Sviluppo di un In vitro Sistema modello per studiare l'interazione tra Equus Caballus IgE con il suo recettore ad alta affinità FcεRI
November 1st, 2014
Il presente studio descrive lo sviluppo e le applicazioni di un sistema di analisi geneticamente modificato basato sulla trasfezione di cellule leucemiche basofile di ratto con il gene equino FcεRIα. Le cellule trasfettate esprimono un recettore funzionale in cui il rilascio di mediatori della risposta allergica può essere attivato da IgE e antigene.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare la quantità di rilascio di mediatore IgE dipendente dalle cellule di leucemia basofila RAD. I sintomi dell'allergia sono causati dal rilascio di mediatori come l'istamina. Ora, l'istamina non è l'unico mediatore rilasciato dai basofili sono i mastociti.
Il totale di tutti i mediatori rilasciati da queste cellule provoca segni e sintomi di ipersensibilità immediata e ritardata. Ora, gli esseri umani non sono gli unici organismi che soffrono di allergia, anche i cani e i cavalli soffrono. Al fine di sviluppare ulteriormente la ricerca e trovare trattamenti contro l'allergia come i vaccini, è necessario un test di rilascio per quantificare la quantità di mediatori rilasciati, se presenti, dal trattamento di ricerca.
Questo è il motivo di questo test di rilascio. Il saggio per il sistema umano è stato sviluppato e pubblicato per la prima volta da Ian e Hook nel 1986. In seguito è stato sviluppato per il sistema DOC e ora per il sistema del cavallo.
Le modifiche sono semplici come cambiare le proteine di interesse. La novità della linea cellulare è stata la leucemia di Rat Baso o RBL due linee cellulari H 3.1 che esprimono la catena alfa dei recettori equini ad alta FNT ffc Serin R a una densità cellulare di 500.000 cellule per millilitro. Aggiungere l'anticorpo IgE di interesse a una concentrazione finale di un nanogrammo per millilitro.
Aggiungere 100 microlitri della miscela in una piastra di terreno 96 e incubare per 16 ore a 37 gradi. Ciò consente alle cellule di aderire alla superficie del pozzetto e l'anticorpo si lega al suo recettore wash. Il doppio del terreno contenente l'anticorpo non legato rimanente e le cellule morte con 100 microlitri di tampone di rilascio caldo a 37 gradi.
Scartare il tampone dall'ultimo lavaggio e sostituirlo con 100 microlitri dell'antigene di interesse alla concentrazione di interesse. Dopo 20 minuti di incubazione a 37 gradi, trasferire 50 microlitri di natina SUP contenente i mediatori di rilascio in un nuovo pozzetto e sostituire il surnatante rimanente con 50 microlitri di tampone Triton X per liare le cellule e rilasciare i mediatori rimanenti all'interno delle cellule. A 50 microlitri di 2 milioni di molari beta hx.
Molti giorni substrato disciolto in tampone citrato. Dopo un'incubazione di due ore a 37 gradi, aggiungere 150 microlitri di tampone tris a ciascun pozzetto facendo ingiallire il pozzetto. Misurare l'assorbanza del colore a 405 nanometri Dopo 16 ore.
Riscaldare il tampone di rilascio, noto anche come tampone Ian, a 37 gradi. Preparare anche il gradiente di concentrazione dell'antigene nel tampone di rilascio alle concentrazioni. Zero: 0,1, 1, 10, 100, 1000 e 10.000 nanogrammi per millilitro.
Poi caldo a 37 gradi. Lavare i pozzetti muovendo rapidamente il piatto per rimuovere il terreno e aggiungere delicatamente 100 microlitri di tampone di rilascio caldo verso le pareti dei pozzetti. Questo per ridurre lo stress cellulare dovuto alla differenza di temperatura, che le induce a rilasciare prematuramente i mediatori.
Il piatto deve essere lavato due volte. Scartare il tampone di rilascio finale, lavare e aggiungere 100 microlitri di antigene, iniziando con una concentrazione di antigene pari a zero alla riga A per il controllo negativo, e scendendo lungo il gradiente di concentrazione dalle file B a G e infine alle fette di Triton X, tampone alla riga H. Questo è per il controllo positivo. Incubare la piastra per 20 minuti a 37 gradi.
Questo è il punto in cui le cellule rilasciano mediatori dopo il periodo di incubazione. Trasferire 50 microlitri di liquido in ogni pozzetto nel rispettivo pozzetto. Alla colonna da sette a 12 estrarre completamente e scartare il liquido rimanente nelle posizioni da uno a sei e sostituirlo con 50 microlitri di tampone di lisi Triton X.
Aggiungere 50 microlitri del substrato preparato a tutti i 96 pozzetti del piatto. Incubare a 37 gradi per due ore. Il beta H, molti giorni conversa substrato in quattro nitrofenolo.
Trascorso il periodo di incubazione, fermare la reazione aggiungendo 150 microlitri di tris tampone, trasformando i quattro nitrofenoli in un colore giallo. Leggere la lastra utilizzando uno spettrofotometro a piastra a 405 nanometri. Dopo aver misurato i dati di assorbanza, calcolare la quantità totale di mediatori all'interno delle cellule nella posizione A dei pozzetti uno moltiplicando.
Il suo pozzo corrispondente alla posizione a sette per due e aggiungendo il risultato al valore a uno. Questo perché durante l'esperimento, abbiamo il supinato contenente l'opposizione dei mediatori di rilascio A uno poiché lo abbiamo trasferito in un nuovo pozzo di opposizione. Un sette.
Ripeti i calcoli per il resto dei pozzetti. Calcola la percentuale di mediatori di rilascio nell'opposizione del pozzo, A sette dal totale calcolato dei mediatori all'interno delle celle moltiplicando il valore della posizione A sette per due. Ancora una volta, perché durante l'esperimento, abbiamo il supernat contenente i mediatori di Reese.
Quando lo abbiamo trasferito in un nuovo, allora moltiplichiamo quel prodotto per 100 e dividiamo quel prodotto per il corrispondente valore totale dei mediatori all'interno delle celle per quella posizione. Questo dà la percentuale di mediatori di rilascio per il moto ondoso. Ripetere i calcoli per il resto dei pozzetti poiché i sei rigonfiamenti in ogni fila sono sfidati dalla stessa concentrazione di antigene medio.
Questi valori e calcolano la deviazione standard, tracciano questi valori su un grafico come segue. Il grafico mostra che all'aumentare della concentrazione dell'antigene, vengono rilasciati più mediatori fino a raggiungere il picco di 100 nanogrammi per millilitro, dopodiché il rilascio di mediatori diminuisce con l'aumentare della concentrazione dell'antigene. Il risultato sperimentale finale dovrebbe assomigliare a questi grafici, come si può vedere nel grafico B.Il test di rilascio di controllo in azzurro non contiene anticorpi IgE e quindi non mostra alcun cambiamento nel rilascio del mediatore con l'aumentare della concentrazione di antigene.
Confrontate questo con il risultato sperimentale in blu scuro, che potrebbe contenere anticorpi IgE. Questo è un esempio di un vaccino anti-IgE in fase di test per la sicurezza. È chiaro da questo grafico in rosso che il siero anti-IgE lega i recettori sulla superficie cellulare causando la degranulazione delle cellule RBL proprio come si vede nel controllo positivo in viola rispetto al controllo negativo in grigio, rendendo questo vaccino non sicuro.
Questo test è molto utile in quanto può misurare il rilascio del mediatore, o il suo ritardo durante la sperimentazione di potenziali farmaci antiallergici o vaccini, può anche essere adattato per il sistema canino o equino umano, come dimostrato dal test in grado di determinare il blocco riuscito o non riuscito del rilascio del mediatore durante il test degli anticorpi antiallergici.
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Panoramica
Questo studio si concentra su un sistema di analisi ingegnerizzato geneticamente che utilizza cellule di leucemia basofila del ratto trasfettate con il gene Fc蔚RI伪 equino. Il sistema consente la misurazione del rilascio di mediatori in risposta a IgE e antigene, il che è cruciale per comprendere le reazioni allergiche.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Immunologia
- Ricerca sulle allergie
- Biologia cellulare
Contesto
- Le risposte allergiche sono mediate dal rilascio di sostanze come l'istamina.
- Sia gli esseri umani che gli animali, come cani e cavalli, possono soffrire di allergie.
- Comprendere il rilascio dei mediatori è essenziale per sviluppare trattamenti per le allergie.
- I test di rilascio sono necessari per quantificare i mediatori nella ricerca.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un test affidabile per misurare il rilascio di mediatori dipendente da IgE.
- Migliorare la comprensione delle risposte allergiche in vari organismi.
- Facilitare lo sviluppo di potenziali trattamenti, inclusi i vaccini.
Metodi utilizzati
- Trasfezione di cellule di leucemia basofila del ratto con il gene Fc蔚RI伪 equino.
- Attivazione del recettore da IgE e antigene per innescare il rilascio di mediatori.
- Quantificazione dei mediatori rilasciati per valutare la risposta allergica.
- Utilizzo di una linea cellulare geneticamente ingegnerizzata per test sperimentali.
Risultati principali
- Le cellule trasfettate esprimono con successo un recettore Fc蔚RI伪 funzionale.
- L'attivazione di IgE e antigene porta a un rilascio di mediatori misurabile.
- Il test fornisce una piattaforma per studiare le risposte allergiche.
- I risultati contribuiscono alla comprensione dei meccanismi dell'allergia.
Conclusioni
- Il test ingegnerizzato geneticamente è efficace per studiare le risposte mediate da IgE.
- I risultati possono informare lo sviluppo di futuri trattamenti per le allergie.
- Questo approccio può migliorare la ricerca sulle reazioni allergiche in varie specie.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This assay system enables quantitative assessment of IgE-dependent mediator release in an equine model, supporting target validation and mechanistic de-risking in allergy therapeutic development. By providing a reproducible platform to evaluate IgE-FcεRI interactions, it aids in preclinical screening of biologics such as anti-IgE vaccines or monoclonal antibodies. The model offers translational continuity across species, facilitating cross-species extrapolation of pharmacological profiles and safety assessments.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of equine IgE-FcεRI binding affinity and receptor functionality.
- Operational Value: Provides a standardized cell-based system for evaluating target engagement in allergic pathways.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by confirming receptor-mediated signaling before in vivo studies.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Utilizes β-hexosaminidase release as a quantitative, scalable readout for mediator secretion.
- Reproducibility: Demonstrates consistent dose-dependent responses across antigen concentrations, supporting assay robustness.
- Platform Adaptability: Can be modified for human, canine, or equine systems, enabling cross-species assay reuse.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models physiological allergic responses observed in horses, which mirror human and canine hypersensitivity.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to preclinical evaluation of therapeutic candidates.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go decisions based on mediator release profiles and safety signals.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical assessment, particularly for allergy-focused biologics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of IgE receptor interactions and pathway clarification in mast cell/basophil activation.
- Screening: Enables evaluation of therapeutic candidates (e.g., anti-IgE antibodies) for their ability to block or induce mediator release.
- Analytics: Generates quantitative mediator release data (e.g., peak at 36.68% ± 4.88% at 100 ng/mL antigen) for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects in vitro mechanism to preclinical safety and efficacy evaluation in animal models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for allergic disease model development across multiple species.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by confirming functional receptor expression and signaling.
- Operational Value: Delivers a standardized, quantitative assay with defined controls and measurable outputs.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of biological activity or safety concerns.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of allergy therapeutics based on mechanistic de-risking data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture, transfection, and immunological assay techniques.
- Dependent on fluorescence or colorimetric detection infrastructure (e.g., plate reader at 405 nm).
- Necessitates standardization of cell density, IgE sensitization, and antigen titration across laboratories.
- Requires adaptation of antigen concentrations and incubation times when applied to different species or models.
- Limited to in vitro mediator release and may not reflect full in vivo pathophysiological complexity.
