Quantificazione concomitante di cellulare e extracellulare componenti del biofilm

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare e confrontare le distribuzioni tridimensionali concomitanti di tre componenti del biofilm cellulare ed extracellulare dopo il trattamento con agenti antibatterici. Ciò si ottiene fabbricando prima e poi lucidando i campioni compositi in resina. Nella seconda fase, i biofilm di interesse vengono coltivati sui campioni e quindi trattati con agenti antibatterici.

Successivamente, i biofilm vengono colorati con fluorocromi per sostanze polimeriche extracellulari, acidi nucleici e proteine, e quindi ripresi mediante microscopia a scansione laser confocale. Nella fase finale, le immagini tridimensionali dei fluorocromi sovrapposti vengono ricostruite per facilitare la visualizzazione simultanea dei componenti del biofilm e i parametri strutturali vengono calcolati dalle immagini del biofilm. In definitiva, è possibile eseguire un'analisi statistica dei parametri strutturali del biofilm, come il volume del bio e lo spessore medio del biofilm, per confrontare le differenze tra il gruppo di trattamento e quello di controllo.

Il vantaggio principale di questa procedura rispetto ai metodi esistenti è che utilizza tecniche distinte ma interconnesse per caratterizzare la distribuzione di più componenti all'interno della struttura di biofilm cresciuti in condizioni specifiche, dimostrando che la procedura sarà il Dr.Fernando Flores, un ricercatore post-dottorato, e la signora Kristen Smart, un'assistente di ricerca del mio laboratorio Per creare i campioni, iniziare posizionando un incremento di 0,4 o TPH tre composito di resina dentale in Stampi in acciaio inox. Quindi, polimerizzare il primo incremento con un'unità di fotopolimerizzazione a LED per 40 secondi. Dopo aver ripetuto la procedura per il secondo incremento, utilizzare una lucidatrice semiautomatica per lucidare i campioni polimerizzati fino a ottenere una finitura superficiale finale accettabile.

Infine, sterilizzare i campioni per far crescere il biofilm. In primo luogo, inoculare una singola colonia di S mutans in quattro millilitri di terreno di coltura notturno, quindi incubare la coltura a 37 gradi Celsius per 16-18 ore per ottenere una densità ottica di almeno 0,9. Successivamente, diluire la coltura in un rapporto da uno a 100 in 10 millilitri di crescita del biofilm.

Medium Trasferire in modo asettico i campioni di resina composita sterile su piastre sterili da 12 pozzetti, quindi aggiungere 2,5 millilitri di coltura diluita a ciascuno dei pozzetti. Per il trattamento del collutorio e i gruppi di controllo, aggiungere 2,5 millilitri di biofilm sterile non inoculato, al terreno ai pozzetti di controllo della sterilità, quindi far crescere i biofilm a 37 gradi Celsius in condizioni micro parafiliche su uno shaker a 100 giri/min. Dopo 24 ore, aspirare asetticamente il terreno da tutti i pozzetti e lavare ogni pozzetto due volte con 2,5 millilitri di PBS sterile aspirando la soluzione salina dopo ogni lavaggio, quindi riempire ogni pozzetto con 2,5 millilitri di terreno di crescita del biofilm fresco e incubare la piastra per altre 24 ore come appena dimostrato per una crescita totale del biofilm Durata di 48 ore dopo il completamento della crescita del biofilm, Aspirare il terreno di coltura e quindi erogare 2,5 millilitri di collutorio in ciascun pozzetto del gruppo di trattamento e 2,5 millilitri di acqua ultrapura sterile nel gruppo di controllo.

Agitare bene le piastre su uno shaker orbitale a 150 giri/min, quindi dopo 60 secondi, aspirare sia il collutorio che l'acqua ultrapura dai pozzetti per colorare la componente esopolisaccaridica dei biofilm. Incubare ogni biofilm con 50 microlitri di coniugato LOR per 30 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Quindi lavare i campioni due volte con 2,5 millilitri di tampone TC aspirando dopo ogni lavaggio e colorare gli acidi nucleici in ciascun biofilm con una goccia di 50 microlitri di cyto nine per 30 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce.

Dopo aver lavato gli esemplari due volte, colorare i componenti proteici in ogni biofilm con 50 microlitri di rosso Cipro per 30 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Dopo aver lavato i campioni tre volte, trasferirli in pozzetti individuali di una piastra a sei pozzetti contenente sei millilitri di acqua ultrapura sterile per pozzetto per facilitare la loro visualizzazione mediante microscopia confocale per acquisire immagini di ciascuna delle colorazioni componenti all'interno dei biofilm dei gruppi di trattamento e di controllo. Impostare i laser di un microscopio a scansione laser confocale sulle seguenti impostazioni per il rilevamento di exo polisaccaridi mediante colorazione coniugata Exor, utilizzare un laser a 633 nanometri e una banda di emissione da 659 a 749 nanometri per il rilevamento di acidi nucleici mediante colorazione citonove.

Utilizzare un laser a 488 nanometri e una banda di emissione da 495 a 500 nanometri, e per il rilevamento delle proteine mediante colorazione rossa di Cipro, utilizzare un laser a 543 nanometri e una banda di emissione da 615 a 651 nanometri. Quindi utilizzando una lente a immersione 63x con un'apertura numerica di 0,9 e una distanza di lavoro di 2,2 millimetri. Raccogli immagini di microscopia a scansione laser confocale a 400 hertz utilizzando la scansione sequenziale in modalità tra le pile per ottimizzare l'acquisizione di immagini di più macchie all'interno dello stesso biofilm.

Dopo aver analizzato le immagini al microscopio a scansione laser confocale, utilizzare l'opzione di menu del renderer 3D nel software di analisi delle immagini di velocità per creare un'immagine 3D ricostruita delle macchie dei componenti sovrapposti all'interno di ciascun biofilm. Quindi, ruota l'immagine 3D per ottenere una visione ottimale del biofilm. Quindi acquisisci un'istantanea della ricostruzione del biofilm ed esporta l'istantanea in un formato di file immagine adatto.

Infine, eseguire un'analisi visiva della distribuzione concomitante dell'acido nucleico eso polisaccaridico e dei componenti proteici all'interno dei biofilm. Nelle immagini ricostruite, calcolare i parametri strutturali del biofilm come il volume del biofilm e lo spessore medio del biofilm utilizzando il software ISA 3D in questa tabella, vengono visualizzati i valori medi e di deviazione standard dei parametri strutturali del biofilm calcolati utilizzando il software di analisi statistica. I valori medi e di deviazione standard per i parametri strutturali dei biofilm trattati con collutorio che differivano significativamente da quelli dei biofilm nel gruppo di controllo sono evidenziati nei modelli misti rossi.

Le analisi statistiche hanno dimostrato che il collutorio Biotene PBF ha prodotto strutture di biofilm che differivano significativamente dal gruppo di controllo su entrambi i compositi di resina, mentre il collutorio Listerine total care non ha prodotto differenze significative su nessuno dei due compositi di resina, indicando chiaramente differenze nei componenti del biofilm cellulare ed extracellulare rimasti dopo i due trattamenti di collutorio. La distribuzione simultanea di exo polisaccaridi, acidi nucleici e proteine all'interno dei biofilm può essere visualizzata tramite ricostruzioni 3D generate utilizzando il software di velocità. In questa figura, viene mostrata una ricostruzione rappresentativa dei biofilm del gruppo di controllo cresciuti su 0.4 il colore blu è stato assegnato all'esopolisaccaride.

All'interno dei biofilm di S mutans, il colore verde è stato assegnato agli acidi nucleici e il colore rosso alle proteine. Lo spazio intermedio può essere occupato da acqua o altri componenti del biofilm che non sono stati marcati in fluorescenza. In questa figura, viene mostrata una ricostruzione rappresentativa dei biofilm del gruppo di controllo cresciuti su compositi di resina TPH tre con i colori che rappresentano gli stessi componenti della figura precedente.

Questa procedura ha portato applicazione in una varietà di discipline come le scienze mediche, odontoiatriche, geologiche e marine. Poiché molti substrati e biofilm possono essere sostituiti con quelli utilizzati qui.