 mW (λ = 465-475 nm) per 40 sec. Assicurarsi che la distanza tra la punta e la polimerizzazione dei campioni è nel range di 0,5 mm. Utilizzare questa modalità di polimerizzazione per simulare il contatto temporaneo tra dente e il composito dentale non polimerizzato. Nella situazione clinica, il contatto si verifica quando il composito da restauro viene inserito nella cavità orale. </li><li> Incubare campioni (campioni compositi in terreno DMEM) a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% di CO 2 in aria. Incubare terreno DMEM (senza campioni compositi) per le cellule di controllo nelle stesse condizioni. </li></ol> 2. HGF coltura cellulare, Composite Estratti Test e Celle di colorazione <ol><li> Crescita e mantenimento di colture cellulari Isolare fibroblasti gengivali umani provenienti da biopsie dei tessuti gengivali sani di pazienti scattate durante estrazioni ortodontiche di routine. <ol><li> Coltivazione fibroblasti gengivali umani in DMEM in presenza del 10% FBS, 5% di penicillina / streptomicina e 1% Amfotericina B. mantenere le cellule a 37 ° C in incubatore in atmosfera umidificata al 5% di CO 2 in aria. </li><li> Medie cambiata ogni 3 giorni, e le cellule di passaggio ogni 5 giorni. Dopo aver raggiunto confluenza, le cellule raccolto da tripsinizzazione. </li><li> Centrifugare le cellule a 90 xg per 5 min e risospendere nel mezzo di coltura. Conteggio delle cellule con un contatore di cellule scettro palmare automatizzato. </li><li> Sospensione cellulare Seed ad una densità cellulare di 2,5 x 10 4 cellule / ml in un sistema di scorrimento della camera. Consentire l&#39;incubazione delle cellule durante la notte a 37 ° C in atmosfera al 5%. </li></ol></li><li> L&#39;aggiunta di estratti compositi alle cellule in coltura <ol><li> Sostituire i supporti dei due pozzi della slitta della camera da 1 ml di estratti composti testati (dopo 24 ore di incubazione). </li><li> Mantenere i due pozzetti rimanenti (cellule di controllo) nelle stesse condizioni. </li><li> Incubare il vetrino camera contenente i quattro pozzetti a 37 ° C in incubatore, in atmosfera umidificata al 5% di CO 2 in aria. </li></ol></li><li> Colorazione fluorescente Utilizzare la macchia citotossicità Live / Dead cellule eucariotiche in base alle istruzioni del produttore. NOTA: il kit prevede un test di fluorescenza a due colori veloce per determinare la vitalità delle cellule in una popolazione sulla base di integrità della membrana plasmatica e l&#39;attività esterasi. La macchia distingue in diretta da cellule danneggiate mediante l&#39;etichettatura in contemporanea con verde fluorescente calceina-AM per indicare l&#39;attività esterasi intracellulare e rosso fluorescente etidio omodimero-1 (EthD-1) per indicare la perdita di Membrane integrità. <ol><li> Preparare una soluzione di lavoro dei due reagenti di colorazione contenente 2 mM di calceina AM e 4 mM EthD-1 (concentrazione finale segnalato per essere adatto per fibroblasti colorazione). Aggiungere la macchia alle cellule aderenti in coltura in presenza o assenza dei composti estratti selezionati. </li><li> Osservare direttamente e rapidamente le popolazioni di cellule colorate al almeno 15 minuti dopo colorazione e attraverso il time-lapse imaging. Non centrifugare e non fixe le cellule colorate. </li></ol></li></ol> 3. confocale Time Lapse Imaging e analisi del segnale Il sistema utilizzato è dotato di un quattro unità laser a diodi e un&#39;immagine multi-tinto per un massimo di quattro coloranti fluorescenti per ciascun campione. Il sistema può eseguire una mappatura un&#39;immagine (ingrandimento 10X) che fornisce una panoramica del campione su cui si può muovere per osservare una regione di interesse (600X ingrandimenti). <ol><li> Tempo di imaging lapse <ol><li> Posizionare le specimens (la diapositiva camera contenente i campioni colorati) sulla stanza buia dell&#39;incubatore integrato confocale (37 ° C, 5% di CO 2 e atmosfera umida). </li><li> Selezionare i laser corrispondenti. Utilizzare le due sorgenti laser 473 nm (15 mW) e 559 nm (18 mW) per eccitare Calceina e EthD-1. </li><li> Utilizzare una modalità a due sequenziale di acquisire immagini attraverso sequenze di linea senza crosstalk nella diagnostica per immagini con i due coloranti fluorescenti usati. </li><li> Utilizzare un rivelatore con uno spettro di nuova concezione per impostare automaticamente le condizioni in conformità con il colorante fluorescente in unità di scansione. </li><li> Ottimizzare le larghezze di banda di fluorescenza rilevata per ogni canale al massimo. Registra tutte le acquisizioni in sequenza per evitare il potenziale di cross-talking. </li><li> Selezionare le condizioni di imaging più adatte in base alla selezione colorante fluorescente utilizzando il software di acquisizione. </li><li> Acquisire un&#39;immagine di mappa che viene creata automaticamente dal centro, in un percorso a spirale,con l&#39;area di interesse essere facilmente selezionati per un esame più approfondito. </li><li> Selezionare la modalità di osservazione. Selezionare fino a cinque tipi di modalità di osservazione, tra cui time-lapse, Z-stack, e multi-zona a seconda delle necessità. Utilizzare una combinazione di modi time-lapse Z-stack e nel presente studio e completare rapidamente l&#39;acquisizione di immagini, </li><li> Modificare e cambiare il colorante fluorescente. In alternativa, sovrapporre la fluorescenza e le immagini a contrasto di luce con l&#39;altro. Osservare l&#39;immagine dal vivo con il punto selezionato sulla schermata della mappa in basso a sinistra. </li><li> Determinare l&#39;area di esposizione utilizzando l&#39;inquadratura e le funzioni di zoom. Facoltativamente, passare tra le visualizzazioni per ogni tipo di fluorescenza del colorante. NOTA: Il microscopio utilizzato in questo protocollo ha la stessa funzionalità di alto confocale tradizionale in un design compatto. Il microscopio è dotato di obiettivi di acqua-immersion invertiti considerate ottimali per stabile time-lapse imaging di cellule vive con un incubatore built-in semplificato. </li&gt; </ol></li><li> Analisi del segnale e quantificazione <ol><li> Utilizzare il software di imaging per quantificare il segnale di fluorescenza. Ottenere cinque immagini mappa con l&#39;obiettivo 10X sia testato campione e cellule di controllo. </li><li> Ottenuto 1.024 × 1.024 pixel immagini regolari, con una dimensione di 0,231 micron × 0,231 micron pixel. Memorizzare immagini come Formato Olympus immagine (OIF) per l&#39;analisi dei segnali. Questo formato consente di memorizzare varie impostazioni dei parametri e le immagini insieme. Utilizzare diversi strumenti di analisi (misura del profilo di intensità, rapporto di intensità tra i due canali utilizzati). </li><li> Conservare le immagini di proiezione massime come file TIFF a 12 bit / pixel. </li><li> Preforme analisi statistiche utilizzando il software comandante R. Analizzare le differenze con l&#39;analisi a senso unico della varianza (ANOVA) con un test di ripetizione. Riportare i risultati come media deviazione standard (± SD) e significatività statistica p &lt;0.05. </li></ol></li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti, non hanno nulla da rivelare.

Comportamento del materiale biocompatibilità è il parametro più prerequisito per essere valutato prima uso medico. Norme internazionali riguardano dispositivi medici ISO 10993 33 e in particolare materiali dentali ISO 7405 34. L&#39;assenza di effetti tossici alle cellule circostanti è la norma chiave nella valutazione biocompatibilità di tali materiali. Ecco perché i test di citotossicità ha tale importanza nella valutazione del materiale dentale biocompatibilità 35-37. L&#39;ISO ha suggerito metodi di prova possono essere basati sull&#39;attività metabolica o l&#39;integrità della membrana. Endpoint selezionati devono seguire specifiche condizioni di Classifica effetti negativi indotti da un materiale di prova in modo da minimizzare il tempo e il costo dei test di valutazione. L&#39;attuale metodo di indagine (3D tempo confocale lapse) è l&#39;integrità della membrana base. La valutazione di citotossicità tramite questo endpoint sembra essere un valido indicatore di biocompa cellularepatibilità con materiali testati ed è anche ISO approvato endpoint. In vitro test sono progettati per determinare come un campione di materiale riguarda un particolare tipo di cellula. Il saggio colorimetrico MTT è stato originariamente descritto da Mossman (1983) come un metodo utile per la misura della citotossicità in vitro e proliferazione cellulare. Il test MTT è basato sulla conversione del sale di tetrazolio in cristalli di formazano dalle cellule attive, che determina l&#39;attività mitocondriale. Questo può essere tradotto dal tasso vitalità 38. Gupta e collaboratori hanno riportato che il test MTT è il metodo più utilizzato per misurare la citotossicità delle resine composite. Succinico deidrogenasi e le risposte di fosfatasi alcalina sono stati utilizzati anche per lo stesso scopo 39. Tuttavia, le cellule destino non possono essere seguiti, poiché il saggio MTT richiede uccidere le cellule in ogni punto di misura. Per monitorare più da vicino il comportamento delle cellule colorate in questo studio, diè stata effettuata l&#39;osservazione rect di cellule vive, grazie al tempo di imaging lasso CLSM combinato con una breve colorazione protocollo, l&#39;analisi automatica di immagini e la quantificazione del segnale fluorescente. Compositi dentali entrano in stretto contatto con i tessuti orali, in particolare le cellule gengivali e pulpari. I fibroblasti potrebbero essere bersaglio di componenti rilasciati da questi compositi da restauro 40-41. Inoltre, diversi studi hanno riportato che le cellule immortali e le cellule primarie possono avere diverse risposte cellulari a contatto con biomateriali. Cellule primarie sono risultati essere più opportuno valutare biomateriali effetti 42. Questo spiega l&#39;uso di cellule di fibroblasti gengivali umani primari come modello cellulare per valutare la citotossicità del composito dentale testati in questo studio. Il potenziale tossicità delle sostanze rilasciate dal composito dentale è stato ampiamente studiato 43-44. Per valutare tegli citotossica potenziale dei materiali, due celle modello di contatto potrebbe essere eseguita. Nel sistema modello diretto contatto il materiale viene posto direttamente con le cellule bersaglio mentre nel sistema contatti indiretti, le cellule bersaglio sono in contatto con eluisce da supporti biologica. Nelle applicazioni cliniche e per le procedure di restauro, composito dentale sono messi in contatto diretto con i tessuti gengivali. Per questo motivo, il protocollo sperimentale attuale è focalizzata sul sistema di contatto indiretto con fibroblasti gengivali umani (cellule in presenza di estratti composti testati). Come precedentemente riportato da Dahl e collaboratori, le risposte di citotossicità sono stati classificati come gravi (&lt;30%), moderata (30-60%), leggero (60-90%) o non-citotossico (&gt; 90%) in base alla relativa attività di valori ottenuti per i controlli 45. Pertanto, secondo questa classifica e alla luce dei risultati ottenuti (Tabella 1), composito ELS bassissima ritiro può essere classificato come very leggermente citotossici e ha mostrato un comportamento simile alle cellule di controllo durante l&#39;intero periodo di lasso di tempo. Utilizzando il proprio stesso metodo di indagine, i risultati di questo studio potrebbero essere paragonate a quelle di uno studio recente pubblicato. L&#39;ELS bassissima ritiro composito dimostrato biocompatibilità superiore rispetto ai due composti precedentemente testati utilizzati per la stessa applicazione clinica che è la restaurazione diretta 11. Ulteriori studi sono ancora necessari per stabilire più completo confronto. Al momento di decidere che citotossicità test per l&#39;approvazione di una valutazione specifica endpoint, è importante capire i vantaggi ei limiti di ogni test. Lo scopo principale della confocale è realizzare un&#39;architettura 3-D di cellule e organi. La tecnica è in grado di rivelare non solo la superficie di un campione, ma anche la sua sottosuolo. Il protocollo qui descritto evidenzia l&#39;uso del 3D CLSM tempo di imaging lapse confocale, come SensiMetodo tivo per valutare il comportamento di biocompatibilità in vitro di un composito dentale. Tuttavia, al fine di evitare le limitazioni incontrate in questo lavoro, workstation antivibranti potrebbero essere utilizzati al fine di consentire l&#39;imaging più stabile e più lungo periodo; il piano del tavolo potrebbe isolare il sistema confocale utilizzato dagli effetti dannosi che le vibrazioni in laboratorio possono causare. Inoltre, i materiali da utilizzare nella cavità orale dovrebbe idealmente essere innocuo per i tessuti gengivali e non devono contenere sostanze che potrebbero causare tossicità sistemica. Conformemente alla metodologia utilizzata ed i risultati ottenuti dal presente studio si può concludere che il composto testato (ELS bassissima ritiro) non è citotossica nelle presenti condizioni sperimentali. Dato che il metodo CLSM può dare sensibilmente il tasso iniziale di cellule vitali, altre possibilità potrebbero prevedere per valutare più endpoint. In particolare, come è stato recentemente riportato che i monomeri compositi colpiscono le cellule thrOugh specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS) 46- 48, sono necessarie ulteriori indagini per valutare le correlazioni eventuale citotossicità tra le reti e la produzione di ROS segnalazione. Il protocollo futuro potrebbe essere progettato per valutare contemporaneamente la produzione di ROS (H 2 O 2 e / o O 2 - colorazione) e il rapporto di citotossicità (Live colorazione / morti) con tempo di imaging lasso CLSM.

Uno dei principali standard indicati nelle raccomandazioni ISO per definire biocompatibilità è l&#39;assenza di tossicità materiale per le cellule. Compositi dentali a base di resine possono rilasciare i componenti dalla matrice resinosa, che potrebbe essere inizialmente a causa di polimerizzazione parziale, e / o in seguito a causa di processi di degradazione nel tempo 1-4. Questi componenti rilasciati venire a contatto con i tessuti orali e possono avere vari inconvenienti, come orticaria e reazioni della mucosa 5, lo sviluppo di reazioni allergiche e di ipersensibilità in pazienti 6, modifiche di fibroblasti gengivali morfologia e riduzione di collagene di tipo I di proteine ​​7, immunosoppressione o Immunostimolazione su mitogeno -driven proliferazione di purificate linfociti T e delle cellule della milza 8 e danni al DNA in fibroblasti gengivali umani primari, che sottolinea il loro potenziale genotossico 9. Molti parametri possono influenzare la tossicità composito dentale, come l&#39;ombra del composite, la fotopolimerizzazione, la composizione chimica del monomero della resina, il riempimento e il grado di conversione 10- 13. Dal potenziale tossico in vitro dei materiali può prevedere in situazioni in vivo e potrebbe essere paragonato a situazioni cliniche da parte lo studio di alcuni endpoint rilevanti. La citotossicità di compositi dentali e dei loro componenti sono stati ampiamente valutati usando sistemi di colture cellulari 14- 16. Questi sistemi in vitro sono stati sviluppati per valutare compositi dentali biocompatibilità in termini di: crescita cellulare e l&#39;apoptosi delle cellule utilizzando THP-1monocytes come le cellule 17, citotossicità in fibroblasti gengivali umani 18, potenziale infiammatorio in HaCaT cheratinociti come le cellule 2, la funzionalità delle cellule odontoblast- come MDPC-23 cellule 19, la riduzione dei livelli di RNA totale, e aumento significativo di induzione di apoptosi in gengivale cheratinociti umani 20 eDanno al DNA in fibroblasti gengivali e polpa di cellule 21. Diverse metodologie sono suggeriti per studiare la biocompatibilità dei materiali compositi dentali. Saggi colorimetrici, che coinvolgono coloranti specifici e misurazioni di assorbimento di luce, rimangono i più comunemente utilizzati, per la loro relativa semplicità e basso costo 22- 26. Analisi al microscopio per contrasto luce consuma spesso più tempo e comporta costi più elevati. Tuttavia, queste tecniche di microscopia presentano alcuni importanti vantaggi. L&#39;osservazione della struttura cellulare fornisce informazioni estese sugli effetti tossici esperti, fornendo così dati più rilevanti e sensibili. In particolare, l&#39;introduzione di microscopia confocale 27 ha permesso l&#39;osservazione delle strutture biologiche con il miglioramento risoluzione assiale rispetto al livello di campo tradizionali microscopi a fluorescenza. Quindi, l&#39;imaging confocale è diventato un potente strumento di indagine in diversi campi diricerche mediche e scientifiche. In contrasto con tecniche di microscopia elettronica a scansione microscopia confocale offre la possibilità di visualizzare componenti distinti di cellule per incorporazione di marcatori fluorescenti specifici. La maggior parte di questi traccianti specifici sono stabili in ambiente acquoso, sensibilmente misurabili, poco costoso e non tossico 28, permettendo il loro uso in clinica e ricerche di laboratorio. Inoltre, l&#39;essiccamento del campione e la fissazione richiesto per convenzionale analisi al microscopio elettronico non è necessaria per tempo di imaging lapse confocale, rilevamento così dipendente dal tempo è possibile anche su campioni. Rispetto alle immagini bidimensionali, il principio confocale consente una visualizzazione esemplare sottosuolo e la struttura ricostruzione tridimensionale delle diverse immagini in profondità ottenuti; che provocano, più precise e più strutturali particolari 29, 30. Il presente studio video è un esempio dell&#39;uso di tridimensionale Time-lapse Confocal Laser Scanning Microscopy (3D-CLSM) in combinazione con l&#39;etichettatura Live / Dead fluorescenti e la quantificazione del segnale come un metodo innovativo. La tecnica presentata in questo documento ha il vantaggio di consentire la valutazione e time-lapse sensibili di imaging di cellule vive senza modificare la struttura cellulare della valutazione. Non ci sono fasi di preparazione sono necessari prima dell&#39;analisi confocale. In precedenza, la stessa colorazione è stata utilizzata per valutare la vitalità delle colture nuclei spongiosa 31 ma senza confocale time-lapse seguente. Allo stesso modo la stessa procedura di time-lapse confocale è stato utilizzato per valutare l&#39;attività eritromicina tempo-kill nei batteri dei fanghi attivi in base al loro tipo Gram 32 utilizzando uno specifico batteri vivi / morti colorazione. Questi metodi sono stati recentemente adattato e utilizzato per confrontare la tossicità dei compositi dentali a base di monomeri di metacrilato 11.

<table><tbody><tr><td>Olympus Fluoview FV10i&nbsp;</td><td>Microscopio confocale</td> <td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>O2/CO2 Incubatore</td><td>Pnasonic</td><td>MCO 5M</td><td>Incubazione cellulare</td></tr><tr><td>Kit vivo/morto</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>MP 03224</td><td>Macchia</td></tr><tr><td>ELS a bassissimo ritiro &nbsp;</td><td>Saremco</td><td></td><td>Composito dentale</td></tr><tr><td>DMEM medio</td><td>Sigma</td><td>D 6046</td><td>Terreno di coltura</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td>T1426</td><td>sistema di scorrimento a camera delle cellule di raccolta</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>PAA</td><td>14220040X</td><td>Camera di coltura</td></tr><tr><td>penicillina/streptomicina</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Amfotericina B</td><td>PAA</td><td>P11-001</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino&nbsp;</td><td>PAA</td><td>A11-101</td><td>Contatore</td></tr><tr><td>di cellule</td> per colture cellulari <td>Merck Millipore</td><td>00110230TP1</td><td>Conteggio delle cellule&nbsp;</td></tr></tbody></table>

confocale time lapse imaging come un metodo efficiente per la valutazione citocompatibilità di compositi dentali

Confocal Time Lapse Imaging as an Efficient Method for the Cytocompatibility Evaluation of Dental Composites

E &#39;generalmente accettato che l&#39;interazione in vitro materiale cella è un criterio utile nella valutazione di materiale dentale biocompatibilità. L&#39;obiettivo di questo studio è stato quello di utilizzare 3D CLSM tempo di imaging lasso confocale per valutare la biocompatibilità in vitro di compositi dentali. Questo metodo fornisce un&#39;indicazione precisa e sensibile della frequenza di cellule vitali in contatto con estratti compositi dentali. L&#39;ELS in più basso ritiro, un composito dentale usato per restauro diretto, è stato preso come esempio. In vitro valutazione è stata effettuata su cellule di fibroblasti umani in coltura primarie gengivali utilizzando Live / colorazione Morto. Le immagini sono state ottenute con il sistema invertito confocale biologico FV10i e analizzati con il software 3.1 FV10-ASW. L&#39;analisi delle immagini mostrava un leggero citotossicità in presenza del composto testato dopo 5 ore di time lapse. Una leggera diminuzione della vitalità cellulare è stato mostrato in contatto con il composito estratti Compar testatoed alle cellule di controllo. I risultati hanno evidenziato l&#39;uso del 3D CLSM immagini time lapse come metodo sensibile per valutare qualitativamente e quantitativamente il comportamento biocompatibilità dei compositi dentali.

La figura 1 mostra una panoramica dei morti cellule vive / colorate nelle immagini ottenute mappatura (obiettivo 10 volte) sia per il controllo e cellule esposte agli estratti composti testati (ELS bassissima ritiro). La struttura tridimensionale delle cellule può essere visualizzato alla 600X ingrandimento. Visualizzazione di cellule raccolte nella camera di controllo e di cellule raccolte nella camera alla presenza degli estratti compositi testati è presentato nella figura 2. La sporgenza massima (obiettivo 60X) mostra il destino di popolazioni cellulari selezionate all'inizio del time lapse (a 15 min) e alla fine del periodo di intervallo di tempo (in 5 ore). Cinquanta sette pile di immagini (xyzt scansione mod, 39 immagini per ogni stack, voxel-profondità 1,00 micron) sono stati ottenuti in questo periodo. Una leggera diminuzione del segnale fluorescente verde e molto leggera variazione nella fluorescenza rossa sono stati ottenuti in cellule esposte. Nessuna variazione significativa è stata osservata per il controllocellule. Cellule estratti esposte compositi assunto simile morfologia del mandrino alle cellule di controllo; morfologia non è stata alterata in queste condizioni sperimentali (nonostante la diminuzione segnale verde e l'aumento del segnale rosso in presenza del composto testato). L'analisi delle immagini è stata eseguita su cinque diversi stack di immagini selezionate corrispondenti alle diverse popolazioni cellulari delle immagini ottenute per il composito testato rispetto alle cellule di controllo negativo per il segnale verde e rosso. Il profilo di intensità di cellule colorate è illustrato nella figura 3; l'evoluzione segnale verde e rosso delle cellule a contatto con il composito testato era paragonabile a quelli di cellule di controllo. Calceina e EthD-1 fluorescenza intensità di emissione sono stati misurati in cellule di controllo e in cellule esposte compositi. La misurazione è stata eseguita a intervalli di un ora per fino a cinque ore. Il rapporto verde / rosso di fluorescenza (sulla base di intensità integrata del verde 495-515 nm e 620-650 rossi segnali nm) È stata calcolata durante il periodo di time-lapse. Gli indici di redditività per il controllo e cellule esposte a ELS estratti bassissima contrazione sono mostrati in grado T 1. In presenza del composito testato, la percentuale di cellule vive è stato trovato per diminuire leggermente dal 100% al 93,9% dopo 1 ora di contatto. Differenza significativa è stata osservata tra il composito testato e il controllo negativo (cellule senza estratti compositi) dopo 5 ore del periodo di time-lapse indicato. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/51949/51949fig1highres.jpg"> Figura 1: Panoramica immagine mappatura delle cellule ha mostrato macchiato di obiettivo 10X, (A), le cellule di controllo e (B), le cellule in presenza di estratti compositi (ELS bassissima contrazione) per l'inizio del periodo di intervallo di tempo (t = 15 min). Le aree verdi sono cellule vive e zone rosse sono le cellule danneggiate. In questocondizioni sperimentali, nessuna variazione (sia per fluorescenza verde e rosso) è stato osservato per compositi esposti cellule rispetto alle cellule di controllo negativo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51949/51949fig2highres.jpg"> Figura 2: immagini CLSM a obiettivo 60X di una popolazione di cellule da (A) e la camera di controllo (B) estratti compositi camera all'inizio e alla fine del periodo di esposizione time-lapse (I: 15 min e II: 5 ore, rispettivamente, ). Le aree verdi sono cellule vive e zone rosse sono le cellule danneggiate. Il pannello delle immagini dimostrata leggero cambiamento nel segnale di intensità (leggera diminuzione del segnale verde e molto leggero aumento quello rosso). Nessuna alterazione morfologia cellulare sono stati osservati in presenza di estratti compositi; esporre le cellule mantenuto la loro morfologia a forma di fuso e fibroblastica come cellule di controllo. Figura 3: Profilo Linea di cellule osservate in microscopia time-lapse cellule (A) di controllo (B), le cellule estratti composito a vista, (I) a 15 min e (II) a 5 ore.. Nessuna variazione visibile nell'evoluzione segnale verde in presenza del composto testato indipendentemente dal tempo di contatto. Tuttavia, leggero aumento del segnale rossa è stata osservata in presenza del composto dopo 5 ore di contatto. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Tempo di contatto (ora) </td><td colspan="5"> Vitalità cellulare (%) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Cellule di controllo </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 100 &lt;/ Td&gt; </td><td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> ELS in più basso ritiro ® </td><td> 93.9 ± 7 </td><td> 91,3 ± 5 * </td><td> 89.5 ± 3 * </td><td> 87,6 ± 2 * </td><td> 87,7 ± 3 * </td></tr></tbody></table> Tabella 1:. Corsi dal vivo HGF cellule evoluzione dopo 1, 2, 3, 4 e 5 ore di contatto con gli estratti di compositi La vitalità cellulare è stata valutata mediante colorazione utilizzando il kit di citotossicità Live / Dead. I dati mostrano i valori medi ± DS di cinque immagini stack analisi. I valori sono significativamente diversi da cellule di controllo con p &lt;0,05.

L&#39;aspetto più studiato della biocompatibilità dei compositi dentali è la loro citotossicità 3D CLSM lasso di tempo di imaging combinato con fluorescente quantificazione del segnale consente di valutare sensibile del destino delle cellule nel corso del tempo. Utilizzando questo metodo potrebbe essere uno strumento efficace per valutare la citocompatibilità di compositi dentali.

Confocale Time lapse imaging come un metodo efficiente per la valutazione citocompatibilità di compositi dentali

It is generally accepted that in vitro cell material interaction is a useful criterion in the evaluation of dental material biocompatibility. The ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare la microscopia a scansione laser confocale 3D per l'imaging time-lapse per valutare qualitativamente e quantitativamente la biocompatibilità in vitro dei compositi dentali. Ciò si ottiene prelevando prima campioni sferici di composito dentale non polimerizzato nella seconda fase. I fibroblasti gengivali umani vengono coltivati in presenza o in assenza di questi estratti compositi, quindi le cellule vengono marcate con colorazione morta viva.Vengono quindi generate immagini cartografiche delle colture cellulari e vengono create immagini sovrapposte per le aree di interesse. In definitiva, le differenze in tempo reale nel comportamento delle cellule che si verificano in presenza o in assenza dei compositi testati possono essere monitorate in base ai cambiamenti nei segnali fluorescenti verdi o rossi osservati nelle immagini. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti sono che consente il monitoraggio in tempo reale di cellule vive senza indurre cambiamenti nella struttura cellulare.Non sono necessarie fasi di fissazione o asciugatura dopo la colorazione delle cellule o prima dell'osservazione in time-lapse. Per preparare l'estratto di composito, iniziare utilizzando un supporto su misura con un raggio di due millimetri per formare campioni sferici del composito dentale non polimerizzato. Trasferire i campioni nei singoli pozzetti di una piastra a sei pozzetti contenente un millilitro di terreno di coltura, avendo cura di lasciare alcuni pozzetti con il solo terreno per le colture cellulari di controllo, quindi disporre una lampada a LED con un'intensità di 1070 milliwatt centimetro quadrato entro 0,5 millimetri dai campioni.Ha polimerizzato i campioni per 40 secondi per simulare il contatto temporaneo tra i denti e il composito dentale non curato, quindi ha incubato i campioni di composito per 24 ore in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Cambia il terreno ogni tre giorni e le celle di passaggio ogni cinque giorni. Quindi, dopo che la coltura ha raggiunto la cofluenza, raccogliere le cellule e farle girare per cinque minuti a 90 volte G e a 37 gradi Celsius.Risospendere il pellet nel terreno di coltura e, dopo aver contato le cellule, seminare la sospensione cellulare a una densità cellulare di 2,5 volte 10 per le quarte cellule per millilitro in un sistema di vetrini a camera durante la notte a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di anidride carbonica al 5%. La mattina successiva, sostituire il terreno in due pozzetti del vetrino della camera con un millilitro degli estratti compositi testati e riposizionare il vetrino nell'incubatore per visualizzare le cellule con la confocale. Imaging time-lapse.Per prima cosa etichettare le cellule composite co-coltivate e di controllo con la colorazione di citotossicità morta viva per cellule eucariotiche secondo le istruzioni del produttore. 15 minuti dopo la colorazione, posizionare il vetrino della camera al buio nella camera integrata confocale in condizioni di coltura cellulare e riscaldare i laser a 473 nanometri e 559 nanometri. Successivamente, utilizzare un rivelatore con uno spettro di nuova concezione per impostare automaticamente le condizioni di imaging per il laser a 473 nanometri.Utilizzare le funzioni di inquadratura e zoom per selezionare l'area di interesse, quindi scegliere la modalità di osservazione. Seleziona fino a cinque tipi di modalità di osservazione, tra cui Zack time-lapse e multi area secondo necessità, quindi acquisisci rapidamente cinque immagini della mappa con un laser a 473 nanometri sotto l'obiettivo 10 x sia per il campione di prova che per le celle di controllo quando sono state acquisite le immagini desiderate. Passa al laser a 559 nanometri e cattura le immagini della cellula alla seconda fluorescenza, come appena dimostrato.In alternativa, sovrapporre le immagini fluorescenti e quelle a contrasto di luce utilizzando il punto selezionato sullo schermo live dell'X 60 per osservare l'archivio delle immagini live. Le immagini della mappa nel formato di immagine Olympus per l'analisi del segnale e le immagini di proiezione massima sono di 24 bit per pixel. I file TIFF utilizzano quindi i diversi strumenti di analisi per misurare il profilo di intensità del segnale e il rapporto di intensità tra i due canali fluorescenti.Infine, analizzare le differenze nella segnalazione cellulare fluorescente tra i due gruppi con il software appropriato. In queste immagini cartografiche di cellule colorate TED vive in terreni da soli o esposti all'estratto composito, non sono state osservate differenze nella vitalità delle cellule a 15 minuti dall'inizio del periodo di time-lapse. Qui, le immagini di proiezione massimale delle cellule di controllo mostrano il destino ingrandito delle cellule entro i primi 15 minuti e cinque ore dopo, alla fine del periodo di time-lapse, come osservato, non c'è stata alcuna variazione significativa nella fluorescenza all'interno delle cellule di controllo durante il periodo di incubazione.Le celle esposte a bassissimo ritiro ELS hanno assunto una morfologia del fuso simile a quella delle celle di controllo, ma hanno mostrato una leggera diminuzione del segnale fluorescente verde e un aumento molto leggero della fluorescenza rossa alla fine del periodo di time-lapse. Il profilo di intensità delle cellule colorate è illustrato in questi grafici in cui le intensità di emissione di fluorescenza dell'omodimero dell'endotelio di calcio sono state misurate su cellule esposte di controllo e composite a intervalli di un'ora per un massimo di cinque ore. Non sono state osservate differenze significative nella segnalazione tra le due culture.I rapporti di vitalità per le celle composite di controllo ed esposte sono mostrati nella tabella. In presenza del composito testato, la percentuale di cellule vive è risultata diminuire leggermente dal 100 al 93,9% dopo un'ora di contatto dopo cinque ore. Sono state osservate differenze significative nella vitalità cellulare tra il composito testato ELS, il restringimento extra basso e le colture cellulari di controllo negativo nonostante la non citotossicità del composito.I dati attuali evidenziano l'uso dell'imaging time-lapse confocale come metodo accurato e sensibile per valutare il comportamento dei fibroblasti gen a contatto con i compositi dentali dopo il suo sviluppo. Questo metodo è un modo privato per i ricercatori nel campo della tossicologia di esplorare la citotossicità e la valutazione del rischio di materiali dentali, farmaci, sostanze chimiche e altri dispositivi medici.

confocal-time-lapse-imaging-as-an-efficient-method-for

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Fonte: Parker, J. J., et al. Un modello di coltura a fette organotipiche di glioblastoma umano per lo studio della migrazione delle cellule tumorali e degli effetti specifici del paziente dei farmaci anti-invasivi. J. Vis. Exp. (2017)Questo video mostra l'imaging di fette di tessuto di glioblastoma che esprimono la proteina fluorescente verde (GFP) tramite microscopia confocale. Le immagini ad alta risoluzione vengono acquisite a intervalli coerenti per tracciare il movimento e la direzione...

Imaging della migrazione delle cellule tumorali nel tessuto del glioblastoma mediante microscopia confocale a scansione time-lapse

Viene presentato un protocollo per la quantificazione e il confronto simultaneo di tre componenti cellulari ed extracellulari all'interno di biofilm. La metodologia prevede l'uso della microscopia a scansione laser confocale, del software di analisi e visualizzazione strutturale del biofilm e del software di analisi statistica.

Quantificazione concomitante di cellulare e extracellulare componenti del biofilm

In questo studio, sarà discusso l'uso di un dispositivo in situ loading accoppiato con tomografia micro-computerizzata a raggi X per la biomeccanica articolare fibrosi. Letture sperimentali identificabili con una variazione complessiva delle biomeccanica articolare saranno: 1) forza reazionaria contro lo spostamento, vale a dire lo spostamento del dente nella presa alveolare e la sua risposta reazionaria a carico, 2) tridimensionale (3D) configurazione spaziale e morfometria, cioè geometrico...

In situ carico di compressione e Correlativo imaging non invasiva del Bone-parodontale legamento-dente Fibrosa comune

Per capire lo sviluppo territoriale dello stress da polimerizzazione nei restauri resina composita dentale, Digital Image Correlation è stato utilizzato per fornire a tutto campo la misura dello spostamento / deformazione del modello cavità vetro restaurate correlando le immagini del restauro prese prima e dopo la polimerizzazione.

Restringimento della Dental composito in simulata cavità misurato con Digital Image Correlation

Qui, presentiamo un protocollo per la valutazione di biofilm orali su materiali di titanio e ossido di zirconio per i pilastri di protesi dentarie, compresa l'analisi di attuabilità delle cellule batteriche e caratteristiche morfologiche. Un modello in situ associato con tecniche di microscopia potente viene utilizzato per l'analisi di biofilm orale.

Formazione di Biofilm orali su differenti materiali per impianti dentali

Presentiamo un protocollo per l'utilizzo della microscopia laser confocale a fibre ottiche (CLM) per studiare in modo non invasivo la distribuzione spazio-temporale dei liposomi nell'occhio dopo iniezione subcongiuntivale.

Imaging in vivo spazio-temporale di sistemi di somministrazione di farmaci oculari mediante microscopia laser confocale a fibre ottiche

La tecnica di identificazione assistita da fluorescenza è un approccio praticabile, rapido e affidabile per la differenziazione dei restauri in resina composita dalla sostanza dentale e facilita la rimozione minimamente invasiva e completa dei restauri in resina composita e delle stecche traumatiche legate in composito.

Rilevamento e rimozione della resina composita colorata dei denti utilizzando la tecnica di identificazione assistita da fluorescenza

Questa metodologia consente di applicare un apparecchio dentale su qualsiasi campione con qualsiasi angolazione con forza e stabilità standardizzate. Questo approccio potrebbe essere ampiamente utilizzato nelle scienze della salute per standardizzare gli impatti delle apparecchiature odontoiatriche con elementi che tengono le mani come micromotori, turbine e ablatori a ultrasuoni su varie superfici.

Impatto della rugosità dell'ablatore dentale piezoelettrico su due distinti materiali di otturazione compositi fluidi

Vi presentiamo un nuovo approccio per quantificare la localizzazione delle nanoparticelle nei vasi di tumori umani xenotrapiantati utilizzando dinamica, imaging in tempo reale intravitale in un modello di embrione aviaria.

Valutazione della captazione nanoparticelle nei tumori in tempo reale utilizzando intravitale Imaging

Time-lapse imaging viene utilizzato per valutare il comportamento di primarie preneoplastiche cellule epiteliali mammarie derivate da modelli murini geneticamente modificati di rischio di cancro al seno per determinare se ci sono correlazioni tra i parametri specifici di comportamento e distinte lesioni genetiche.

Time-lapse imaging di primaria preneoplastiche cellule epiteliali mammarie Derivato da modelli murini geneticamente modificati di cancro al seno

Scopri come valutare la citocompatibilità di compositi dentali con microscopia confocale 3D e time-lapse imaging. Questo metodo consente il monitoraggio in tempo reale del comportamento cellulare senza alterare la struttura.

Confocale Time lapse imaging come un metodo efficiente per la valutazione citocompatibilità di compositi dentali

Esplora altri video