Name: Sviluppo e validazione di un metodo quantitativo per PCR Equid herpesvirus-2 Diagnostica in respiratorie Fluidi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Impara a sviluppare e validare un metodo qPCR quantitativo per la diagnosi di EHV-2 in fluidi respiratori equini. Questa tecnica sensibile e specifica consente di quantificare il carico virale secondo gli standard AFNOR NF U47-600.

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Gli autori desiderano ringraziare Sophie Castagnet e Nadia Doubli-Bounoua per il loro supporto tecnico. Questo lavoro ha ricevuto il sostegno finanziario del Consiglio Generale del Calvados e l'accordo della Regione Bassa Normandia e del Governo francese (CPER 2007-2013; progetto R25 p3). Gli autori ringraziano gli esperti del gruppo AFNOR e in particolare Jean-Philippe Buffereau e Eric Dubois.

<ol><li>Brault, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+response+of+foals+to+natural+infection+with+equid+herpesvirus-2+and+its+association+with+febrile+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.Immunol.Immunopathol%22%5BJournal%5D)">The immune response of foals to natural infection with equid herpesvirus-2 and its association with febrile illness.</a> Vet.Immunol.Immunopathol. 137 (1-2), 136-141 (2010).</li>
<li>Fortier, G., Van Erck, E., Pronost, S., Lekeux, P., Thiry, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+gammaherpesviruses%3A+pathogenesis%2C+epidemiology+and+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.J%22%5BJournal%5D)">Equine gammaherpesviruses: pathogenesis, epidemiology and diagnosis.</a> Vet.J. 186 (2), 148-156 (2010).</li>
<li>Hue, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantitation+of+equid+gammaherpesviruses+%28EHV-2%2C+EHV-5%29+in+nasal+swabs+using+an+accredited+standardised+quantitative+PCR+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol.Methods%22%5BJournal%5D)">Detection and quantitation of equid gammaherpesviruses (EHV-2, EHV-5) in nasal swabs using an accredited standardised quantitative PCR method.</a> J Virol.Methods. 198 (1), 18-25 (2014).</li>
<li>Diallo, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+real-time+PCR+for+the+detection+and+differentiation+of+equid+herpesvirus+1+%28EHV-1%29+and+equid+herpesvirus+4+%28EHV-4%29%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiplex real-time PCR for the detection and differentiation of equid herpesvirus 1 (EHV-1) and equid herpesvirus 4 (EHV-4).</a> Vet.Microbiol. 4 (1-3), 93-103 (2007).</li>
<li>Williams, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+multinodular+pulmonary+fibrosis%3A+a+newly+recognized+herpesvirus-associated+fibrotic+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.Pathol%22%5BJournal%5D)">Equine multinodular pulmonary fibrosis: a newly recognized herpesvirus-associated fibrotic lung disease.</a> Vet.Pathol. 44 (6), 849-862 (2007).</li>
<li>Mullis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+enzymatic+amplification+of+DNA+in+vitro%3A+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.Symp.Quant.Biol%22%5BJournal%5D)">Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction.</a> Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol. 51 (1), 263-273 (1986).</li>
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<li>Telford, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+herpesviruses+2+and+5+are+gamma-herpesviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Equine herpesviruses 2 and 5 are gamma-herpesviruses.</a> Virology. 195 (2), 492-499 (1993).</li>
<li>Fortier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+equid+herpesvirus-5+in+respiratory+liquids%3A+A+retrospective+study+of+785+samples+taken+in+2006-2007%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.J%22%5BJournal%5D)">Identification of equid herpesvirus-5 in respiratory liquids: A retrospective study of 785 samples taken in 2006-2007.</a> Vet.J. 182 (2), 346-348 (2009).</li>
<li>Brault, S. A., Bird, B. H., Balasuriya, U. B., MacLachlan, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+heterogeneity+and+variation+in+viral+load+during+equid+herpesvirus-2+infection+of+foals%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic heterogeneity and variation in viral load during equid herpesvirus-2 infection of foals.</a> Vet.Microbiol. 147 (3-4), 253-261 (2011).</li>
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<li>Association Francaise de Normalisation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22NFU+47-600-2.+Animal+health+analysis+methods-PCR-Part+2%3A+Requirements+and+recommendations+for+the+development+and+the+validation+of+veterinary+PCR%22">NFU 47-600-2. Animal health analysis methods-PCR-Part 2: Requirements and recommendations for the development and the validation of veterinary PCR</a>. , (2015).</li>
<li>ISO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22EN+ISO-CEI+17025.+General+requirements+for+the+competence+of+testing+and+calibration+laboratories%22">EN ISO-CEI 17025. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories</a>. , (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Manual+of+Diagnostic+Tests+and+Vaccines+for+Terrestrial+Animals+2010.+Chapter1.1.1.4%2F+5.+Principles+and+Methods+of+Validation+of+Diagnostic+Assay+for+Infectious+Diseases%22">Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2010. Chapter1.1.1.4/ 5. Principles and Methods of Validation of Diagnostic Assay for Infectious Diseases</a>. , This thoroughly revised chapter replaces Chapter 1.1.4 Principles of validation of diagnostic assays for infectious diseases and Chapter 1.1.5 Validation and quality control of polymerase chain reaction methods used for the diagnosis of infectious diseases from the sixth edition of the OIE Terrestrial Manual (2009).</li>
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<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis.Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Sanger, F., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+determining+sequences+in+DNA+by+primed+synthesis+with+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase.</a> J Mol.Biol. 94 (3), 441-448 (1975).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
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<li>Greiner, M., Gardner, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+diagnostic+tests+in+veterinary+epidemiologic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Prev.Vet+Med%22%5BJournal%5D)">Application of diagnostic tests in veterinary epidemiologic studies.</a> Prev.Vet Med. 45 (1-2), 43-59 (2000).</li>
<li>Blanchard, P., Regnault, J., Schurr, F., Dubois, E., Ribiere, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-laboratory+validation+of+chronic+bee+paralysis+virus+quantitation+using+an+accredited+standardised+real-time+quantitative+RT-PCR+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol.Methods%22%5BJournal%5D)">Intra-laboratory validation of chronic bee paralysis virus quantitation using an accredited standardised real-time quantitative RT-PCR method.</a> J Virol.Methods. 180 (1-2), 26-31 (2012).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Dal momento che il 2000, PCR in tempo reale è stato sostituendo le tecniche d&#39;oro standard (colture cellulari e metodi di batteri cultura) in un numero crescente di laboratori. L&#39;attuazione della tecnica è relativamente facile. Tuttavia la convalida dei metodi di laboratorio è essenziale per la diagnosi molecolare e la quantificazione di agenti patogeni per garantire dati precisi, ripetibili e affidabili. Poiché la fase di estrazione è la fonte primaria di perdita di materiale biologico, può essere considerata la principale fonte di errore di quantificazione tra un protocollo e un altro. Come tale, la creazione di una curva standard di plasmide DNA durante qRT-PCR, riportati principalmente in letteratura, indica il carico genoma virale, ma non tiene conto della fase di estrazione. Descrizione di una strategia de novo di un intero processo metodo di convalida nella norma AFNOR NF U47-600-2 rappresenta un significativo progresso in questo settore. Come illustrato inquesta carta per EHV-2 in cavalli o da altri in api 21, questo richiede chiara differenziazione tra la fase di sviluppo e la fase di validazione con caratterizzazione della PCR e caratterizzazione dell&#39;intero metodo. Una limitazione di questo approccio interessante è che qualsiasi modifica del protocollo comporterà l&#39;obbligo di rinnovare il processo completo che può essere molto costoso. Questa limitazione è stata evidenziata anche dal fatto che i confini di quantificazione dipendono dalla sorgente dalla quale il virus viene estratto (ad esempio, fluidi respiratorie, organi, sangue o urina). Infatti, ogni matrice presenta differenti specificità nelle loro caratteristiche fisico-chimica ed è importante per definire in modo indipendente ciascuna matrice differente utilizzato per il rilevamento virale e quantificazione per qRT-PCR. Così, il carico genoma virale di ogni campione biologico può essere quantificata più precisamente dall&#39;estrazione. La caratterizzazione tiene conto anche il mod termociclatoreel e quando l&#39;uso di un metodo precedentemente ben caratterizzato (per esempio, il metodo EHV-2 qPCR descritto in questo documento) richiede un nuovo tipo di macchina in laboratorio genitore o altro laboratorio, si deve confermare l&#39;efficacia di tale strumento. La conferma delle prestazioni di un saggio qPCR è un prerequisito per tutte le prove mettono in un laboratorio. Ciò si ottiene normalmente analizzando un campione di riferimento con proprietà note. Tale assegno è un prerequisito e considerato obbligatorio come richiesto dalla norma NF 47-600-1 AFNOR al fine di convalidare le prestazioni del (efficienza LOD, LOQ) qPCR e la robustezza del tutto il metodo (LOD, LOQ). Non solo durante le fasi di sviluppo e caratterizzazione ma anche quando utilizzato nella ricerca o per scopi diagnostici, i fattori di rischio possono essere identificati e ben controllato per assicurare la standardizzazione del protocollo. Di particolare interesse è adeguata formazione del personale, personale altamente qualificato, il controllo di qualità dei materiali di consumousati e il loro stoccaggio, il controllo delle condizioni ambientali immediati e la consapevolezza delle condizioni metrologiche che possono influenzare le prestazioni degli strumenti scientifici coinvolti nel test. L&#39;utilizzo di campioni di riferimento per i confronti interlaboratorio potrebbe anche contribuire a controllare le incertezze. In questo modo, il confronto dei dati tra laboratori può essere facilitata. Infatti, prove di competenza interlaboratorio sono essenziali per valutare e confermare la riproducibilità del metodo. Virali risultati carico del genoma che sono espressi in unità internazionali (UI) della matrice biologica analizzato (UI: copie / ml per i liquidi o copie / g per i tessuti) sono più facili da utilizzare al fine di confrontare i risultati tra i diversi laboratori. Tutti i risultati di cui sopra il LOQ sono espressi come copie / ml e di conseguenza tra il LOD e LOQ è preso come un risultato non quantificabili positivo. Presentando i dati quantificational del genoma in questo modo si conforma più precisamente alle process di analisi (amplificazione del genoma). Infatti, in esperimenti di coltura cellulare, espressione del carico virale TCID50 (tessuto mediana cultura infettiva dose) dipende dalla natura delle cellule e ceppi di virus. Ogni linea ceppo possiede la sua cinetica di infezione unico ed alcuni virus come EHV-2 può richiedere diversi giorni prima che il primo effetto citopatico è evidente. In conclusione, questo nuovo metodo di caratterizzazione di qRT-PCR dovrebbe facilitare l&#39;armonizzazione della presentazione dei dati e l&#39;interpretazione tra i laboratori. Questo sarà molto utile per nuove applicazioni potenziali di qRT-PCR in futuro, come la creazione di un valore di cut-off per la dichiarazione dello stato di malattia anziché solo la presenza o l&#39;assenza del patogeno.

Equid herpesvirus-2 (EHV-2) è coinvolto in una sindrome respiratoria, con potenziali manifestazioni cliniche quali la secrezione nasale, faringite e gonfiore dei linfonodi 1-3. Questo virus è anche sospettato di essere associati con i poveri prestazioni di cavalli, che può provocare un impatto economico significativo e negativo per l&#39;industria del cavallo 2. Fino ad ora, il gold standard per gamma-EHV (γ-EHV) di rilevamento è stato il metodo di coltura delle cellule. Il primo inconveniente di questo procedimento era l&#39;assenza di discriminazione tra EHV-2 e altri γ-EHV di (ad esempio, EHV-5). Il secondo inconveniente è stato il lento sviluppo del processo citopatico, che dura da 12 a 28 giorni per manifestare 4,5. Sviluppo di un real-time polymerase chain reaction quantitativa convalidato e normalizzati (qRT-PCR) metodo contribuirà a individuare rapidamente il virus, di discriminare tra EHV-2 e EHV-5 e studiare il rapporto tra il carico genoma virale e la malattia grazie all&#39;aspetto quantificazione. Reazione a catena della polimerasi (PCR) è stata descritta per la prima volta nel 1986 da Mullis 6 e sta per diventare il nuovo standard nella maggior parte dei settori di diagnosi biologica (umana, ambiente e veterinaria). Questo metodo, che si basa sull&#39;amplificazione di una parte del genoma di agenti patogeni, presenta molti vantaggi: specificità, sensibilità e rapidità. Inoltre, il rischio di contaminazione ampliconi si ritirò dopo l&#39;avvento di qRT-PCR e la garanzia della qualità 7. Tuttavia, il riconoscimento di PCR come nuovo metodo gold standard richiedeva più appena migliorata dati prestazioni, ma anche la dimostrazione del controllo di sviluppo e validazione fasi dell&#39;intero metodo senza degrado delle prestazioni nel tempo. I primi strumenti molecolari utilizzati per il rilevamento di EHV-2 erano tempo cl&#39;amplificazione non specifica onsuming e coinvolto con nested PCR seguita da sequenziamento 8. I geni mirati per herpes virus sono stati acido desossiribonucleico (DNA) polimerasi e DNA confezionamento 9. Tuttavia, nested PCR presenta un elevato rischio di contaminazione da ampliconi. Da allora, i test di PCR convenzionali sono stati progettati per amplificare l&#39;interleuchina gene 10-like o gene B glicoproteina, rivisto nel 2009 2. Più di recente, le caratteristiche di PCR in tempo reale sono stati descritti per la quantificazione del EHV-2 10, ma non erano disponibili dati riguardanti la convalida dell&#39;intero metodo comprendendo il processo di estrazione. In questo protocollo, procedure di sviluppo e di validazione sono descritti per un metodo quantitativo PCR per il rilevamento e la quantificazione di EHV-2 DNA nei fluidi respiratori equini secondo l&#39;Association française de la normalizzazione (AFNOR) norma NF U47-600 3,11,12, che è il rappresentante franceseil comitato di normalizzazione internazionale. Dettagli Questa norma i &quot;Requisiti e raccomandazioni per l&#39;implementazione, lo sviluppo e la validazione di PCR veterinaria metodo di analisi della salute degli animali&quot; 11,12, secondo la NF EN ISO / CEI 17025, 2005 13 e OIE (Organizzazione Mondiale per la Salute Animale) . raccomandazioni, 2010 14 il protocollo di validazione qRT-PCR EHV-2 comporta una procedura in tre parti: (a) lo sviluppo del saggio qRT-PCR, (b) caratterizzazione dei test qRT-PCR da solo e (c) la caratterizzazione di tutta la metodo analitico (dall&#39;estrazione degli acidi nucleici dal campione biologico ad analisi PCR). La caratterizzazione del dosaggio qRT-PCR e dell&#39;intero metodo analitico comprende la definizione di due limiti: il limite di rilevazione (LOD) e il limite di quantificazione (LOQ). Il LOD 95% PCR rappresenta il più basso numero di copie di acidi nucleici per unità di volume che possono essere rilevati nel 95% di tutti i cases. Il LOQ 95% PCR rappresenta la quantità più bassa di copie di acidi nucleici che può essere determinato tenendo conto delle incertezze. Questo metodo qRT-PCR permette la rilevazione precisa e rapida quantificazione di EHV-2 nei fluidi respiratori. Inoltre, il metodo può essere applicato in altri laboratori per garantire una procedura standardizzata e modello come generale per lo sviluppo di altri nuovi saggi qRT-PCR.

<table><tbody><tr><td>AB-1900 colore naturale ABgene 96 pozzetti piastra&nbsp;</td><td>Dutsher</td><td>16924</td><td></td></tr><tr><td>Pellicola adesiva qPCR Absolute&nbsp;</td><td>Dutsher</td><td>16629</td><td>Pellicola adesiva utilizzata per sigillare la piastra prima dell'esecuzione della qRT-PCR</td></tr><tr><td>Microprovette da 0,5 ml, bordate, tappi</td><td>Dutsher</td><td>039258</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo 98%</td><td>Sodipro</td><td>SAF322941000</td><td></td></tr><tr><td>Primer</td><td>Eurofins</td><td>Ordine</td><td></td>personalizzato</tr><tr><td>Sonda</td><td>Life Technologies</td><td>Ordine</td><td></td>personalizzato</tr><tr><td>Plasmide</td><td>Eurofins</td><td>Ordine</td><td></td>personalizzato</tr><tr><td>QIAamp&nbsp; Mini kit virale a RNA (contenente: colonna QIAamp Mini, tampone AVL,&nbsp; Tampone AW1, tampone AW2, tampone AVE, provette di raccolta)</td><td>Tampone Qiagen</td><td>52906</td><td>AVL: pre-riscaldamento 5 min a 72 gradi </td></tr><tr><td>Sequenziamento C con metodo Sanger</td><td>Eurofins</td><td>Ordine</td><td></td>personalizzato</tr><tr><td>Taqman Universal PCR Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4364340</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione tampone Tris-EDTA</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-296653A</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro NanoDrop 2000c</td><td>Thermoscientific</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Sistemi PCR in tempo reale</td><td>Life Technologies</td><td>4376600</td><td>pre-riscaldamento 15 min&nbsp;</td></tr></tbody></table>

sviluppo e validazione di un metodo quantitativo per pcr equid herpesvirus-2 diagnostica in respiratorie fluidi

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Il protocollo descrive un metodo RT-PCR quantitativo per la rilevazione e la quantificazione di EHV-2 nei fluidi respiratori equini secondo la norma NF U47-600. Dopo lo sviluppo e la prima fase di validazione, sono state eseguite due fasi distinte di caratterizzazione secondo la norma AFNOR: (a) caratterizzazione del solo test qRT-PCR e (b) caratterizzazione dell'intero metodo analitico. La convalida dell'intero metodo analitico ha incluso la rappresentazione di tutte le fasi tra l'estrazione degli acidi nucleici e l'analisi PCR finale. 
La convalida dell'intero metodo è molto importante per il rilevamento del virus mediante qRT-PCR al fine di ottenere una determinazione accurata del carico genomico virale. Poiché la fase di estrazione è la fonte primaria di perdita di materiale biologico, può essere considerata la principale fonte di errore di quantificazione tra un protocollo e l'altro. Per questo motivo, la norma AFNOR NF-U-47-600 raccomanda di includere l'intervallo di diluizione del plasmide prima della fase di estrazione. Inoltre, i limiti della quantificazione dipendono dalla fonte da cui viene estratto il virus. I risultati del carico genomico virale, espressi in unità internazionali (UI), sono più facili da utilizzare per confrontare i risultati tra diversi laboratori. 
Questo nuovo metodo di caratterizzazione della qRT-PCR dovrebbe facilitare l'armonizzazione della presentazione e dell'interpretazione dei dati tra i laboratori.

Il metodo RT-PCR, come descritto sopra, è stata implementata per rilevare e quantificare equid herpesvirus-2 nei fluidi respiratori. Figura 1 illustra un diagramma di flusso schematico per lo sviluppo e la validazione di un metodo RT-PCR secondo la norma AFNOR NF U47-600. Specificità dei primer e sonde sono stati convalidati durante lo sviluppo passo-passo del PCR. Solo EHV-2 ceppi sono stati amplificati in questo sistema. Successivamente, le prestazioni della qRT-PCR doveva essere caratterizzata. In primo luogo, per stimare il LOD PCR, una diluizione seriale 6 dieci volte è stato eseguito per determinare la zona di abbattimento (Figura 2). In questo esempio, 6 diluizioni seriali dieci volte sono state fatte tra il 10 e il 10 -5 -10 (tra 26.000 e 0,26 copie / ml 2,5 di esempio) per stimare il LOD PCR. La zona di abbattimento li tra diluizioni di 10 -9 e 10 -10 (tra 2,6 e 0,26 copie / ml 2,5 di esempio). Per determinare il valore di LOD PCR in questo caso, 6 diluizioni seriali duplici del plasmide sono stati fatti in questa zona di abbattimento tra 5.2 e 0,16 copie / 2,5 microlitri del campione. Il valore di LOD PCR è stato di 2,6 copie / ml 2,5 del campione. Per determinare il campo di linearità e LOQ PCR, il valore di LOD PCR è stato utilizzato per avviare la gamma di 6 diluizioni seriali dieci volte, tra 2,6 (LOD PCR) e 260.000 copie / 2,5 campione ml. La Figura 3 illustra una regressione lineare per la EHV2 qRT-PCR da uno studio. Le prestazioni di regressione lineare (Figura 4) sono convalidati in quadruplicato utilizzando i calcoli descritti nella Tabella 3. I calcoli vengono eseguiti per definire l&#39;intervallo di linearità secondo i criteri assoluta Bias i value ≤0.25 log 10, qualunque sia il livello di carico i plasmide. In questo caso, la linearità gamma giaceva tra 2.6 e 260.000 copie / ml 2,5 del campione. Il LOQ PCR è la concentrazione più bassa nel range di linearità (cioè, 2,6 copie / 2,5 microlitri del campione in questo caso). U LIN è stata determinata da 0,12 log 10 nella gamma 2.6-260,000 copie / 2,5 ml di DNA. Dopo lo sviluppo (figura 1, blu) e caratterizzazione del qRT-PCR (Figura 1, giallo), il U47-600 norma AFNOR NF raccomanda caratterizzazione dell&#39;intero metodo analitico da estrazione del DNA da qRT-PCR (Figura 1, arancione). La sensibilità e specificità diagnostica sono stati calcolati come descritto in Tabella 4. Le prestazioni quantitative dell&#39;intero metodo analitico qRT-PCR è stata valutata e convalidati con un profilo di precisione ( <strong&gt; Figura 5). Questo protocollo, che utilizza la tecnologia molecolare state-of-the-art, ci ha permesso di rilevare e quantificare il carico genoma EHV-2 virale in 172 campioni di tampone nasale ottenuti da cavalli con disturbi respiratori e / o sospetto clinico di infezione. L&#39;incidenza di EHV-2 dal campo campioni (biologici) è stata del 50% (86/172) in questa popolazione. Le analisi quantitative hanno mostrato che virali carichi genoma di EHV-2 erano significativamente più alti nei giovani cavalli e la ripartizione dei carichi genoma virale è diminuita con l&#39;età (Figura 6). Nel presente studio, il più alto EHV-2 carico genoma virale (1,9 x 10 11 copie / ml) è stata rilevata nei puledri (Figura 6). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig1.jpg" /> Figura 1: Diagramma del flusso di lavoro per lo sviluppo (blu), la caratterizzazione del RT-PCR quantitativa(giallo) e la caratterizzazione dell&#39;intero metodo analitico da estrazione del DNA da qRT-PCR (arancione) secondo la norma AFNOR NF U47-600-2. Il grafico workflow riprende le fasi per lo sviluppo, la caratterizzazione della RT quantitativa -PCR e la caratterizzazione dell&#39;intero metodo analitico da estrazione del DNA da qRT-PCR. Per ogni passo, il grafico del flusso di lavoro indica il numero di corse necessarie, diluizioni da eseguire e il numero di analisti richiesti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig2.jpg" /> Figura 2: Determinazione della zona di abbattimento con risultati rappresentativi curve PCR in tempo reale ottenuti con 6 diluizioni seriali dieci volte di plasmide. Per stimare la zona di abbattimento, di serie 6 di dieci voltediluizioni sono fatte tra il 10 -5 (26.000 copie / ml 2,5 del campione) e 10 -10 (0,26 copie / 2,5 ml del campione). La zona di abbattimento si trova tra diluizioni di 10 -9 (2,6 copie / ml 2,5 del campione) e 10 -10 (0,26 copie / 2,5 ml del campione). In questo caso, 6 diluizioni seriali duplici di plasmide sono state effettuate in questa zona di abbattimento per determinare il livello di dettaglio del 95% di PCR, tra il 5,2 e 0,16 copie / ml 2,5 del campione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig3.jpg" /> Figura 3:. Regressione lineare per EHV2 qRT-PCR La linearità del test quantitativa è la capacità di generare risultati che sono proporzionali alla concentrazione del bersaglio presente in un intervallo specifico. Questo può essere modellatoregressione lineare (y = ax + b) tra il (soglia di ciclo o Ct) risposta strumentale e il logaritmo della quantità del target (numero di copie di destinazione / 2,5 campione mL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura .</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig4.jpg" /> Figura 4:. Prestazioni di regressione lineare di EHV-2 qPCR media pregiudizi rappresentano la differenza media tra la quantità plasmide misurata ( <img alt="fig4-1" src="/files/ftp_upload/53672/fig4-1.jpg" /> ) E la quantità teorica plasmide (x &#39;i) per ogni livello plasmide. Le barre verticali rappresentano l&#39;incertezza di linearità (U Lini) dato dalla formula <img alt="fig4-2" src="/files/ftp_upload/53672/fig4-2.jpg" /> dove SD&#39;i è la deviazione standard o<html> f quantità plasmide misurata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig5.jpg" /> Figura 5:. Profili di precisione in base ai risultati della convalida del metodo EHV-2 qRT-PCR La linea verde (cerchi) rappresenta la veridicità dei dati (errore sistematico, o bias). I limiti di accettabilità sono definiti a ± 0,75 log 10 dal laboratorio (linee tratteggiate). I limiti di precisione inferiore e la parte superiore sono stati determinati per ciascun livello di carico plasmide dalla polarizzazione media ± due volte la deviazione standard dei dati di affidabilità (linee rosse). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 1 &quot;&gt; <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig6.jpg" /> Figura 6:. Quantificazione dei carichi genoma virale di EHV-2 in base all&#39;età La distribuzione del carico virale genoma di EHV-2 rilevati nei campioni di tampone nasale è rappresentato per le diverse fasce di età. Le linee orizzontali rappresentano i valori medi entro la deviazione standard (m = mesi). * Significativamente diverso da ANOVA con test post-hoc di Newman-Keuls (p &lt;0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig6large.jpg" target="_blank">Fate clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> gene bersaglio </td><td colspan="3"> Primer, sonde e plasmide sequenze (5&#39;-3 &#39;) </td><td> posizione nucleotide </td><td> Dimensioni del prodotto (nucleotidi) </td><td colspan="2"><strong&gt; condizioni cicli termici </td><td> Riferimenti </td></tr><tr><td rowspan="4"> EHV2 gB (HQ247755.1) </td><td colspan="3"> Avanti: GTGGCCAGCGGGGTGTTC </td><td> 2113-2130 </td><td rowspan="4"> 78 </td><td> 95 ° C 5 min </td><td></td><td rowspan="4"> 11 </td></tr><tr><td colspan="3"> Reverse: CCCCCAAAGGGATTYTTGAA </td><td> 2189-2170 </td><td> 95 ° C 15 sec </td><td rowspan="2"> 45 cicli </td></tr><tr><td colspan="3"> Sonda: FAM-CCCTCTTTGGGAGCATAGTCTCGGGG-MGB </td><td> 2132-2157 </td><td> 60 ° C 1 min </td></tr><tr><td colspan="3"> plasmidi: ACCTGGGCACCATAGGCAAGGTGGTGGTCA ATGTGGCCAGCGGGGTGTTCTCCCTCTTTG GGAGCATAGTCTCGGGGGTGATAAGCTTTTT CAAAAATCCCTTTGGGGGCATGCTGCTCATA GTCCTCATCATAGCCGGGGTAGTGGTGGTG TACCTGTTTATGACCAGGTCCAGGAGCATAT ACTCTGCCCCCATTAGAATGCTCTACCCCGG GGTGGAGAGGGCGGCCCAGGAGCCGGGCG CGCACCCGGTGTCAGAAGACCAAATCAGGA ACATCCTGATGGGAATGCACCAATTTCAG </td><td> 2081-2381 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1:. Sequenze di primer, sonde e controlli positivi DNA sintetici utilizzati in questo protocollo La sequenza di plasmide (DNA sintetico positivo) corrisponde al nucleotide posizioni 2081-2381 della sequenza EHV2gB (HQ247755.1). La progettazione di primer e sonde utilizzate in questo protocollo è stata ottenuta utilizzando un software specifico. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> PATHOGENS </td><td rowspan="2"> Riferimento (origine) </td><td rowspan="2"> Numero di ceppi </td><td> RISULTATI </td></tr><tr><td> EHV-2 </td></tr><tr><td rowspan="2"> EHV-2 </td><td> VR701 (ATCC) </td><td rowspan class = &quot;2&quot;&gt; 20 </td><td rowspan="2"> Positivo </td></tr><tr><td> 20 campioni (raccolta FDL) </td></tr><tr><td rowspan="2"> EHV-5 </td><td> KD05 (Vincitore campionato tedesco) </td><td rowspan="2"> 20 </td><td rowspan="2"> Negativo </td></tr><tr><td> 20 campioni (raccolta FDL) </td></tr><tr><td rowspan="2"> EHV-3 </td><td> VR352 (ATCC) </td><td rowspan="2"> 2 </td><td rowspan="2"> Negativo </td></tr><tr><td> T934 WSV (Vincitore campionato tedesco) </td></tr><tr><td rowspan="2"> EHV-1 </td><td> ceppo Kentucky Ky A (ATCC) </td><td rowspan="2"> 3 </td><td rowspan="2"> Negativo </td></tr><tr><td> 2 campioni (raccolta FDL) </td></tr><tr><td> EHV-4 </td><td> VR2230 (ATCC) </td><td> 1 </td><td> Negativo </td></tr><tr><td> Asinine herpesvirus AHV5 </td><td> FDL Collection </td><td> 1 </td><td> Negativo </td></tr><tr><td rowspan="2"> equinoInfluenza Virus </td><td> A / equina / Jouars / 4/2006 (H3N8) </td><td rowspan="2"> 1 </td><td rowspan="2"> Negativo </td></tr><tr><td> (Adesione Number JX091752) </td></tr><tr><td> Equine Arterite Virus </td><td> VR796 (ATCC) </td><td> 2 </td><td> Negativo </td></tr><tr><td> Rhodococcus equi </td><td> FDL Collection </td><td> 1 </td><td> Negativo </td></tr><tr><td> Streptococcus equi subsp. zooepidemicus </td><td> FDL Collection </td><td> 1 </td><td> Negativo </td></tr><tr><td> Streptococcus equi subsp. equi </td><td> FDL Collection </td><td> 1 </td><td> Negativo </td></tr><tr><td> Coxiella burnetii </td><td> ADI-142-100 (Adiagene) </td><td> 1 </td><td> Negativo </td></tr><tr><td> Chlamydophila abortus </td><td> ADI-211-50 (Adiagene) </td><td> 1 </td><td> Negativo </td></tr><tr><td> Klebsiella pneumoniae </td><td> FDL Collection </td><td> 1 </td><td> Negativo </td></tr></tbody></table> Tabella 2: la specificità analitica di qRT-PCR per EHV-2. <img alt="Tabella 3" src="/files/ftp_upload/53672/53672table3.jpg" /> Tabella 3: Calcolo dell&#39;incertezza pregiudizi e linearità (adattato da NF U47-600-2 12). Per ogni prova, le prestazioni di regressione lineare (y = ax + b) vengono convalidati utilizzando la tabella dove y è la soglia ciclo ottenuti; a è l&#39;inclinazione ottenuto,. X è il livello di plasmide e b è l&#39;intercetta i è il plasmide livello (i varia da 1 a livelli k), k è il numero di livelli plasmide utilizzato (ad esempio, k = 6 in tla tabella), j è la prova (j varia da 1 a prove I), che è il numero di prove, compreso tra 3 e 6 studi (ad esempio I = 4 in questa tabella) x i è la quantità plasmide stimato per ciascuna. i plasmidi livello. x &#39;i è la quantità teorica plasmide ottenuto con l&#39;equazione x&#39; i = log 10 (x i) per ogni i plasmide livello. Durante ogni prova j, il ciclo soglia ottenuta per ogni i Livello plasmide viene calcolato con la regressione lineare y i, j = a j x i, j + b j. <img alt="table3-1" src="/files/ftp_upload/53672/table3-1.jpg" /> è la quantità plasmide misurato durante la j processo. Bias i </<html> sub&gt; è la differenza osservata tra la quantità plasmide misurata e la quantità plasmide teorico per ogni prova e ogni livello plasmide. <img alt="table3-2" src="/files/ftp_upload/53672/table3-2.jpg" /> è il valore medio di <img alt="table3-3" src="/files/ftp_upload/53672/table3-3.jpg" /> per ogni i plasmidi livello; SD &#39;i è la deviazione standard della grandezza misurata <img alt="table3-4" src="/files/ftp_upload/53672/table3-4.jpg" /> per ogni i livello di plasmide, media bias è la media di Bias i; U Lini è l&#39;incertezza linearità determinata per ogni i plasmidi livello calcolato dal SD&#39;i e intendo pregiudizi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672table3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 1 &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;fo: keep-con-next.within-page =&quot; always &quot;&gt; <tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="2"> lo stato reale del campione </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Positivo </td><td> Negativo </td></tr><tr><td rowspan="3"> I risultati ottenuti con il metodo intero </td><td> Positivo </td><td> RP (reale positivo) </td><td> FP (falso positivo) </td></tr><tr><td> Negativo </td><td> FN (falsi negativi) </td><td> RN (reale negativo) </td></tr><tr><td> Totale </td><td> RP + FN </td><td> FP + RN </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Se = RP / (RP + FN) </td><td> Sp = RN / (RN + FP) </td></tr></tbody></table> Tabella 4:. Calcolo della sensibilità diagnostica (Se) e specificità (Sp) dell&#39;intero metodo di una tabella Schwartz stato utilizzato per calcolare il confidIntervallo za al 95% di sensibilità e specificità di tutto il metodo descritto in NF U47-600-2.

Qui, presentiamo un protocollo per lo sviluppo e la convalida di un metodo PCR quantitativo utilizzato per la rilevazione e la quantificazione del DNA EHV-2 nei fluidi respiratori equini. Il protocollo di validazione EHV-2 qRT-PCR prevede una procedura in tre parti: sviluppo, caratterizzazione del solo test qRT-PCR e caratterizzazione dell'intero metodo analitico.

Sviluppo e validazione di un metodo quantitativo per PCR Equid herpesvirus-2 Diagnostica in respiratorie Fluidi

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

L'obiettivo generale del metodo qPCR è valutare il carico virale dell'herpesvirus equino-2 in campioni biologici prelevati da cavalli. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo diagnostico delle malattie respiratorie nei cavalli, fornendo dati quantitativi su nuovi strumenti interpretativi per i medici veterinari. Il principale vantaggio di questa tecnica è che è sensibile, specifica e rapida.Un altro vantaggio è lo sviluppo secondo la norma AFNOR NF U47-600, che è il rappresentante francese nel comitato internazionale di normalizzazione. A dimostrare la procedura sarà Erika Hue, una giovane ricercatrice della mia unità. Per estrarre gli acidi nucleici da un campione biologico di fluidi respiratori, sotto cappa aggiungere innanzitutto 140 microlitri di campione biologico a 560 microlitri di soluzione lisante e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.Aggiungere 560 microlitri di etanolo al campione e applicare 630 microlitri della soluzione totale su una colonna di silice e centrifugare. Applicare i rimanenti 630 microlitri sulla colonna di silice e centrifugare nuovamente. Dopo aver applicato il campione sulla colonna, utilizzare 500 microlitri di ciascuno dei tamponi di lavaggio AW1 e AW2 per lavare la colonna due volte.Quindi, per eluire gli acidi nucleici dalla colonna, aggiungere 50 microlitri di tampone di eluizione o tampone AVE a temperatura ambiente. Chiudere il tappo e incubare a temperatura ambiente per un minuto. Successivamente, centrifugare a 6.000 ×g per un minuto.Per amplificare il DNA, dopo aver titolato primer e sonda secondo il protocollo indicato nel testo, preparare 22,5 microlitri di mix di reazione per ogni reazione aggiungendo 12,5 microlitri di mix master per PCR, primer forward e reverse a 20 micromolare, sonda a 10 micromolare ed acqua ultrapura in quantità sufficiente a raggiungere il volume finale di 22,5 microlitri. Per evitare contaminazioni, preparare sempre il mix di reazione per PCR in un'area specifica. Aliquotare 22,5 microlitri del mix di reazione appropriato in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.Includere controlli negativi per l'estrazione e la PCR per assicurarsi che nessuno dei reagenti sia contaminato con DNA indesiderato. Aggiungere quindi 2,5 µL del campione, del controllo negativo di estrazione, del controllo negativo di PCR o del campione di controllo positivo alle rispettive pozzette della reazione. Utilizzare quindi un sigillo adesivo per piastre per coprire la piastra.E centrifugare a 6.000 ×g per 10 secondi. Posizionare la piastra in un sistema di PCR in tempo reale. Quindi selezionare il modello per la disposizione del saggio e le impostazioni del programma PCR mostrate qui e avviare la corsa.Dopo aver trasferito i dati grezzi dal sistema di PCR in tempo reale a un foglio elettronico, impostare la soglia nei grafici di amplificazione al di sopra della linea di base e all'interno della regione di crescita esponenziale per ottenere il ciclo di soglia per ogni campione. Riportare ogni punto del set standard come curva standard per ottenere la linearità. Quindi calcolare il numero di copie per i diversi campioni in base alla curva standard.Per determinare il limite di rilevazione dei risultati di qRT-PCR, distribuire 90 microlitri di acqua ultrapura in sei provette. Per preparare sei diluizioni seriali decrescenti di ordine dieci del plasmide al fine di mirare la zona di abbattimento, trasferire inizialmente 10 microlitri dalla diluizione lavorativa del plasmide nella provetta contenente 90 microlitri di acqua ultrapura. Vortexare brevemente e centrifugare la provetta.Quindi trasferire 10 microlitri dal tubo al tubo successivo contenente acqua. Dopo aver agitato e centrifugato, ripetere il trasferimento fino a quando tutti i tubi di acqua hanno ricevuto il plasmide. Dopo aver amplificato il DNA nelle sei diluizioni seriali decimali come descritto in precedenza in questo video, determinare la zona di riduzione, ovvero l'ultima diluizione del plasmide che produce un segnale positivo e la prima diluizione in cui non si verifica rilevamento.Per preparare sei diluizioni seriali a raddoppio, distribuire 25 microlitri di acqua ultra-pura in sei provette. Dal ultimo diluizione del plasmide che ha dato un segnale positivo nelle diluizioni decimali, trasferire 25 microlitri dal tubo alla prima provetta contenente acqua. Vortexare e centrifugare prima di preparare le rimanenti cinque diluizioni come appena dimostrato.Amplificare il DNA proveniente dalle diluizioni seriali a raddoppio come descritto in precedenza in questo video. Dopo l'amplificazione del DNA ottenuto da tre prove indipendenti, calcolare il numero di replicati positivi su 24 replicati per ciascun livello di concentrazione del plasmide. Determinare il LOD con un livello di confidenza del 95 percento, o LOD 95 percento PCR, ovvero il livello che porta al rilevamento di 23 replicati positivi su 24 replicati.Per determinare il LOD del metodo, preparare cinque diluizioni seriali a raddoppio partendo da 25 microlitri della diluizione lavorativa del plasmide che è quattro volte più concentrata dell'ultima concentrazione ottenuta da una diluizione decimale che ha dato un segnale positivo. Il plasmide utilizzato nel passaggio di amplificazione proviene da una diluizione lavorativa del plasmide preparata in un'area specifica per evitare contaminazioni. È un passaggio critico.Trasferire 5 microlitri da ciascuna diluizione del plasmide a quattro provette contenenti 135 microlitri di materiale di risorsa negativo per ottenere quattro repliche dei cinque standard positivi. Eseguire l'estrazione delle quattro repliche per ciascuno dei cinque standard positivi e procedere con la procedura di amplificazione come descritto in precedenza in questo video. Contare il numero di repliche positive su otto repliche per ciascun livello di concentrazione del plasmide.Infine, determinare il metodo del limite di rilevabilità (LOD), ovvero l'ultimo livello in cui otto replicati su otto risultano positivi. Il metodo di RT-PCR quantitativa descritto in questo video rileva e quantifica l'herpesvirus equino-2 nei fluidi respiratori. In questo esperimento, sono state effettuate diluizioni seriali decrescenti per stimare la zona di estinzione, che si trova tra le diluizioni 10 alla meno 9 e 10 alla meno 10.Il valore LOD PCR è stato determinato mediante una nuova diluizione seriale doppia nella zona di riduzione. Per determinare l'intervallo di linearità e il valore LOQ PCR, il valore LOD PCR è stato utilizzato come punto iniziale per un intervallo di sei diluizioni seriali decadi, comprese tra 2,6, il valore LOD PCR, e 260.000 copie per 2,5 microlitri di campione. Il valore LOQ PCR corrisponde alla concentrazione più bassa all'interno dell'intervallo di linearità.La caratterizzazione dell'intero metodo consiste nella validazione di tutti i passaggi necessari per ottenere dati di qRT-PCR, dall'estrazione del DNA dal campione respiratorio, fino all'amplificazione e alla quantificazione della sequenza bersaglio. Le prestazioni quantitative dell'intero metodo analitico di qRT-PCR sono state valutate e validate mediante un profilo di accuratezza rappresentato in questo grafico. I carichi del genoma virale di EHV2 in 172 campioni di tampone nasale provenienti da cavalli con disturbi respiratori sono stati quantificati come mostrato qui.I carichi del genoma virale erano più elevati nei cavalli giovani, con il carico più alto rilevato pari a 1,9 × 10¹¹ copie per millilitro. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in meno di due ore per ogni passaggio di amplificazione, e l'intero processo di validazione può essere completato in meno di quattro settimane se eseguito correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di evitare il rischio di contaminazione, in particolare quando si lavora con una soluzione plasmidica.Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come il sequenziamento, al fine di rispondere a ulteriori domande, ad esempio l'identificazione del genoma. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire l'estrazione e l'amplificazione del DNA e di come caratterizzare i propri prodotti di PCR. Non dimenticare che lavorare con campioni biologici come agenti patogeni può essere estremamente pericoloso.Alcune precauzioni, come lavorare in una cappa e in un'area con livello di sicurezza adatto, devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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