Name: Quantificazione concomitante di cellulare e extracellulare componenti del biofilm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-10T20:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Impara a quantificare i componenti cellulari ed extracellulari dei biofilm con microscopia confocale e analisi statistica. Questo metodo consente di valutare gli effetti di agenti antibatterici sulla struttura tridimensionale dei biofilm.

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Il finanziamento per questo studio è stato fornito dal National Institutes of Health/NIDCR grant 1R15DE019566-01A1. Jim Henthorn (OUHSC Flow and Image Cytometry Laboratory) è noto per aver fornito assistenza tecnica con la microscopia a scansione laser confocale. Il Dr. Fernando Esteban Florez (Dipartimento di Materiali Dentali) è riconosciuto per aver fornito assistenza tecnica durante le riprese di questo video.

1. Preparazione di mezzi e reagenti
<ol>
	<li>Preparare 300 ml di terreno di coltura notturno (THY; brodo Todd Hewitt al 3% preparato secondo le istruzioni del produttore, integrato con estratto di lievito allo 0,3% in acqua ultrapura) e sterilizzare in autoclave. Conservare a temperatura ambiente per un massimo di 2 mesi.</li>
	<li>Preparare 1 L di agar THY (brodo Todd Hewitt al 3%, estratto di lievito allo 0,3%, agar al 1,5% in acqua ultrapura), sterilizzare in autoclave e raffreddare a 60 °C prima di versare nelle piastre di Petri. Conservare a 4 °C per un massimo di 3 mesi.</li>
	<li>Preparare 150 ml di terreno di crescita per biofilm (TY 0,5X integrato con saccarosio 10 mM; triptone 1,5%, estratto di lievito 0,5% e saccarosio 10 mM in acqua ultrapura) e sterilizzare per filtrazione. Conservare a temperatura ambiente per un massimo di 1 mese.</li>
	<li>Preparare 1 L di soluzione salina tamponata al fosfato (PBS; 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na2HPO4 e 0,24 g di KH2PO4 in acqua ultrapura) e sterilizzare in autoclave. Conservare a temperatura ambiente per diversi mesi.</li>
	<li>Preparare 600 ml di tampone Tris HCl 10 mM integrato con CaCl2 10 mM in acqua ultrapura (tampone TC; pH 7,2) e sterilizzare in autoclave. Conservare a temperatura ambiente per diversi mesi.</li>
	<li>Sterilizzare in autoclave 1 L di acqua ultrapura. Conservare a temperatura ambiente per diversi mesi.</li>
</ol>
2. Fabbricazione del campione
<ol>
	<li>Preparare campioni di forma discoidale dei compositi dentali in resina Point 4 (PF) e TPH3 (TP) in uno stampo cilindrico in acciaio inox su due strati. Ogni strato viene polimerizzato con luce per 40 secondi utilizzando un'unità di polimerizzazione a LED. I due prodotti hanno composizioni e livelli di carica leggermente diversi, producendo così diverse topografie superficiali sulle quali verranno coltivati i biofilm.
	<ol>
		<li>I campioni dei substrati rilevanti possono essere preparati seguendo protocolli consolidati di altre discipline al posto del passaggio 2.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Levigare e lucidare i campioni fino a ottenere una finitura superficiale accettabile, ad es. utilizzando una macchina levigatrice-lucidatrice semiautomatica. Risciacquare i campioni lucidati con acqua ultrapura e asciugarli con aria compressa.</li>
	<li>Sterilizzare i campioni mediante gas di ossido di etilene o un metodo di sterilizzazione alternativo.</li>
</ol>
3. Crescita del biofilm
<ol>
	<li>Inoculare una singola colonia di S. mutans in 4 ml di mezzo di coltura notturna (passaggio 1.1). Incubare tutta la notte a 37 °C per 16-18 ore. La densità ottica (OD600) della coltura dovrebbe essere ≥0,9.
	<ol>
		<li>È preferibile utilizzare una colonia proveniente da colture su piastra passate due volte da un ceppo originale, poiché ciò determina una crescita del biofilm più uniforme.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparare una diluizione 1:100 utilizzando la coltura notturna (passaggio 1.1) in 10 ml di mezzo di crescita del biofilm (passaggio 1.3).</li>
	<li>Trasferire campioni sterili di composito in resina (e.g. PF, TP) in piastre sterili a 12 pozzetti.</li>
	<li>Aggiungere 2,5 ml di mezzo di coltura diluito (passaggio 3.2) nei pozzetti destinati ai gruppi trattamento (collutorio) e controllo. Aggiungere 2,5 ml di mezzo di crescita del biofilm sterile non inoculato nei pozzetti di controllo di sterilità.</li>
	<li>Fare crescere i biofilm in condizioni microaerofile. Posizionare le piastre su un agitatore a 100 rpm all'interno di un'incubatrice a 37 °C per 24 ore.</li>
	<li>Dopo 24 ore, aspirare asetticamente il mezzo da tutti i pozzetti e lavare due volte con PBS sterile (passaggio 1.4; 2,5 ml/pozzetto), aspirando il PBS dopo ogni lavaggio. Rinnovare 2,5 ml di mezzo fresco di crescita del biofilm in ciascun pozzetto e incubare per ulteriori 24 ore nelle stesse condizioni del passaggio precedente, per un tempo totale di crescita del biofilm di 48 ore.</li>
	<li>In alternativa ai passaggi sopra indicati, i biofilm di altre specie potrebbero essere coltivati su substrati utilizzando protocolli consolidati.</li>
</ol>
4. Trattamenti antibatterici/antinfiammatori per il collutorio
<ol>
	<li>Aspirare il mezzo dopo il completamento della crescita del biofilm.</li>
	<li>Aggiungere 2,5 ml di collutorio Biotène PBF (BIO) o Listerine Total Care (LTO), oppure un'altra modalità di trattamento, nei pozzetti dei gruppi trattati, e aggiungere 2,5 ml di acqua sterile ultrapura nel pozzetto del gruppo di controllo. Immergere i campioni per 60 secondi, seguendo le istruzioni del produttore, agitando le piastre su un agitatore orbitale a 150 rpm. Aspirare immediatamente sia il collutorio che l'acqua ultrapura dai pozzetti.</li>
	<li>Lavare i campioni 5 volte per 15 secondi ogni lavaggio con acqua sterile ultrapura sull'agitatore orbitale a 150 rpm, aspirando l'acqua dopo ogni passaggio di lavaggio.</li>
	<li>In alternativa ai passaggi sopra descritti, altri agenti antibatterici potrebbero essere testati utilizzando protocolli stabiliti.</li>
</ol>
5. Colorazione
<ol>
	<li>Preparare le diluizioni del colorante per l'analisi del biofilm.
	<ol>
		<li>Preparare una soluzione madre di Concanavalina A, coniugata con Alexa Fluor 647 (AF), a 5 mg/ml in bicarbonato di sodio 0,1 M a pH 8,3. Conservare a -20 °C in aliquote monouso per diversi mesi, poiché i cicli di congelamento e scongelamento sono sconsigliati. Utilizzando questa soluzione madre di AF, preparare una diluizione a 250 μg/ml in tampone TC.</li>
		<li>Preparare una diluizione a 10 μM partendo dalla soluzione madre di Syto 9 a 5 mM (SY), come fornita dal produttore, in tampone TC. Conservare la soluzione madre di SY rimanente a -20 °C per diversi mesi.</li>
		<li>Preparare una diluizione 10x partendo dalla soluzione madre di Sypro Red 5.000x (SR), come fornita dal produttore, in acqua sterile ultrapura. Conservare la soluzione madre di SR rimanente a -20 °C per diversi mesi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lavare tutti i biofilm 2 volte con tampone TC (2,5 ml/pozzetto), utilizzando un movimento rotatorio manuale, lasciando il secondo lavaggio nel piatto per 30 minuti a temperatura ambiente. Aspirare.</li>
	<li>Applicare una goccia di 50 μl del colorante AF su ciascun campione di biofilm. Colorare per 30 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Lavare 2 volte con tampone TC (2,5 ml/pozzetto), aspirando dopo ogni lavaggio.</li>
	<li>Applicare successivamente una goccia di 50 μl del colorante SY su ciascun campione di biofilm. Colorare per 30 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Lavare 2 volte con acqua sterile ultrapura (2,5 ml/pozzetto), aspirando dopo ogni lavaggio.</li>
	<li>Infine, applicare una goccia di 50 μl del colorante SR su ciascun campione di biofilm. Colorare per 30 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Lavare 3 volte con acqua sterile ultrapura (2,5 ml/pozzetto), aspirando dopo ogni lavaggio.</li>
	<li>Trasferire i campioni in una piastra a 6 pozzetti, posizionando un campione per pozzetto in 6 ml di acqua sterile ultrapura per facilitare la microscopia confocale.</li>
</ol>
6. Acquisizione di immagini mediante microscopia confocale a scansione laser
<ol>
	<li>Acquisire immagini di ciascun componente (colorazione) all'interno dei biofilm dei gruppi trattati e di controllo utilizzando le impostazioni del microscopio a scansione laser confocale indicate nella Tabella 1. In questo studio è stata utilizzata un'obiettivo a immersione da 63X con un'apertura numerica di 0,9 e una distanza di lavoro di 2,2 mm. 
	<img alt="Tabella di colorazione dei biofilm; lunghezze d'onda del laser (nm) e bande di emissione (nm) per EPS, acidi nucleici, proteine" fo:content-width="4.75in" src="/files/ftp_upload/50639/50639table1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Table 1"> 
	Tabella 1. Impostazioni del microscopio a scansione laser confocale.</li>
</ol>

<ol start="2">
	<li>Impostare la dimensione di scansione a 250 μm x 250 μm e una risoluzione minima in pixel di 512 x 512 per acquisire immagini al microscopio confocale a scansione laser (CLSM) con una risoluzione adeguata per l'analisi quantitativa.</li>
	<li>Utilizzare il colorante SY per definire i punti superiore e inferiore dello stack di immagini del biofilm, quindi impostare il passo z in modo adeguato per l'analisi quantitativa (0,6 μm per questo studio). Prima di acquisire una scansione, ottimizzare i parametri dell'immagine e del colorante (i.e. tensione e offset del PMT) utilizzando l'opzione QLUT. È stata utilizzata una tabella di colori (color look-up table) per assegnare pseudocolori a ciascun colorante (verde per SY, rosso per SR e blu per AF) al fine di rendere ogni componente del biofilm più distinguibile nella ricostruzione tridimensionale.</li>
	<li>Acquisire immagini CLSM a 400 Hz utilizzando la scansione sequenziale in modalità "between stacks" per ottimizzare la cattura di immagini di più coloranti all'interno dello stesso biofilm.</li>
</ol>
7. Analisi Strutturale del Biofilm
<ol>
	<li>Analizzare le immagini CLSM raccolte utilizzando un software di analisi delle immagini per i biofilm. I seguenti passaggi descrivono l'uso del software ISA3D12 per calcolare i parametri strutturali delle immagini di biofilm raccolte.
	<ol>
		<li>Copiare i file delle immagini CLSM per ciascun biofilm nella cartella Images, come specificato nel manuale del software. Assicurarsi di seguire la convenzione di denominazione dei file CLSM richiesta dal software. Il software consente l'analisi dei file all'interno di sottocartelle in modalità batch, facilitando così l'analisi dei biofilm dei gruppi sperimentali e di controllo nella stessa esecuzione.</li>
		<li>Inserire le dimensioni degli assi x, y e z delle immagini CLSM nei campi dxy e dz della finestra di dialogo principale. Selezionare le impostazioni di soglia e di mappatura della distanza, come descritto nel manuale del software (Otsu e Quasi-Euclidea sono state utilizzate in questo studio, rispettivamente). Inserire un nome appropriato per il file dei risultati, quindi eseguire il programma. Un file di risultati verrà generato nella cartella ISA.</li>
		<li>Visualizzare il file dei risultati per ottenere i valori di venti parametri strutturali 3D12, come il biolume e lo spessore medio del biofilm (misurati in questo studio), che quantificano la distribuzione tridimensionale di ciascun componente (colorazione) all'interno del biofilm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Visualizzazione della struttura del biofilm
<ol>
	<li>Crea una ricostruzione dei componenti sovrapposti (colorazioni) all'interno di ciascun biofilm utilizzando un software di analisi delle immagini. I passaggi seguenti descrivono l'uso del software Volocity per creare ricostruzioni 3D.
	<ol>
		<li>Crea una libreria per ogni biofilm copiando i file delle immagini CLSM nel software, come descritto nel manuale.</li>
		<li>Utilizza l'opzione del menu 3D Renderer per produrre un'immagine ricostruita in 3D a partire dalle immagini CLSM di ciascun biofilm (nel presente studio è stato utilizzato il formato HR Opacity).</li>
		<li>Ruota l'immagine 3D per orientare tutti i biofilm in modo simile rispetto agli assi coordinati x, y e z. Acquisisci un'istantanea della ricostruzione del biofilm correttamente orientata, quindi esporta l'istantanea in formato TIFF, JPEG o in un altro formato adeguato.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Esegui un'analisi visiva della distribuzione contemporanea dei componenti EPS, proteine e acidi nucleici all'interno dei biofilm sulle immagini ricostruite.</li>
	<li>Utilizza il coefficiente di correlazione di Pearson e il coefficiente di sovrapposizione di Manders per effettuare un'analisi di codistribuzione (colocalizzazione) di più componenti del biofilm (la colocalizzazione non è stata misurata nel presente studio).</li>
</ol>
9. Analisi statistica
<ol>
	<li>Utilizzare analisi statistiche separate con modelli misti per confrontare i valori medi dei parametri strutturali tra il gruppo con collutorio e il gruppo di controllo (α=0.05). Per questo studio, il software SAS è stato utilizzato per eseguire l'analisi statistica.</li>
</ol>

<ol><li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+a+common+cause+of+persistent+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+from+the+natural+environment+to+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases.</a> Nat. Rev. Microbiol. 2, 95-108 (2004).</li>
<li>Yang, Y., Sreenivasan, P. K., Subramanyam, R., Cummins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+assessments+to+determine+the+effects+of+sugars+and+antimicrobials+on+a+polymicrobial+oral+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiparameter assessments to determine the effects of sugars and antimicrobials on a polymicrobial oral biofilm.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 6734-6742 (2006).</li>
<li>Klein, M. I., Xiao, J., Heydorn, A., Koo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analytical+tool-box+for+comprehensive+biochemical%2C+structural+and+transcriptome+evaluation+of+oral+biofilms+mediated+by+mutans+streptococci%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An analytical tool-box for comprehensive biochemical, structural and transcriptome evaluation of oral biofilms mediated by mutans streptococci.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
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<li>Robinson, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Principles of confocal microscopy.</a> Methods Cell Biol. 63, 89-106 (2001).</li>
<li>Neu, T. R., Kuhlicke, U., Lawrence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+fluorochromes+for+two-photon+laser+scanning+microscopy+of+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 901-909 (2002).</li>
<li>Wood, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+intact+natural+human+plaque+biofilms+studied+by+confocal+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dental+Res%22%5BJournal%5D)">Architecture of intact natural human plaque biofilms studied by confocal laser scanning microscopy.</a> J. Dental Res. 79, 21-27 (2000).</li>
<li>Chen, M. Y., Lee, D. J., Tay, J. H., Show, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+of+extracellular+polymeric+substances+and+cells+in+bioaggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Staining of extracellular polymeric substances and cells in bioaggregates.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 75, 467-474 (2007).</li>
<li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images%3A+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochem. Cytochem. 40, 101-111 (2007).</li>
<li>Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+evaluating+colocalization+in+biological+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, C723-C742 (2011).</li>
<li>Beyenal, H., Donovan, C., Lewandowski, Z., Harkin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+biofilm+structure+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional biofilm structure quantification.</a> J. Microbiol. Methods. 59, 395-413 (2004).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti. La produzione e l'accesso gratuito a questo articolo sono sponsorizzati da Leica Microsystems.

L'acquisizione delle immagini CLSM deve essere eseguita nel modo e nel formato necessari per la quantificazione dei biofilm e per l'analisi di colocalizzazione, in modo tale che la distribuzione dell'intensità del segnale in ciascuna immagine sia una rappresentazione affidabile della distribuzione di ciascun fluorocromo nello stack di biofilm. L'intensità del segnale deve essere distinguibile dal rumore e dal fondo10,11, non influenzata dall'autofluorescenza dal substrato e avere un sanguinamento minimo a causa dell'interferenza spettrale tra i fluorocromi utilizzati11. Il rumore è una limitazione inevitabile della microscopia a fluorescenza11 e la qualità dell'immagine può talvolta essere limitata per motivi tecnici o logistici. L'identificazione dei fluorocromi con una sovrapposizione spettrale minima è fondamentale per il successo di questo metodo, ma può essere complicata. Inoltre, la quantificazione di più fluorocromi pone un problema multifattoriale. Pertanto, non sorprende che pochissime indagini abbiano quantificato con successo la distribuzione concomitante di più di due componenti all'interno delle strutture dei biofilm.
L'obiettivo di questo studio è stato quello di riportare una metodologia costituita da passaggi distinti ma interconnessi per la quantificazione e il confronto delle distribuzioni tridimensionali concomitanti di tre componenti cellulari ed extracellulari all'interno dei biofilm. Il saggio di crescita del biofilm descritto consente la crescita del biofilm su substrati rilevanti e produce strutture di biofilm riproducibili, come dimostrato dai risultati riportati nella Tabella 1. La combinazione di una nuova colorazione simultanea di EPS, proteine e componenti di acidi nucleici con la misurazione dei parametri strutturali del biofilm 3D si traduce in distribuzioni quantificabili dei componenti all'interno dei biofilm. L'analisi visiva qualitativa della distribuzione concomitante di EPS, proteine e acido nucleico all'interno dei biofilm è possibile attraverso la ricostruzione delle colorazioni sovrapposte all'interno di ciascun biofilm. Il software ISA3D12 contiene diversi parametri strutturali unici come la dimensione frattale, l'omogeneità e il coefficiente di rugosità del biofilm, oltre a parametri misurati tradizionalmente come la porosità e lo spessore del biofilm per migliorare la quantificazione delle strutture 3D dei biofilm. L'analisi statistica dei parametri strutturali del biofilm facilita il confronto pertinente dei biofilm in specifiche condizioni sperimentali come l'efficacia antibatterica/antivegetativa (ad es. dopo il trattamento con collutori) o nel tempo (effetti temporali).
Questa metodologia ha quantificato e confrontato in modo efficiente e con successo le distribuzioni 3D simultanee di tre componenti principali all'interno dei biofilm di S. mutans che sono stati cresciuti su substrati pertinenti, superando così due sfide per la valutazione simultanea dei componenti del biofilm. Questo metodo può essere utilizzato anche per determinare l'efficacia di trattamenti antibatterici o misure antivegetative contro più componenti del biofilm, come dimostrato utilizzando i collutori in questo studio. Inoltre, la maggior parte dei protocolli sopra descritti può essere sostituita con protocolli per la fabbricazione di substrati rilevanti e saggi di crescita del biofilm di microrganismi rilevanti. Pertanto, questo metodo ha un'ampia applicazione perché facilita il confronto di strutture/architetture 3D di biofilm in vitro e in vivo in una varietà di discipline, tra cui le scienze mediche, odontoiatriche, geologiche e marine.

I biofilm sono comunità microbiche strutturate che sono incapsulate in una matrice extracellulare autoprodotta e sono attaccate a superfici biologiche o inerti1. I biofilm rappresentano uno stile di vita comune per molti batteri e si formano passando in fasi da cellule fluttuanti (planctoniche) a complesse comunità multispecie. La resistenza intrinseca dei biofilm agli agenti antimicrobici è alla base di molte infezioni batteriche persistenti e croniche1,2, come dimostrato dai biofilm orali (placca dentale). I microrganismi cariogeni come gli streptococchi mutans processano il saccarosio e altri carboidrati per produrre una matrice extracellulare e generare acidi che possono demineralizzare la struttura del dente e causare carie dentale. La maggior parte delle matrici di biofilm sono biopolimeri costituiti da componenti cellulari ed extracellulari come esopolisaccaridi (EPS), proteine e acidi nucleici3,4.
Microscopia a scansione laser confocale (CLSM), la tecnica più utilizzata per l'imaging a fluorescenza, ha trasformato radicalmente l'imaging ottico in biologia perché ha la capacità di raccogliere immagini 3D di strutture biologiche idratate senza fissazione5,6,7. Questa tecnica non distruttiva prevede la raccolta di immagini di sezioni sottili all'interno di una regione di interesse sul campione in modo tale da rimuovere il contributo della luce sfocata. La qualità e la risoluzione delle immagini acquisite con CLSM sono superiori a quelle ottenibili con la microscopia a fluorescenza a campo largo. Uno dei principali svantaggi del CLSM è che la scansione delle immagini avviene a una velocità inferiore rispetto alle tecniche di microscopia a campo largo, in cui intere immagini vengono raccolte contemporaneamente5. Tuttavia, con una selezione sempre più ampia di fluorocromi, laser e filtri, il CLSM è diventato una delle tecniche prevalenti per l'imaging multispettrale5,7.
Studi precedenti hanno dimostrato che il CLSM è uno strumento utile per esaminare la struttura o l'architettura dei biofilm utilizzando uno o due tag o coloranti fluorescenti per fornire una migliore comprensione della distribuzione di EPS e cellule all'interno dei biofilm, e in particolare all'interno della matrice extracellulare7,8. In teoria, la colorazione/marcatura fluorescente di più componenti è auspicabile per esplorare la struttura dettagliata e la colocalizzazione di componenti cellulari ed extracellulari all'interno dei biofilm. Tuttavia, l'analisi concomitante di vari componenti all'interno dei biofilm può essere impegnativa perché: 1) la selezione di coloranti fluorescenti con una sovrapposizione spettrale minima è complicata e 2) la quantificazione di più fluorocromi pone un problema multifattoriale. La colocalizzazione con più fluorocromi richiede l'uso di coloranti altamente specifici con un'interferenza spettrale minima per evitare qualsiasi effetto di sanguinamento, che si verifica quando due fluorocromi hanno una sovrapposizione significativa nel loro picco spettrale, causando una maggiore eccitazione di uno rispetto agli altri9. Idealmente, i fluorocromi con spettri di eccitazione che non si sovrappongono fornirebbero i migliori risultati, tuttavia è molto difficile trovare coloranti che soddisfino questo criterio. Invece, la selezione dei coloranti è ottimizzata scegliendo fluorocromi i cui spettri di emissione hanno una sovrapposizione minima, consentendo di visualizzare i coloranti uno per uno all'interno di una banda di lunghezze d'onda di osservazione limitata9.
La sovrapposizione di immagini a fluorescenza è probabilmente il metodo più utilizzato per valutare la distribuzione concomitante dei fluorocromi. La colocalizzazione dei vari componenti appare come una sovrapposizione di colori diversi attraverso più canali creati dai fluorocromi in esame10. Gli strumenti per la visualizzazione di immagini a fluorescenza multicanale come immagini a colori unite sono disponibili nella maggior parte dei software CLSM e dei software di analisi delle immagini biologiche. Sebbene la sovrapposizione di immagini sia utile per la valutazione spaziale della colocalizzazione, le immagini possono essere esaminate qualitativamente solo mediante analisi visiva. Ciò fornisce una quantità limitata di informazioni, poiché queste rappresentazioni non sono generalmente utili per quantificare la colocalizzazione in diverse condizioni sperimentali né determinano se la colocalizzazione supera la coincidenza casuale11. Pochissime indagini finora hanno utilizzato metodi quantitativi per analizzare la struttura tridimensionale dei biofilm e dei componenti del biofilm, e ancora meno hanno quantificato l'effetto dei trattamenti antibatterici o delle misure antivegetative sui componenti del biofilm.
L'obiettivo di questo studio era quello di riportare una metodologia per la quantificazione e il confronto delle distribuzioni tridimensionali concomitanti di tre componenti cellulari ed extracellulari dei biofilm. Il metodo consiste in fasi distinte ma interconnesse che coinvolgono la crescita del biofilm, la colorazione, l'imaging CLSM dei biofilm, l'analisi e la visualizzazione strutturale del biofilm e l'analisi statistica dei parametri strutturali. Il saggio di crescita del biofilm consente la crescita del biofilm su substrati pertinenti e produce strutture di biofilm riproducibili. La combinazione di una nuova colorazione simultanea di EPS, proteine e componenti di acidi nucleici con la misurazione dei parametri strutturali del biofilm 3D si traduce in distribuzioni quantificabili dei componenti all'interno dei biofilm. L'analisi statistica dei parametri strutturali del biofilm facilita la valutazione dei biofilm in specifiche condizioni sperimentali (ad esempio dopo il trattamento con collutori), come verrà descritto nella prossima sezione.

<table><tbody><tr><td>Bacto Agar</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Todd Hewitt Brodo</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>249240</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito, granulato</td><td>EMD Millipore</td><td>1.03753.0500</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Tryptone</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>OmniPur Sucrosio</td><td>EMD Millipore</td><td>8510</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio, reagente ACS, 99,0-100,5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio, monobasico, &ge; 99,0%, reagente ACS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio, monobasico, monoidrato</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0710-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris(idrossimetil)amminometano, 99,8+%, reagente ACS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859-500G</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Coniugato</td><td>Invitrogen</td><td>C21421</td><td></td></tr><tr><td>Syto 9</td><td>Invitrogen</td><td>S34854</td><td></td></tr><tr><td>Sypro Rosso</td><td>Invitrogen</td><td>S12012 o S6653</td><td></td></tr><tr><td>Biot ne PBF Risciacquo orale</td><td>GlaxoSmithKline</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Listerine Total Care</td><td>McNeil-PPC, Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificazione concomitante di cellulare e extracellulare componenti del biofilm

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

La microscopia a scansione laser confocale (CLSM) è un potente strumento per lo studio dei biofilm. Pochissime indagini hanno quantificato con successo la distribuzione concomitante di più di due componenti all'interno dei biofilm perché: 1) la selezione di coloranti fluorescenti con una sovrapposizione spettrale minima è complicata e 2) la quantificazione di più fluorocromi pone un problema multifattoriale. Obiettivi: Riportare una metodologia per quantificare e confrontare le distribuzioni tridimensionali concomitanti di tre componenti cellulari/extracellulari di biofilm cresciuti su substrati rilevanti. metodi: Il metodo consiste in fasi distinte e interconnesse che coinvolgono la crescita del biofilm, la colorazione, l'imaging CLSM, l'analisi e la visualizzazione strutturale del biofilm e l'analisi statistica dei parametri strutturali. I biofilm di Streptococcus mutans (ceppo UA159) sono stati coltivati per 48 ore su campioni sterili di compositi di resina Point 4 e TPH3. I campioni sono stati successivamente immersi per 60 secondi in collutori Biotène PBF (BIO) o Listerine Total Care (LTO) o in acqua (gruppo di controllo; n=5/gruppo). I biofilm sono stati colorati con fluorocromi per sostanze polimeriche extracellulari, proteine e acidi nucleici prima dell'imaging con CLSM. I parametri strutturali del biofilm calcolati utilizzando il software di analisi delle immagini ISA3D erano il biovolume e lo spessore medio del biofilm. Le analisi statistiche dei modelli misti hanno confrontato i parametri strutturali tra collutorio e gruppi di controllo (software SAS; α=0,05). Il software Volocity ha permesso la visualizzazione delle distribuzioni 3D dei componenti del biofilm sovrapposti (fluorocromi). risultati: Il collutorio BIO ha prodotto strutture di biofilm che differivano significativamente dal controllo (p<0,05) su entrambi i compositi di resina, mentre LTO non ha prodotto differenze (p>0,05) su nessuno dei due prodotti. Conclusioni: Questa metodologia ha quantificato e confrontato in modo efficiente e riuscito le distribuzioni 3D simultanee di tre componenti principali all'interno dei biofilm di S. mutans su substrati rilevanti, superando così due sfide alla valutazione simultanea dei componenti del biofilm. Questo metodo può essere utilizzato anche per determinare l'efficacia di agenti antibatterici/antivegetativi contro più componenti del biofilm, come dimostrato utilizzando i collutori. Inoltre, questo metodo ha un'ampia applicazione perché facilita il confronto di strutture/architetture 3D di biofilm in una varietà di discipline.

I risultati rappresentativi dei trattamenti (collutori) e del gruppo di controllo non trattato sono mostrati nella Tabella 2 e nelle Figure 1 e 2. La Tabella 2 riporta i valori medi e le deviazioni standard dei parametri strutturali del biofilm: biovolume (μm3) e spessore medio del biofilm (μm), calcolati mediante il software ISA3D. I parametri strutturali dei biofilm trattati con collutorio che differivano in modo significativo rispetto al gruppo di controllo (p&lt;0,05) presentano i valori medi e le deviazioni standard evidenziati in rosso. I risultati delle analisi statistiche con modelli misti hanno dimostrato che il collutorio BIO ha prodotto strutture di biofilm significativamente diverse dal controllo (p&lt;0,05) su entrambi i compositi in resina, mentre il collutorio LTO non ha prodotto differenze significative (p&gt;0,05) su nessuno dei due compositi in resina. I risultati mostrano chiaramente che i componenti cellulari ed extracellulari del biofilm rimasti dopo i due trattamenti con collutorio erano diversi. Va inoltre osservato che i biofilm di S. mutans coltivati sui due substrati (PF e TP) differivano nella struttura tridimensionale, nonostante fossero stati coltivati in condizioni simili e che entrambi i substrati fossero stati lucidati con abrasivi simili.
La distribuzione contemporanea di EPS, proteine e acidi nucleici all'interno dei biofilm può essere visualizzata mediante ricostruzioni 3D generate utilizzando il software Volocity. Figure 1 e 2 mostrano ricostruzioni rappresentative di biofilm del gruppo di controllo coltivati rispettivamente su compositi in resina PF e TP. La colorazione blu rappresenta l'EPS nei biofilm di S. mutans, la colorazione verde indica gli acidi nucleici e quella rossa mostra le proteine. Lo spazio interposto può essere occupato da acqua o da altri componenti del biofilm non marcati con fluorescenza.
<img alt="grafico a dispersione 3D, visualizzazione dinamica dei dati, grafico, strumento interattivo per la ricerca, schermo analitico" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50639/50639fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50639/50639fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1. Una ricostruzione tridimensionale rappresentativa del biofilm di S. mutans sviluppato su composito in resina PF nel gruppo di controllo (non trattato con collutorio). La sovrapposizione simultanea dei tre coloranti all'interno di un singolo biofilm permette la visualizzazione contemporanea dei componenti EPS (colorazione blu), acidi nucleici (colorazione verde) e proteine (colorazione rossa) nei biofilm di S. mutans. (1 Unità = 24 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50639/50639fig1large.jpg" target="_blank"> Clicca qui per visualizzare l'immagine in dimensioni maggiori</a>.
<img alt="Visualizzazione della struttura cellulare 3D, microscopia a fluorescenza, analisi di dati spaziali, grafico scientifico." fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50639/50639fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50639/50639fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figura 2"> 
Figura 2. Una ricostruzione tridimensionale rappresentativa del biofilm di S. mutans sviluppato su composito in resina TP nel gruppo di controllo (non trattato con collutorio). La sovrapposizione simultanea dei tre coloranti all'interno di un singolo biofilm consente la visualizzazione contemporanea dei componenti EPS (colorazione blu), acidi nucleici (colorazione verde) e proteine (colorazione rossa) nei biofilm di S. mutans. (1 Unità = 24 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50639/50639fig2large.jpg" target="_blank"> Clicca qui per visualizzare l'immagine in dimensioni maggiori</a>.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Composito in resina</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Punto 4</td>
			<td colspan="2">TPH3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collutorio</td>
			<td>Componente</td>
			<td>VB (μm3)</td>
			<td>MT (μm)</td>
			<td>VB (μm3)</td>
			<td>MT (μm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotène PBF</td>
			<td>Acidi nucleici</td>
			<td>279,517±53,291</td>
			<td>9,32±2,80</td>
			<td>195,033±42,014</td>
			<td>7,45±3,70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EPS</td>
			<td>344,902±56,386</td>
			<td>35,22±17,19</td>
			<td>197,840±62,351</td>
			<td>9,83±7,26</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Proteine</td>
			<td>298,796±62,868</td>
			<td>54,21±21,65</td>
			<td>216,033±66,654</td>
			<td>24,33±39,64</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Listerine Total Care</td>
			<td>Acidi nucleici</td>
			<td>355,707±110,444</td>
			<td>26,45±14,21</td>
			<td>273,296±47,323</td>
			<td>13,43±2,89</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EPS</td>
			<td>494,099±180,592</td>
			<td>64,90±26,68</td>
			<td>329,150±47,145</td>
			<td>34,35±30,32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Proteine</td>
			<td>348,416±161,316</td>
			<td>58,68±47,28</td>
			<td>303,150±54,705</td>
			<td>34,18±41,46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controllo (non trattato)</td>
			<td>Acidi nucleici</td>
			<td>388,375±42,152</td>
			<td>51,15±40,66</td>
			<td>327,809±39,400</td>
			<td>17,08±1,65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EPS</td>
			<td>660,448±173,197</td>
			<td>91,37±74,84</td>
			<td>363,850±67,612</td>
			<td>28,33±15,07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Proteine</td>
			<td>517,274±119,475</td>
			<td>127,96±73,84</td>
			<td>353,161±56,518</td>
			<td>21,17±4,41</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 2. Valori medi e deviazione standard del Biovolume (BV) e dello Spessore medio del biofilm (MT) di biofilm trattati con BIO o LTO, o lasciati non trattati (gruppo di controllo). I parametri strutturali dei biofilm trattati con collutori che differivano in modo significativo rispetto a quelli dei biofilm del gruppo di controllo (p&lt;0.05) presentano i valori medi e la deviazione standard evidenziati in rosso.

Viene presentato un protocollo per la quantificazione e il confronto simultaneo di tre componenti cellulari ed extracellulari all'interno di biofilm. La metodologia prevede l'uso della microscopia a scansione laser confocale, del software di analisi e visualizzazione strutturale del biofilm e del software di analisi statistica.

Quantificazione concomitante di cellulare e extracellulare componenti del biofilm

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare e confrontare le distribuzioni tridimensionali concomitanti di tre componenti del biofilm cellulare ed extracellulare dopo il trattamento con agenti antibatterici. Ciò si ottiene fabbricando prima e poi lucidando i campioni compositi in resina. Nella seconda fase, i biofilm di interesse vengono coltivati sui campioni e quindi trattati con agenti antibatterici.Successivamente, i biofilm vengono colorati con fluorocromi per sostanze polimeriche extracellulari, acidi nucleici e proteine, e quindi ripresi mediante microscopia a scansione laser confocale. Nella fase finale, le immagini tridimensionali dei fluorocromi sovrapposti vengono ricostruite per facilitare la visualizzazione simultanea dei componenti del biofilm e i parametri strutturali vengono calcolati dalle immagini del biofilm. In definitiva, è possibile eseguire un'analisi statistica dei parametri strutturali del biofilm, come il volume del bio e lo spessore medio del biofilm, per confrontare le differenze tra il gruppo di trattamento e quello di controllo.Il vantaggio principale di questa procedura rispetto ai metodi esistenti è che utilizza tecniche distinte ma interconnesse per caratterizzare la distribuzione di più componenti all'interno della struttura di biofilm cresciuti in condizioni specifiche, dimostrando che la procedura sarà il Dr.Fernando Flores, un ricercatore post-dottorato, e la signora Kristen Smart, un'assistente di ricerca del mio laboratorio Per creare i campioni, iniziare posizionando un incremento di 0,4 o TPH tre composito di resina dentale in Stampi in acciaio inox. Quindi, polimerizzare il primo incremento con un'unità di fotopolimerizzazione a LED per 40 secondi. Dopo aver ripetuto la procedura per il secondo incremento, utilizzare una lucidatrice semiautomatica per lucidare i campioni polimerizzati fino a ottenere una finitura superficiale finale accettabile.Infine, sterilizzare i campioni per far crescere il biofilm. In primo luogo, inoculare una singola colonia di S mutans in quattro millilitri di terreno di coltura notturno, quindi incubare la coltura a 37 gradi Celsius per 16-18 ore per ottenere una densità ottica di almeno 0,9. Successivamente, diluire la coltura in un rapporto da uno a 100 in 10 millilitri di crescita del biofilm.Medium Trasferire in modo asettico i campioni di resina composita sterile su piastre sterili da 12 pozzetti, quindi aggiungere 2,5 millilitri di coltura diluita a ciascuno dei pozzetti. Per il trattamento del collutorio e i gruppi di controllo, aggiungere 2,5 millilitri di biofilm sterile non inoculato, al terreno ai pozzetti di controllo della sterilità, quindi far crescere i biofilm a 37 gradi Celsius in condizioni micro parafiliche su uno shaker a 100 giri/min. Dopo 24 ore, aspirare asetticamente il terreno da tutti i pozzetti e lavare ogni pozzetto due volte con 2,5 millilitri di PBS sterile aspirando la soluzione salina dopo ogni lavaggio, quindi riempire ogni pozzetto con 2,5 millilitri di terreno di crescita del biofilm fresco e incubare la piastra per altre 24 ore come appena dimostrato per una crescita totale del biofilm Durata di 48 ore dopo il completamento della crescita del biofilm, Aspirare il terreno di coltura e quindi erogare 2,5 millilitri di collutorio in ciascun pozzetto del gruppo di trattamento e 2,5 millilitri di acqua ultrapura sterile nel gruppo di controllo.Agitare bene le piastre su uno shaker orbitale a 150 giri/min, quindi dopo 60 secondi, aspirare sia il collutorio che l'acqua ultrapura dai pozzetti per colorare la componente esopolisaccaridica dei biofilm. Incubare ogni biofilm con 50 microlitri di coniugato LOR per 30 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Quindi lavare i campioni due volte con 2,5 millilitri di tampone TC aspirando dopo ogni lavaggio e colorare gli acidi nucleici in ciascun biofilm con una goccia di 50 microlitri di cyto nine per 30 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce.Dopo aver lavato gli esemplari due volte, colorare i componenti proteici in ogni biofilm con 50 microlitri di rosso Cipro per 30 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Dopo aver lavato i campioni tre volte, trasferirli in pozzetti individuali di una piastra a sei pozzetti contenente sei millilitri di acqua ultrapura sterile per pozzetto per facilitare la loro visualizzazione mediante microscopia confocale per acquisire immagini di ciascuna delle colorazioni componenti all'interno dei biofilm dei gruppi di trattamento e di controllo. Impostare i laser di un microscopio a scansione laser confocale sulle seguenti impostazioni per il rilevamento di exo polisaccaridi mediante colorazione coniugata Exor, utilizzare un laser a 633 nanometri e una banda di emissione da 659 a 749 nanometri per il rilevamento di acidi nucleici mediante colorazione citonove.Utilizzare un laser a 488 nanometri e una banda di emissione da 495 a 500 nanometri, e per il rilevamento delle proteine mediante colorazione rossa di Cipro, utilizzare un laser a 543 nanometri e una banda di emissione da 615 a 651 nanometri. Quindi utilizzando una lente a immersione 63x con un'apertura numerica di 0,9 e una distanza di lavoro di 2,2 millimetri. Raccogli immagini di microscopia a scansione laser confocale a 400 hertz utilizzando la scansione sequenziale in modalità tra le pile per ottimizzare l'acquisizione di immagini di più macchie all'interno dello stesso biofilm.Dopo aver analizzato le immagini al microscopio a scansione laser confocale, utilizzare l'opzione di menu del renderer 3D nel software di analisi delle immagini di velocità per creare un'immagine 3D ricostruita delle macchie dei componenti sovrapposti all'interno di ciascun biofilm. Quindi, ruota l'immagine 3D per ottenere una visione ottimale del biofilm. Quindi acquisisci un'istantanea della ricostruzione del biofilm ed esporta l'istantanea in un formato di file immagine adatto.Infine, eseguire un'analisi visiva della distribuzione concomitante dell'acido nucleico eso polisaccaridico e dei componenti proteici all'interno dei biofilm. Nelle immagini ricostruite, calcolare i parametri strutturali del biofilm come il volume del biofilm e lo spessore medio del biofilm utilizzando il software ISA 3D in questa tabella, vengono visualizzati i valori medi e di deviazione standard dei parametri strutturali del biofilm calcolati utilizzando il software di analisi statistica. I valori medi e di deviazione standard per i parametri strutturali dei biofilm trattati con collutorio che differivano significativamente da quelli dei biofilm nel gruppo di controllo sono evidenziati nei modelli misti rossi.Le analisi statistiche hanno dimostrato che il collutorio Biotene PBF ha prodotto strutture di biofilm che differivano significativamente dal gruppo di controllo su entrambi i compositi di resina, mentre il collutorio Listerine total care non ha prodotto differenze significative su nessuno dei due compositi di resina, indicando chiaramente differenze nei componenti del biofilm cellulare ed extracellulare rimasti dopo i due trattamenti di collutorio. La distribuzione simultanea di exo polisaccaridi, acidi nucleici e proteine all'interno dei biofilm può essere visualizzata tramite ricostruzioni 3D generate utilizzando il software di velocità. In questa figura, viene mostrata una ricostruzione rappresentativa dei biofilm del gruppo di controllo cresciuti su 0.4 il colore blu è stato assegnato all'esopolisaccaride.All'interno dei biofilm di S mutans, il colore verde è stato assegnato agli acidi nucleici e il colore rosso alle proteine. Lo spazio intermedio può essere occupato da acqua o altri componenti del biofilm che non sono stati marcati in fluorescenza. In questa figura, viene mostrata una ricostruzione rappresentativa dei biofilm del gruppo di controllo cresciuti su compositi di resina TPH tre con i colori che rappresentano gli stessi componenti della figura precedente.Questa procedura ha portato applicazione in una varietà di discipline come le scienze mediche, odontoiatriche, geologiche e marine. Poiché molti substrati e biofilm possono essere sostituiti con quelli utilizzati qui.

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