Fenotipizzazione mouse Pulmonary Function In Vivo Con la capacità polmonare Diffusione
6 gennaio 2015
Descriviamo un mezzo per misurare rapidamente e semplicemente la capacità di diffusione polmonare nei topi e dimostriamo che è sufficientemente sensibile ai cambiamenti fenotipici in molteplici patologie polmonari comuni. Questa metrica porta quindi una rilevanza traslazionale diretta ai modelli murini, poiché la capacità di diffusione è facilmente misurabile anche negli esseri umani.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di imparare a misurare la capacità di diffusione dei polmoni di un topo utilizzando un gascromatografo calibrato. Ciò si ottiene gonfiando i polmoni di un topo anestetizzato con gas contenente neon e monossido di carbonio, trattenendo il gas nei polmoni per nove secondi e raccogliendo il gas. Il gas prelevato dai polmoni viene quindi diluito a due millilitri e iniettato nel gascromatografo.
L'assorbimento differenziale di neon e monossido di carbonio nel polmone viene utilizzato per calcolare la capacità di diffusione. Questa misurazione può essere utilizzata per valutare la perdita della funzione polmonare in un ampio spettro di modelli di malattia polmonare. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto a tutti gli altri metodi esistenti per misurare la funzione polmonare nel topo è che si tratta di una misurazione riproducibile molto semplice che può essere confrontata direttamente con misurazioni simili nell'uomo.
Questo metodo può essere utilizzato per seguire i cambiamenti nella struttura polmonare che si verificano con una varietà di patologie polmonari. Questo protocollo inizia con l'impostazione del modulo gascromatografo fornito con la macchina per misurare i picchi di azoto, ossigeno, neon e monossido di carbonio. Per questa applicazione, sono necessari solo i dati al neon e al monossido di carbonio.
Lo strumento utilizza una colonna a setaccio molecolare con elio come gas di trasporto. Questo particolare gascromatografo ha una colonna da 0,8 millilitri e un campione da due millilitri viene utilizzato per garantire un'adeguata pulizia di questa colonna prima dell'avvio. Una serie di misurazioni calibra sempre la macchina utilizzando due millilitri di gas direttamente dalla sacca di campionamento del gas.
Il primo picco che appare è il neon, poi l'ossigeno e l'azoto, che non misuriamo per questa procedura. Infine, il picco del monossido di carbonio appare il momento per il gascromatografo. Per misurare tutti questi picchi è necessario poco meno di un minuto.
Per iniziare, anestetizzare i topi con ketamina e xilazina. Confermare l'anestesia con l'assenza di movimento riflesso in risposta a un pizzicamento del dito del piede. Successivamente, per proteggere gli occhi, applicare un unguento veterinario, quindi tracheostomizzare i topi con una cannula per stalloni.
Utilizzare una cannula calibro 18 per adulti o una cannula calibro 20 per topi molto giovani. Quindi, avvia il metronomo con clic udibili ogni secondo. Per i topi di età superiore alle sei settimane, utilizzare una siringa da tre millilitri per prelevare 0,8 millilitri di gas dalla sacca della miscela di gas.
Se il topo ha meno di quattro settimane, utilizzare 0,4 millilitri di gas, quindi collegare la siringa alla cannula tracheale e gonfiare rapidamente i polmoni. Inizia a contare mentalmente da uno a 10 in sincronia con i clic del metronomo. Quando il conteggio raggiunge 10, prelevare rapidamente il volume di 0,8 millilitri.
Diluire questo gas espirato a due millilitri aggiungendo spazio, aria e peso per almeno 15 secondi. È molto importante gonfiare e sgonfiare i polmoni il più rapidamente possibile. Un gonfiaggio rapido è molto semplice, ma ci vuole un po' di pratica per prelevare rapidamente i 0,8 ml, quindi iniettare l'intero campione nel gascromatografo.
Per l'analisi, è importante evitare la contaminazione del campione durante il trasferimento da e verso l'animale e al gascromatografo. Questo può essere fatto con attenzione tappando il cartello con un dito mentre il GC sta misurando il campione. Gonfiare il polmone del topo con altri 0,8 millilitri di miscela di gas dalla sacca, quindi elaborare questo campione in modo identico al primo.
Utilizzando i valori medi delle due misurazioni, calcolare il DFCO. Il pedice C si riferisce ai gas di calibrazione e il pedice nove si riferisce ai campioni raccolti dall'animale. Dopo i nove secondi di apnea.
Un valore nominale di controllo DFCO preso da C 57 black six mice è di circa 0,77. In uno studio che ha utilizzato un modello di influenza PR 8, è stata osservata una progressiva perdita di funzione al sesto e all'ottavo giorno in un modello di enfisema 21 giorni dopo l'installazione delle elastasi. La DFCO è stata moderatamente diminuita, ma ci sono stati cambiamenti molto più grandi nel modello di fibrosi indotta dall'installazione di Blio Mycin.
La via fibrotica causata dalla bleomicina ha determinato il più grande cambiamento di DFCO osservato in qualsiasi modello patologico. Questo è importante poiché la capacità di diffusione è anche un marcatore affidabile della fibrosi nell'uomo. Il gene CFTR svolge un ruolo cruciale nella fibrosi cistica e in uno studio su topi privi di questo gene, c'è stata una significativa diminuzione di DFCO.
Il DFCO è stato ulteriormente ridotto con l'infezione fungina in questi topi knockout. Un modello comunemente usato per le lesioni polmonari è causato da LPS. Nei topi esposti a LPS, c'è stata una progressiva perdita tempo-dipendente della funzione polmonare dal primo al quarto giorno, come valutato dalle misurazioni DFCO, la misurazione di DFCO può essere effettuata con successo in topi di appena due settimane di età.
Le dimensioni più piccole del polmone richiedono un volume di gonfiaggio inferiore di 0,4 millilitri. Il DFCO misurato con questo volume più piccolo è in grado di mostrare l'aumento atteso man mano che il polmone matura Una volta padroneggiato. Questa tecnica può essere eseguita in pochi minuti per topo prima di eseguire qualsiasi altra misurazione o valutazione della funzionalità polmonare.
Durante il tentativo di questa procedura è importante assicurarsi di eseguire rapidamente la fase di gonfiaggio e sgonfiaggio e prestare attenzione durante il trasferimento del campione in modo da prevenire la contaminazione.
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Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per misurare la capacità di diffusione polmonare nei topi utilizzando un gascromatografo calibrato. La tecnica è sensibile ai cambiamenti del fenotipo in varie patologie polmonari, rendendola rilevante per la ricerca traslazionale.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Fisiologia respiratoria
- Ricerca traslazionale
Sfondo
- La capacità di diffusione polmonare è una misura critica della funzione polmonare.
- I metodi esistenti per misurare la funzione polmonare nei topi possono essere complessi.
- Gli studi comparativi tra topi e umani sono essenziali per la rilevanza traslazionale.
- Sono necessarie tecniche semplici e riproducibili per una ricerca efficace.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo semplice per misurare la capacità di diffusione polmonare nei topi.
- Valutare la perdita di funzione polmonare attraverso vari modelli di malattia polmonare.
- Facilitare i confronti delle misurazioni della funzione polmonare tra topi e umani.
Metodi utilizzati
- Insufflazione di polmoni di topi anestetizzati con una miscela di gas contenente neon e monossido di carbonio.
- Conservazione del gas nei polmoni per nove secondi prima della raccolta.
- Diluzione del gas raccolto a due millilitri per l'analisi.
- Utilizzo di un gascromatografo per misurare l'assorbimento differenziale dei gas.
Risultati principali
- Il metodo fornisce una misurazione affidabile della capacità di diffusione polmonare.
- È sensibile ai cambiamenti della funzione polmonare associati a varie patologie.
- La tecnica è semplice e riproducibile, migliorando la sua applicabilità nella ricerca.
- I risultati possono essere direttamente confrontati con misurazioni simili negli umani.
Conclusioni
- Questo metodo offre uno strumento prezioso per valutare la funzione polmonare nei modelli murini.
- Supporta la ricerca traslazionale collegando le misurazioni tra topi e umani.
- Studi futuri possono utilizzare questa tecnica per esplorare più efficacemente le patologie polmonari.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Measuring lung diffusing capacity in mice provides a translational pulmonary function test that enables direct comparison with human clinical data. This approach supports phenotypic characterization of lung disease models and enhances predictive confidence in preclinical target validation. The method’s simplicity and reproducibility facilitate integration into discovery workflows for mechanistic de-risking and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying lung function loss across emphysema, fibrosis, acute lung injury, and infection models.
- Operational Value: Provides a rapid, reproducible assay for functional target validation in murine lung pathology studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, gas-exchange-based readouts suitable for screening compound effects on lung structure and function.
- Operational Value: Standardized procedure with <1-minute readout supports high-throughput phenotypic screening in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with human diffusing capacity measurements, enabling cross-species biomarker alignment and translational continuity.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by detecting early functional changes in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, offering a phenotypic bridge between murine models and human clinical endpoints.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by detecting structural lung changes via functional gas exchange metrics.
- Screening: Enables assay readiness through standardized gas collection and chromatographic analysis of neon and carbon monoxide uptake.
- Analytics: Generates quantitative diffusing capacity (DFCO) values that allow comparison of lung function across experimental conditions and time points.
- Translational Research: Connects murine phenotypes to human clinical relevance through direct comparability of diffusing capacity measurements.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable capability for longitudinal lung function monitoring across multiple disease models and study phases.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in lung pathology models through quantitative phenotyping.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via rapid gas injection, breath-hold, and GC analysis workflow.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, translationally relevant functional readouts that reduce late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of compounds based on lung function preservation or improvement in disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse anesthesia, tracheal cannulation, and gas handling techniques.
- Dependent on access to a calibrated gas chromatograph with molecular sieve column and helium carrier gas.
- Necessitates cross-team standardization of gas volumes, inflation timing, and sample dilution protocols.
- Involves adaptation considerations for neonatal vs. adult mice due to lung size and required gas volumes (0.4 mL vs. 0.8 mL).
- Includes practical limitations such as the need to prevent sample contamination during transfer and the importance of rapid lung inflation/deflation for accurate measurements.
