Sviluppo e validazione di un metodo quantitativo per PCR Equid herpesvirus-2 Diagnostica in respiratorie Fluidi

L'obiettivo generale del metodo qPCR è valutare la carica virale dell'herpesvirus-2 equino in campioni biologici di cavallo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi diagnostici delle malattie respiratorie nei cavalli, dati quantitativi su nuovi ausili interpretativi per i professionisti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è un metodo sensibile, specifico e rapido.

Un altro vantaggio è lo sviluppo secondo le norme AFNOR NF U47-600, che è il rappresentante francese nel comitato internazionale di normalizzazione. A dimostrare la procedura sarà Erika Hue, una giovane ricercatrice della mia unità. Per estrarre gli acidi nucleici da un campione biologico di fluidi respiratori, sotto una cappa aspirante iniziare aggiungendo 140 microlitri di campione biologico a 560 microlitri di soluzione di lisi e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.

Aggiungere 560 microlitri di etanolo al campione e applicare 630 microlitri della soluzione totale a una colonna di silice e a una centrifuga. Applicare i restanti 630 microlitri sulla colonna di silice e centrifugare nuovamente. Dopo che il campione è stato applicato alla colonna, utilizzare 500 microlitri ciascuno di tampone di lavaggio AW1 e AW2 per lavare la colonna due volte.

Quindi, per eluire gli acidi nucleici dalla colonna, aggiungere 50 microlitri di eluizione a temperatura ambiente o tampone AVE. Chiudere il tappo e incubare a temperatura ambiente per un minuto. Quindi centrifugare a 6.000 g per un minuto.

Per amplificare il DNA, dopo aver titolato i primer e la sonda secondo il protocollo di testo, preparare 22,5 microlitri di miscela di reazione per ogni reazione aggiungendo 12,5 microlitri di master mix PCR, 20 primer micromolari in avanti e all'indietro, 10 micromolari della sonda e acqua ultrapura sufficiente per raggiungere i 22,5 microlitri. Per evitare contaminazioni, preparare sempre la miscela di reazione PCR in un'area specifica. Aliquotare 22,5 microlitri della miscela di reazione appropriata in ciascun pozzetto di reazione di una piastra a 96 pozzetti.

Includere controlli negativi per l'estrazione e la PCR per garantire che nessuno dei reagenti sia contaminato da DNA indesiderato. Quindi aggiungere 2,5 microlitri del campione, del controllo negativo di estrazione, del controllo negativo PCR o del campione di controllo positivo ai pozzetti di reazione corrispondenti. Quindi utilizzare un sigillo adesivo per coprire la piastra.

E centrifugare a 6.000 g per 10 secondi. Posizionare la piastra in un sistema PCR in tempo reale. Quindi selezionare il modello per il layout del test e le impostazioni del programma PCR mostrate qui e avviare la corsa.

Dopo aver trasferito i dati grezzi dal sistema di PCR in tempo reale a un foglio di calcolo, impostare la soglia nei grafici di amplificazione sopra la linea di base e all'interno della regione di crescita esponenziale per ottenere il ciclo di soglia per ciascun campione. Tracciare ogni punto standard impostato come una curva standard per ottenere la linearità. Quindi calcolare il numero di copie per i diversi campioni in base alla curva standard.

Per determinare il limite di rilevabilità dei risultati della qRT-PCR, erogare 90 microlitri di acqua ultrapura in sei provette. Per preparare sei diluizioni seriali di dieci volte del plasmide per colpire la zona di abbattimento, iniziare trasferendo 10 microlitri dalla diluizione di lavoro del plasmide al tubo con 90 microlitri di acqua ultrapura. Agitare brevemente e centrifugare la provetta.

Quindi trasferire 10 microlitri dal tubo al tubo d'acqua successivo. Dopo il vortice e la centrifugazione, ripetere il trasferimento fino a quando tutte le provette d'acqua ricevono il plasmide. Dopo aver amplificato il DNA nelle sei diluizioni seriali decuplicate come descritto in precedenza in questo video, determinare la zona di abbattimento, che è l'ultima diluizione del plasmide che produce un segnale positivo e la prima diluizione senza il rilevamento.

Per preparare sei diluizioni seriali doppie erogare 25 microlitri di acqua ultrapura in sei tubi. Dall'ultima diluizione del plasmide che ha dato un segnale positivo dalle diluizioni decuplicate trasferire 25 microlitri dal tubo nel primo tubo d'acqua. Agitare e centrifugare prima di preparare le restanti cinque diluizioni come appena dimostrato.

Amplifica il DNA dalle doppie diluizioni seriali come descritto in precedenza in questo video. Dopo aver amplificato il DNA dei tre studi indipendenti, calcolare il numero di repliche positive su 24 repliche per ogni livello di concentrazione plasmidica. Determinare il LOD con un'affidabilità del 95% o il LOD 95% PCR, che è il livello che porta al rilevamento di 23 repliche positive su 24 repliche.

Per determinare il LOD del metodo: Preparare cinque diluizioni seriali doppie a partire da 25 microlitri della diluizione di lavoro del plasmide che è quattro volte più concentrata dell'ultima concentrazione da una diluizione di dieci volte che ha dato un segnale positivo. Il plasmide utilizzato nella fase di amplificazione proviene da una diluizione di lavoro del plasmide preparata in un'area specifica per evitare contaminazioni. È un passaggio fondamentale.

Trasferire 5 microlitri da ciascuna diluizione di plasmide in quattro provette con 135 microlitri del materiale risorsa negativo per ottenere quattro repliche dei cinque standard positivi. Eseguire l'estrazione delle quattro repliche per i cinque standard positivi ed eseguire la procedura di amplificazione come descritto in precedenza in questo video. Conta il numero di repliche positive su otto repliche per ogni livello di concentrazione di plasmidi.

Infine, determinare il metodo LOD, che è l'ultimo livello in cui otto repliche su otto repliche sono positive. Il metodo RT-PCR quantitativo descritto in questo video rileva e quantifica l'herpesvirus-2 equino nei fluidi respiratori. In questo esperimento, sono state effettuate diluizioni seriali di dieci volte per stimare la zona di abbattimento, che si trova tra le diluizioni 10 e il 9° negativo e 10 il 10° negativo.

Il valore di LOD PCR è stato determinato con una nuova diluizione seriale doppia nella zona di abbattimento. Per determinare l'intervallo di linearità e la LOQ PCR Il valore LOD PCR è stato utilizzato per iniziare l'intervallo di sei diluizioni seriali decuplicate tra 2,6, il valore LOD PCR, e 260.000 copie per 2,5 microlitri di campione. La LOQ PCR è la concentrazione più bassa nell'intervallo di linearità.

La caratterizzazione dell'intero metodo è la validazione di tutti i passaggi necessari per ottenere dati qRT-PCR dall'estrazione del DNA dal campione respiratorio, all'amplificazione e quantificazione del bersaglio. Le prestazioni quantitative dell'intero metodo analitico qRT-PCR sono state valutate e convalidate con un profilo di accuratezza rappresentato in questo grafico. Il genoma virale dell'EHV2 viene caricato in 172 campioni di tampone nasale di cavalli con disturbi respiratori, dove quantificato come mostrato qui.

Le cariche del genoma virale erano più alte nei cavalli giovani, con il carico più alto rilevato da 1,9 volte 10 a 11 copie per millilitro. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di due ore per fase di amplificazione e il totale delle fasi di convalida può essere eseguito in meno di quattro settimane se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di evitare il rischio di contaminazione, in particolare quando si lavora con una soluzione plasmidica.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il sequenziamento per rispondere a ulteriori domande come l'identificazione del genoma. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'estrazione e l'amplificazione del DNA e di caratterizzare le loro riserve di PCR. Non dimenticare che lavorare con campioni biologici come gli agenti patogeni può essere estremamente pericoloso.

Durante l'esecuzione di questa procedura è necessario adottare sempre alcune precauzioni, come lavorare in un cofano e un'area con livello di sicurezza adeguato.