Confocale Time lapse imaging come un metodo efficiente per la valutazione citocompatibilità di compositi dentali

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare la microscopia a scansione laser confocale 3D per l'imaging time-lapse per valutare qualitativamente e quantitativamente la biocompatibilità in vitro dei compositi dentali. Ciò si ottiene prelevando prima campioni sferici di composito dentale non polimerizzato nella seconda fase. I fibroblasti gengivali umani vengono coltivati in presenza o in assenza di questi estratti compositi, quindi le cellule vengono marcate con colorazione morta viva.

Vengono quindi generate immagini cartografiche delle colture cellulari e vengono create immagini sovrapposte per le aree di interesse. In definitiva, le differenze in tempo reale nel comportamento delle cellule che si verificano in presenza o in assenza dei compositi testati possono essere monitorate in base ai cambiamenti nei segnali fluorescenti verdi o rossi osservati nelle immagini. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti sono che consente il monitoraggio in tempo reale di cellule vive senza indurre cambiamenti nella struttura cellulare.

Non sono necessarie fasi di fissazione o asciugatura dopo la colorazione delle cellule o prima dell'osservazione in time-lapse. Per preparare l'estratto di composito, iniziare utilizzando un supporto su misura con un raggio di due millimetri per formare campioni sferici del composito dentale non polimerizzato. Trasferire i campioni nei singoli pozzetti di una piastra a sei pozzetti contenente un millilitro di terreno di coltura, avendo cura di lasciare alcuni pozzetti con il solo terreno per le colture cellulari di controllo, quindi disporre una lampada a LED con un'intensità di 1070 milliwatt centimetro quadrato entro 0,5 millimetri dai campioni.

Ha polimerizzato i campioni per 40 secondi per simulare il contatto temporaneo tra i denti e il composito dentale non curato, quindi ha incubato i campioni di composito per 24 ore in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Cambia il terreno ogni tre giorni e le celle di passaggio ogni cinque giorni. Quindi, dopo che la coltura ha raggiunto la cofluenza, raccogliere le cellule e farle girare per cinque minuti a 90 volte G e a 37 gradi Celsius.

Risospendere il pellet nel terreno di coltura e, dopo aver contato le cellule, seminare la sospensione cellulare a una densità cellulare di 2,5 volte 10 per le quarte cellule per millilitro in un sistema di vetrini a camera durante la notte a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di anidride carbonica al 5%. La mattina successiva, sostituire il terreno in due pozzetti del vetrino della camera con un millilitro degli estratti compositi testati e riposizionare il vetrino nell'incubatore per visualizzare le cellule con la confocale. Imaging time-lapse.

Per prima cosa etichettare le cellule composite co-coltivate e di controllo con la colorazione di citotossicità morta viva per cellule eucariotiche secondo le istruzioni del produttore. 15 minuti dopo la colorazione, posizionare il vetrino della camera al buio nella camera integrata confocale in condizioni di coltura cellulare e riscaldare i laser a 473 nanometri e 559 nanometri. Successivamente, utilizzare un rivelatore con uno spettro di nuova concezione per impostare automaticamente le condizioni di imaging per il laser a 473 nanometri.

Utilizzare le funzioni di inquadratura e zoom per selezionare l'area di interesse, quindi scegliere la modalità di osservazione. Seleziona fino a cinque tipi di modalità di osservazione, tra cui Zack time-lapse e multi area secondo necessità, quindi acquisisci rapidamente cinque immagini della mappa con un laser a 473 nanometri sotto l'obiettivo 10 x sia per il campione di prova che per le celle di controllo quando sono state acquisite le immagini desiderate. Passa al laser a 559 nanometri e cattura le immagini della cellula alla seconda fluorescenza, come appena dimostrato.

In alternativa, sovrapporre le immagini fluorescenti e quelle a contrasto di luce utilizzando il punto selezionato sullo schermo live dell'X 60 per osservare l'archivio delle immagini live. Le immagini della mappa nel formato di immagine Olympus per l'analisi del segnale e le immagini di proiezione massima sono di 24 bit per pixel. I file TIFF utilizzano quindi i diversi strumenti di analisi per misurare il profilo di intensità del segnale e il rapporto di intensità tra i due canali fluorescenti.

Infine, analizzare le differenze nella segnalazione cellulare fluorescente tra i due gruppi con il software appropriato. In queste immagini cartografiche di cellule colorate TED vive in terreni da soli o esposti all'estratto composito, non sono state osservate differenze nella vitalità delle cellule a 15 minuti dall'inizio del periodo di time-lapse. Qui, le immagini di proiezione massimale delle cellule di controllo mostrano il destino ingrandito delle cellule entro i primi 15 minuti e cinque ore dopo, alla fine del periodo di time-lapse, come osservato, non c'è stata alcuna variazione significativa nella fluorescenza all'interno delle cellule di controllo durante il periodo di incubazione.

Le celle esposte a bassissimo ritiro ELS hanno assunto una morfologia del fuso simile a quella delle celle di controllo, ma hanno mostrato una leggera diminuzione del segnale fluorescente verde e un aumento molto leggero della fluorescenza rossa alla fine del periodo di time-lapse. Il profilo di intensità delle cellule colorate è illustrato in questi grafici in cui le intensità di emissione di fluorescenza dell'omodimero dell'endotelio di calcio sono state misurate su cellule esposte di controllo e composite a intervalli di un'ora per un massimo di cinque ore. Non sono state osservate differenze significative nella segnalazione tra le due culture.

I rapporti di vitalità per le celle composite di controllo ed esposte sono mostrati nella tabella. In presenza del composito testato, la percentuale di cellule vive è risultata diminuire leggermente dal 100 al 93,9% dopo un'ora di contatto dopo cinque ore. Sono state osservate differenze significative nella vitalità cellulare tra il composito testato ELS, il restringimento extra basso e le colture cellulari di controllo negativo nonostante la non citotossicità del composito.

I dati attuali evidenziano l'uso dell'imaging time-lapse confocale come metodo accurato e sensibile per valutare il comportamento dei fibroblasti gen a contatto con i compositi dentali dopo il suo sviluppo. Questo metodo è un modo privato per i ricercatori nel campo della tossicologia di esplorare la citotossicità e la valutazione del rischio di materiali dentali, farmaci, sostanze chimiche e altri dispositivi medici.