Sviluppo di un In vitro Sistema modello per studiare l'interazione tra Equus Caballus IgE con il suo recettore ad alta affinità FcεRI

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare la quantità di rilascio di mediatore IgE dipendente dalle cellule di leucemia basofila RAD. I sintomi dell'allergia sono causati dal rilascio di mediatori come l'istamina. Ora, l'istamina non è l'unico mediatore rilasciato dai basofili sono i mastociti.

Il totale di tutti i mediatori rilasciati da queste cellule provoca segni e sintomi di ipersensibilità immediata e ritardata. Ora, gli esseri umani non sono gli unici organismi che soffrono di allergia, anche i cani e i cavalli soffrono. Al fine di sviluppare ulteriormente la ricerca e trovare trattamenti contro l'allergia come i vaccini, è necessario un test di rilascio per quantificare la quantità di mediatori rilasciati, se presenti, dal trattamento di ricerca.

Questo è il motivo di questo test di rilascio. Il saggio per il sistema umano è stato sviluppato e pubblicato per la prima volta da Ian e Hook nel 1986. In seguito è stato sviluppato per il sistema DOC e ora per il sistema del cavallo.

Le modifiche sono semplici come cambiare le proteine di interesse. La novità della linea cellulare è stata la leucemia di Rat Baso o RBL due linee cellulari H 3.1 che esprimono la catena alfa dei recettori equini ad alta FNT ffc Serin R a una densità cellulare di 500.000 cellule per millilitro. Aggiungere l'anticorpo IgE di interesse a una concentrazione finale di un nanogrammo per millilitro.

Aggiungere 100 microlitri della miscela in una piastra di terreno 96 e incubare per 16 ore a 37 gradi. Ciò consente alle cellule di aderire alla superficie del pozzetto e l'anticorpo si lega al suo recettore wash. Il doppio del terreno contenente l'anticorpo non legato rimanente e le cellule morte con 100 microlitri di tampone di rilascio caldo a 37 gradi.

Scartare il tampone dall'ultimo lavaggio e sostituirlo con 100 microlitri dell'antigene di interesse alla concentrazione di interesse. Dopo 20 minuti di incubazione a 37 gradi, trasferire 50 microlitri di natina SUP contenente i mediatori di rilascio in un nuovo pozzetto e sostituire il surnatante rimanente con 50 microlitri di tampone Triton X per liare le cellule e rilasciare i mediatori rimanenti all'interno delle cellule. A 50 microlitri di 2 milioni di molari beta hx.

Molti giorni substrato disciolto in tampone citrato. Dopo un'incubazione di due ore a 37 gradi, aggiungere 150 microlitri di tampone tris a ciascun pozzetto facendo ingiallire il pozzetto. Misurare l'assorbanza del colore a 405 nanometri Dopo 16 ore.

Riscaldare il tampone di rilascio, noto anche come tampone Ian, a 37 gradi. Preparare anche il gradiente di concentrazione dell'antigene nel tampone di rilascio alle concentrazioni. Zero: 0,1, 1, 10, 100, 1000 e 10.000 nanogrammi per millilitro.

Poi caldo a 37 gradi. Lavare i pozzetti muovendo rapidamente il piatto per rimuovere il terreno e aggiungere delicatamente 100 microlitri di tampone di rilascio caldo verso le pareti dei pozzetti. Questo per ridurre lo stress cellulare dovuto alla differenza di temperatura, che le induce a rilasciare prematuramente i mediatori.

Il piatto deve essere lavato due volte. Scartare il tampone di rilascio finale, lavare e aggiungere 100 microlitri di antigene, iniziando con una concentrazione di antigene pari a zero alla riga A per il controllo negativo, e scendendo lungo il gradiente di concentrazione dalle file B a G e infine alle fette di Triton X, tampone alla riga H. Questo è per il controllo positivo. Incubare la piastra per 20 minuti a 37 gradi.

Questo è il punto in cui le cellule rilasciano mediatori dopo il periodo di incubazione. Trasferire 50 microlitri di liquido in ogni pozzetto nel rispettivo pozzetto. Alla colonna da sette a 12 estrarre completamente e scartare il liquido rimanente nelle posizioni da uno a sei e sostituirlo con 50 microlitri di tampone di lisi Triton X.

Aggiungere 50 microlitri del substrato preparato a tutti i 96 pozzetti del piatto. Incubare a 37 gradi per due ore. Il beta H, molti giorni conversa substrato in quattro nitrofenolo.

Trascorso il periodo di incubazione, fermare la reazione aggiungendo 150 microlitri di tris tampone, trasformando i quattro nitrofenoli in un colore giallo. Leggere la lastra utilizzando uno spettrofotometro a piastra a 405 nanometri. Dopo aver misurato i dati di assorbanza, calcolare la quantità totale di mediatori all'interno delle cellule nella posizione A dei pozzetti uno moltiplicando.

Il suo pozzo corrispondente alla posizione a sette per due e aggiungendo il risultato al valore a uno. Questo perché durante l'esperimento, abbiamo il supinato contenente l'opposizione dei mediatori di rilascio A uno poiché lo abbiamo trasferito in un nuovo pozzo di opposizione. Un sette.

Ripeti i calcoli per il resto dei pozzetti. Calcola la percentuale di mediatori di rilascio nell'opposizione del pozzo, A sette dal totale calcolato dei mediatori all'interno delle celle moltiplicando il valore della posizione A sette per due. Ancora una volta, perché durante l'esperimento, abbiamo il supernat contenente i mediatori di Reese.

Quando lo abbiamo trasferito in un nuovo, allora moltiplichiamo quel prodotto per 100 e dividiamo quel prodotto per il corrispondente valore totale dei mediatori all'interno delle celle per quella posizione. Questo dà la percentuale di mediatori di rilascio per il moto ondoso. Ripetere i calcoli per il resto dei pozzetti poiché i sei rigonfiamenti in ogni fila sono sfidati dalla stessa concentrazione di antigene medio.

Questi valori e calcolano la deviazione standard, tracciano questi valori su un grafico come segue. Il grafico mostra che all'aumentare della concentrazione dell'antigene, vengono rilasciati più mediatori fino a raggiungere il picco di 100 nanogrammi per millilitro, dopodiché il rilascio di mediatori diminuisce con l'aumentare della concentrazione dell'antigene. Il risultato sperimentale finale dovrebbe assomigliare a questi grafici, come si può vedere nel grafico B.Il test di rilascio di controllo in azzurro non contiene anticorpi IgE e quindi non mostra alcun cambiamento nel rilascio del mediatore con l'aumentare della concentrazione di antigene.

Confrontate questo con il risultato sperimentale in blu scuro, che potrebbe contenere anticorpi IgE. Questo è un esempio di un vaccino anti-IgE in fase di test per la sicurezza. È chiaro da questo grafico in rosso che il siero anti-IgE lega i recettori sulla superficie cellulare causando la degranulazione delle cellule RBL proprio come si vede nel controllo positivo in viola rispetto al controllo negativo in grigio, rendendo questo vaccino non sicuro.

Questo test è molto utile in quanto può misurare il rilascio del mediatore, o il suo ritardo durante la sperimentazione di potenziali farmaci antiallergici o vaccini, può anche essere adattato per il sistema canino o equino umano, come dimostrato dal test in grado di determinare il blocco riuscito o non riuscito del rilascio del mediatore durante il test degli anticorpi antiallergici.