Fenotipizzazione mouse Pulmonary Function In Vivo Con la capacità polmonare Diffusione

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di imparare a misurare la capacità di diffusione dei polmoni di un topo utilizzando un gascromatografo calibrato. Ciò si ottiene gonfiando i polmoni di un topo anestetizzato con gas contenente neon e monossido di carbonio, trattenendo il gas nei polmoni per nove secondi e raccogliendo il gas. Il gas prelevato dai polmoni viene quindi diluito a due millilitri e iniettato nel gascromatografo.

L'assorbimento differenziale di neon e monossido di carbonio nel polmone viene utilizzato per calcolare la capacità di diffusione. Questa misurazione può essere utilizzata per valutare la perdita della funzione polmonare in un ampio spettro di modelli di malattia polmonare. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto a tutti gli altri metodi esistenti per misurare la funzione polmonare nel topo è che si tratta di una misurazione riproducibile molto semplice che può essere confrontata direttamente con misurazioni simili nell'uomo.

Questo metodo può essere utilizzato per seguire i cambiamenti nella struttura polmonare che si verificano con una varietà di patologie polmonari. Questo protocollo inizia con l'impostazione del modulo gascromatografo fornito con la macchina per misurare i picchi di azoto, ossigeno, neon e monossido di carbonio. Per questa applicazione, sono necessari solo i dati al neon e al monossido di carbonio.

Lo strumento utilizza una colonna a setaccio molecolare con elio come gas di trasporto. Questo particolare gascromatografo ha una colonna da 0,8 millilitri e un campione da due millilitri viene utilizzato per garantire un'adeguata pulizia di questa colonna prima dell'avvio. Una serie di misurazioni calibra sempre la macchina utilizzando due millilitri di gas direttamente dalla sacca di campionamento del gas.

Il primo picco che appare è il neon, poi l'ossigeno e l'azoto, che non misuriamo per questa procedura. Infine, il picco del monossido di carbonio appare il momento per il gascromatografo. Per misurare tutti questi picchi è necessario poco meno di un minuto.

Per iniziare, anestetizzare i topi con ketamina e xilazina. Confermare l'anestesia con l'assenza di movimento riflesso in risposta a un pizzicamento del dito del piede. Successivamente, per proteggere gli occhi, applicare un unguento veterinario, quindi tracheostomizzare i topi con una cannula per stalloni.

Utilizzare una cannula calibro 18 per adulti o una cannula calibro 20 per topi molto giovani. Quindi, avvia il metronomo con clic udibili ogni secondo. Per i topi di età superiore alle sei settimane, utilizzare una siringa da tre millilitri per prelevare 0,8 millilitri di gas dalla sacca della miscela di gas.

Se il topo ha meno di quattro settimane, utilizzare 0,4 millilitri di gas, quindi collegare la siringa alla cannula tracheale e gonfiare rapidamente i polmoni. Inizia a contare mentalmente da uno a 10 in sincronia con i clic del metronomo. Quando il conteggio raggiunge 10, prelevare rapidamente il volume di 0,8 millilitri.

Diluire questo gas espirato a due millilitri aggiungendo spazio, aria e peso per almeno 15 secondi. È molto importante gonfiare e sgonfiare i polmoni il più rapidamente possibile. Un gonfiaggio rapido è molto semplice, ma ci vuole un po' di pratica per prelevare rapidamente i 0,8 ml, quindi iniettare l'intero campione nel gascromatografo.

Per l'analisi, è importante evitare la contaminazione del campione durante il trasferimento da e verso l'animale e al gascromatografo. Questo può essere fatto con attenzione tappando il cartello con un dito mentre il GC sta misurando il campione. Gonfiare il polmone del topo con altri 0,8 millilitri di miscela di gas dalla sacca, quindi elaborare questo campione in modo identico al primo.

Utilizzando i valori medi delle due misurazioni, calcolare il DFCO. Il pedice C si riferisce ai gas di calibrazione e il pedice nove si riferisce ai campioni raccolti dall'animale. Dopo i nove secondi di apnea.

Un valore nominale di controllo DFCO preso da C 57 black six mice è di circa 0,77. In uno studio che ha utilizzato un modello di influenza PR 8, è stata osservata una progressiva perdita di funzione al sesto e all'ottavo giorno in un modello di enfisema 21 giorni dopo l'installazione delle elastasi. La DFCO è stata moderatamente diminuita, ma ci sono stati cambiamenti molto più grandi nel modello di fibrosi indotta dall'installazione di Blio Mycin.

La via fibrotica causata dalla bleomicina ha determinato il più grande cambiamento di DFCO osservato in qualsiasi modello patologico. Questo è importante poiché la capacità di diffusione è anche un marcatore affidabile della fibrosi nell'uomo. Il gene CFTR svolge un ruolo cruciale nella fibrosi cistica e in uno studio su topi privi di questo gene, c'è stata una significativa diminuzione di DFCO.

Il DFCO è stato ulteriormente ridotto con l'infezione fungina in questi topi knockout. Un modello comunemente usato per le lesioni polmonari è causato da LPS. Nei topi esposti a LPS, c'è stata una progressiva perdita tempo-dipendente della funzione polmonare dal primo al quarto giorno, come valutato dalle misurazioni DFCO, la misurazione di DFCO può essere effettuata con successo in topi di appena due settimane di età.

Le dimensioni più piccole del polmone richiedono un volume di gonfiaggio inferiore di 0,4 millilitri. Il DFCO misurato con questo volume più piccolo è in grado di mostrare l'aumento atteso man mano che il polmone matura Una volta padroneggiato. Questa tecnica può essere eseguita in pochi minuti per topo prima di eseguire qualsiasi altra misurazione o valutazione della funzionalità polmonare.

Durante il tentativo di questa procedura è importante assicurarsi di eseguire rapidamente la fase di gonfiaggio e sgonfiaggio e prestare attenzione durante il trasferimento del campione in modo da prevenire la contaminazione.