Name: Ricostituzione di una proteina transmembrana, la tensione gated canali ionici, KvAP, in Giant unilamellari vescicole per la microscopia e Patch Clamp Studies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Impara a ricostituire il canale ionico KvAP in vescicole giganti unilamellari per studi elettrofisiologici. Questo metodo consente di analizzare l'attività dei canali mediante patch-clamp in ambiente controllato.

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Ringraziamo Susanne Fenz per aver discusso la possibilità di ricostituire le proteine attraverso il rigonfiamento dell'agarosio, Feng Ching Tsai per le misurazioni attuali, e i membri attuali ed ex del gruppo Bassereau per il supporto e l'assistenza. Il progetto è stato finanziato dall'Agence Nationale de la Recherche (sovvenzione BLAN-0057-01), dalla Commissione Europea (NoE SoftComp), dall'Université Pierre et Marie Curie (sovvenzione della FED21, Dynamique des Systèmes Complexes). M.G. è stato sostenuto da una borsa di dottorato internazionale dell'Institut Curie, S.A., da una borsa di studio della Fondation pour la Recherche Médicale, G.E.S.T., da una borsa di studio internazionale Marie Curie Incoming della Commissione europea e da una borsa di studio dell'Université Pierre et Marie Curie. Le spese di pubblicazione sono state coperte dal Labex 'CelTisPhyBio' (ANR-11-LABX0038).

1. Soluzione Preparazione <ol><li> Preparare 5 ml di &#39;tampone SUV&#39; contenente KCl 5 mM, 1 mM HEPES (pH 7,4) o TRIS (pH 7,5), e trealosio mM 2. Filtrare il buffer con un filtro a siringa da 0,2 micron e dividere in 1 ml di aliquote che possono essere conservati a -20 ° C. NOTA: Per ulteriori dettagli per reagenti e strumenti sono riportati nella lista dei materiali. </li><li> Preparare 40 ml di &#39;Buffer Growth&#39; GUV che riempirà il GUV interno durante pellicola reidratazione. Per una crescita &#39;bassa percentuale di sale&#39;, unire 5 mM KCl, 1 HEPES mM (pH 7,4) o 1 TRIS mM (pH 7,5), e ~ saccarosio 400 mm. Per una crescita &#39;salina fisiologica&#39;, combinare KCl 100 mM, HEPES 5 mM (pH 7,4) o 5 mM TRIS (pH 7,5), e ~ saccarosio 200 mM. </li><li> Preparare 40 ml di &#39;osservazione Buffer&#39; per la soluzione esterna nella camera sperimentale combinando KCl 100 mM, HEPES 5 mM (pH 7,4) o 5 mM TRIS (pH 7,5), e ~ 200 mM di glucosio. NOTA: Questi buffer sono solo examples. Vedere la discussione di adeguare i buffer per altri esperimenti. </li><li> Misurare le osmolarities dei buffer di crescita e di osservazione con un osmometer. Aggiungere granuli di saccarosio o glucosio per abbinarli a entro 1% in modo che GUVs non lisi o comprimere quando trasferito dalla camera di crescita per la camera di osservazione. NOTA: In questo intervallo di concentrazione, aggiungendo 1 mM di saccarosio (13,7 mg per 40 ml) o di glucosio (7,2 mg per 40 ml) aumenta osmolarità da ~ 1 mOsm. </li><li> Filtrare i buffer di crescita e di osservazione con un filtro da 0,2 micron e conservare a 4 ° C per inibire la crescita batterica. </li><li> Sciogliere 50 mg di beta-caseina in 10 ml di 20 mM TRIS (pH 7,5) buffer per formare una soluzione di beta-caseina 5 mg / ml necessario per passivare le superfici delle camere sperimentali in modo che non si attacchino GUVs, diffondono e scoppio. Una volta che la beta-caseina è completamente sciolto (fino a diverse ore a 4 ° C), il filtro (0,2 micron) in 0,5 ml aliquote che può essere istantaneo congelato e conservatoa -20 ° C per un uso successivo (aliquote scongelati conservati a 4 ° C in genere può essere utilizzato per un massimo di un 1 settimana). </li></ol> 2. SUV Preparazione <ol><li> Preparare e congelare aliquote di Proteo-SUV seguito il protocollo dettagliato pubblicato in precedenza 28. Utilizzare KvAP fluorescente con Alexa-488 maleimmide, ricostituito in DPhPC SUV (10 mg / ml) ad una proteina rapporto lipidi di 1:10 (massa). NOTA: Wild-tipo KvAP contiene una cisteina per monomero situato vicino al C-terminale intracellulare (aminoacidi 247). </li><li> Fluorescenti, solo lipidi-SUV: NOTA: Maneggiare cloroformio sotto una cappa di indossare guanti di nitrile e occhiali di sicurezza. Evitare l&#39;uso di qualsiasi plastica come cloroformio possa dissolversi. Le soluzioni cloroformio possono essere conservate in flaconi di vetro ambrato con tappi in teflon e trasferiti tramite siringhe di vetro. Fare attenzione a lavare la vetreria almeno 5 a 10 volte con cloroformio prima e dopo pipettaggio lipidi. <ol><li> Preparare 100 ml di10 SUV mg / ml DPhPC contenenti 0,5 moli% del lipide fluorescente rossa, Texas Red-DHPE, mescolando 100 ml di soluzione DPhPC (10 mg / ml in cloroformio) con 8,2 ml di soluzione di Texas Red-DHPE (1 mg / ml in metanolo) in una fiala di vetro da 1,5 ml ambra. </li><li> Essiccare i lipidi sotto un flusso di azoto in una cappa chimica durante la rotazione della fiala. Quando il film appare asciutto, i lipidi sotto vuoto per 3 ore per rimuovere qualsiasi solvente residuo. </li><li> Aggiungere 100 ml di buffer di SUV per i lipidi, e vortice vigorosamente fino a quando non lipidico rimane attaccato alle pareti del flaconcino e la soluzione è uniformemente lattiginoso. </li><li> Sonicare la soluzione lipidica per formare SUV. Regolare la posizione di flaconcino fino ultrasuoni provoca la maggior parte dei movimenti e il flusso all&#39;interno del flacone, e fare attenzione a non riscaldare la soluzione inutilmente. Continuare sonicazione finché la soluzione diventa trasparente, o quando possibile, trasparente (2-5 min per la punta sonicazione, ~ 20 min per il bagno sonicazione). </li><li> Aliquot SUV (ad esempio, 10 microlitri o 20 microlitri) e congelamento (-20 ° C) per un uso successivo. NOTA: Lipidi, in particolare lipidi insaturi, può facilmente ripartizione. Solutions Store lipidiche a 20 ° C (o 80 ° C) sotto argon e utilizzare entro 6 mesi. Prodotti di degradazione lipidi possono essere rilevati con cromatografia su strato sottile. </li></ol></li></ol> 3. GUV crescita da Electroformation <ol><li> Preparare la camera electroformation. <ol><li> Se la camera non è stata pulita, rimuovere le finestre, pulire tutto sigillante e grasso, estrarre i cavi, e risciacquare e macchia la camera con un tessuto con acqua ed etanolo (≥70%) alternativamente. </li><li> Rub i fili ben, immergere i fili e camera in acetone e ultrasuoni per 5 min. Pulire il tutto con un panno di nuovo con acetone. Mettere la camera in etanolo ed ultrasuoni per 5 min. </li><li> Montare la camera inserendo i fili attraverso i fori, e ruotare e pulire i fili per assicurarsi che are pulito. Mettere la camera in acqua distillata, con ultrasuoni per 5 min e asciugare la camera con un flusso di azoto o aria. </li></ol></li><li> Preparare 30 ml di 3 mg / sospensioni SUV ml in tampone SUV. Per formare GUVs contenenti proteine, combinare 8 ml di Proteo-SUV (DPhPC 10 mg / ml KvAP 1,10), 2 ml di SUV fluorescenti (10 mg / ml DPhPC, 0.5 mol% TexasRed-DHPE) e 20 ml di SUV buffer in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga per una proteina finale lipidi (massa) rapporto di 1: 12,5 e 0,1 moli% TexasRed-DHPE. Mescolare la soluzione vigorosamente. <ol><li> In alternativa, a praticare il protocollo con lipidi solo SUV, semplicemente unire 10 ml di SUV fluorescenti (10 mg / ml DPhPC e 0,5 mol% TexasRed-DHPE) con tampone SUV 20 microlitri. </li></ol></li><li> Depositare la soluzione SUV. <ol><li> Utilizzare una pipetta 2 microlitri o 5 microlitri siringa di vetro depositare piccole (&lt;0,2 microlitri) gocce della soluzione SUV sui fili. Circa è necessario 1 ml di soluzione per formare una serie di gocce lungo1 cm di filo. Assicurarsi che le gocce sono abbastanza piccoli e una distanza tra loro che non si tocchino o il fusibile. </li><li> Lasciate che i SUV depositati asciugare per ~ 30 minuti all&#39;aria aperta. Quando tutte le gocce sono insediati, ruotare il filo in modo depositi lipidici sono più facili da osservare con il microscopio. NOTA: Se i SUV non si asciugano abbastanza, si può solo lavare i fili quando si aggiunge il buffer di crescita, mentre l&#39;essiccazione troppo può danneggiare la proteina. Perché l&#39;umidità dell&#39;aria influenza la velocità di asciugatura, il tempo di asciugatura e / o umidità dell&#39;aria può essere regolata per ottenere risultati ottimali 30. Il film lipidico sui fili dovrebbe essere visibili al microscopio. </li></ol></li><li> Montare la camera. <ol><li> Sigillare il fondo della camera: utilizzare una siringa per applicare grasso per vuoto al fondo della camera intorno ai tre pozzi e premere 40 x 22mm coprioggetto delicatamente contro di essa per sigillare il fondo della camera in modo che aderisca senza fessure. Sigillare le pareti della camera in cui l&#39;uscita (fili) conpasta di tenuta. Applicare grasso per vuoto sulla parte superiore della camera di delineare i tre pozzi. </li><li> Lentamente aggiungere buffer di crescita fino a quando ogni bene è riempito al top. Evitare qualsiasi movimento rapido della soluzione nei pozzetti come questo può togliere il film lipidico fuori gli elettrodi. </li><li> Chiudere la camera premendo il coperchio slitta superiore delicatamente sul grasso, facendo attenzione a non spostare il coprioggetto fondo. Utilizzare un tessuto per rimuovere eventuali gocce di tampone ai bordi del coperchio superiore di slittamento. NOTA: Questo è un buon momento per esaminare la camera al microscopio per confermare che il film lipidico è rimasto sui fili. </li></ol></li><li> Collegare il generatore di segnale per i cavi utilizzando due morsetti a coccodrillo. Impostare la frequenza (10 Hz / 500 Hz onda sinusoidale per il buffer di sale basso / alto) e utilizzare un multimetro per misurare e regolare la tensione attraverso i fili di 0,7 / 0,35 V radice quadrata (Vrms) per il buffer di sale bassa / alta media. Coprire la camera con un foglio di alluminio per proteggere i fluorofori dalla luce. Lascia tegli GUVs a crescere da 2 a 3 ore per il buffer di sale basso, e 12 ore o O / N per il buffer di sale. </li><li> Scollegare la camera dal generatore e con attenzione posizionarlo su un microscopio invertito per valutare la crescita GUV. Usa movimenti lenti e costanti o il flusso di liquido nei pozzetti possono staccarsi prematuramente GUVs dai fili. NOTA: GUVs sui bordi di filo sono di solito visibili in contrasto di fase (40X obiettivo lunga distanza di lavoro), mentre GUVs ovunque nella metà inferiore dei fili può essere visto con epifluorescenza. Se non GUVs sono visibili, provare a ruotare i fili di guardare la superficie superiore. GUVs possono essere conservati a 4 ° C in una camera di crescita per diversi giorni. </li></ol> 4. GUV crescita da gonfiore Gel-assistita <ol><li> Preparare 10 ml di una soluzione di agarosio 1% mescolando 100 mg di agarosio con 10 ml di acqua pura. Riscaldare fino ad ebollizione ponendolo in un forno a microonde a 480 W per ~ 20 sec. Mescolare per assicurarsi che il agarosio è completamente sciolto. NOTA: La soluzionepuò essere conservato a 4 ° C e riscaldato quando necessario. </li><li> Plasma-pulito (plasma ad aria) una copertura scorrevole per 1 min in modo che la soluzione di agarosio si diffonda bene su di esso. Utilizzare il coperchio-diapositive entro i prossimi 15 minuti, come l&#39;effetto di pulizia al plasma svanisce rapidamente. </li><li> Applicare 200 microlitri di soluzione di agarosio calda per ogni 22 x 22 mm 2 scorrimento per cui la soluzione bagna l&#39;intera superficie. Inclinare la slitta verticale e toccare il bordo inferiore di un tessuto per rimuovere il liquido in eccesso e lasciare solo uno strato liscio sottile di agarosio sul vetrino. </li><li> Posizionare il vetrino su una piastra calda o forno a 60 ° C e lasciare asciugare per almeno 30 minuti. Il film agarosio è difficilmente visibile a occhio. Dopo i vetrini raffreddare a RT, utilizzarli immediatamente, o memorizzarli fino ad una settimana in un contenitore chiuso a 4 ° C. </li><li> Posizionare il vetrino agarosio rivestite in un piatto di serie 3,5 centimetri Petri. </li><li> Preparare la soluzione SUV come nella sezione 3.2 e applicare ~ 15 ml di soluzione di SUV (3 mg / ml lipidi) in~ 30 piccolissime gocce delicatamente sulla superficie agarosio. Fare attenzione a non alterare lo strato di agarosio troppo. </li><li> Posizionare il vetrino sotto leggera corrente di azoto per circa 10-15 min e seguire l&#39;evaporazione del buffer occhio come goccioline asciugare. </li><li> Non appena le SUV sono asciugati, aggiungere buffer di crescita per coprire la superficie di scorrimento. Per un piccolo 3,5 centimetri Petri dish uso ~ 1 ml di tampone. </li><li> Lasciare che il gonfiore di procedere per ~ 30 minuti, e poi esaminare la crescita del GUVs nella camera utilizzando un microscopio invertito con contrasto di fase o differenziale contrasto interferenziale (DIC). NOTA: osservazione epifluorescenza è difficile a causa della forte background di fluorofori nel gel e l&#39;auto-fluorescenza del agarosio. </li></ol> 5. Raccolta e Observing GUVs <ol><li> Passivare la camera di osservazione (ad esempio, piccola scatola di Petri o vetrino di vetro) in modo che non si attacchino GUVs, diffondere e scoppiò sul fondo della camera. Coprire il chamber fondo con soluzione di beta-caseina, incubare per 5 min, sciacquare la soluzione di caseina con acqua pura, secco con una corrente di aria o azoto, e infine aggiungere buffer di osservazione (ad esempio, ~ 5 mm di profondità in una piccola capsula di Petri). </li><li> Raccogliere le GUVs. Tagliare la fine di un 100 puntali delle pipette microlitri modo che l&#39;apertura è più grande (~ 2 mm di diametro), e aspirare lentamente la sollecitazione di taglio di pipettaggio può facilmente distruggere GUVs. <ol><li> Per GUVs elettro-formato, aprire la camera di crescita rimuovendo delicatamente il vetrino superiore. Posizionare la punta della pipetta direttamente sopra ogni filo e aspirare ~ 50 ml mentre si muove la punta della pipetta lungo il filo per staccare i GUVs. NOTA: Può essere utile per ruotare il filo di raccogliere GUVs sul &quot;dall&#39;altra parte&quot; del filo. </li><li> Per GUVs &quot;gel assistita gonfiore&quot;, prima toccare il lato della capsula di Petri un paio di volte per aiutare i GUVs staccano dalla superficie coprioggetto. Posizionare il puntale appena sopra il vetrino e aspirare 50 ml mentre pulling la punta di nuovo sulla superficie. Direttamente trasferire GUVs raccolte ad una camera di osservazione, o conservare in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga a 4 ° C per 1 settimana. </li></ol></li><li> Posizionare la camera di osservazione su un microscopio invertito, aggiungere i GUVs alla camera di osservazione, e attendere alcuni minuti per i GUVs di stabilirsi sul fondo della camera. </li><li> Indagine la camera con contrasto di fase o DIC per individuare rapidamente lisci, sferici («difetto liberi&quot;) &quot;candidati GUV&quot;. Esaminare ogni &quot;GUV candidato&quot; in epifluorescenza per escludere eventuali contenenti liposomi minori annidati dentro. Infine, verificare che l&#39;intensità di fluorescenza lipidica è uniforme e compatibile con una sola membrana (cioè, unilamellare). NOTA: In alcuni bilamellar (o multi-lamellari) vescicole, le membrane sono troppo vicini per essere risolti in modo che appaiono unilamellare in contrasto di fase o immagini DIC. Tuttavia, questi oggetti possono essere distinti da UNILAME realeGUVs Llar di loro fluorescenza dei lipidi, che è due volte (o più) più brillanti. </li></ol> 6. GUVs-Patch di serraggio <ol><li> Fai pipette di patch con un 1-2 micron punta di diametro in vetro borosilicato capillare standard utilizzando il programma consigliato per l&#39;estrattore pipetta. NOTA: trattamenti speciali come lucidatura fuoco non sono necessari, e pipette possono essere utilizzati per diversi giorni dopo che sono stati tirati se sono tenuti in una scatola chiusa. </li><li> Passivare la camera di incubazione con una soluzione di beta-caseina (5 mg / ml) per garantire che non aderiscono GUVs, diffondono e rottura sulle superfici della camera. Risciacquare la caseina dopo 5 min. </li><li> Inserire l&#39;elettrodo di terra, riempire la camera con il tampone di osservazione, trasferire 10 ml di sospensione GUV come descritto al punto 5.2 e 5.3, e attendere alcuni minuti per i GUVs di stabilirsi sul fondo. </li><li> Riempire una pipetta di patch fresco con la soluzione (tampone di osservazione o un&#39;altra soluzione iso-osmotica) emontarlo dell&#39;amplificatore headstage patch-clamp. </li><li> Ricerca attraverso la camera di individuare un GUV &quot;senza difetti&quot;, come descritto nella sezione 5.4, e controllare che contiene la proteina fluorescente. </li><li> Applicare una costante pressione positiva (&gt; 100 Pa, o circa 1 cm H 2 O in un manometro) per mantenere la pipetta di patch interno pulito, e inserire la pipetta di patch nella camera. Portare la pipetta di patch nel campo di vista, applicare impulsi di prova per misurare / risarcire l&#39;offset e la resistenza di tensione pipetta, ed esaminare la pipetta sotto illuminazione fluorescente per confermare che la punta è pulito. </li><li> Portare la pipetta di patch verso il GUV, e se necessario, ridurre simultaneamente la pressione positiva in modo che il flusso verso l&#39;esterno dalla pipetta di patch non rende il GUV &quot;scappare&quot;. Quando la pipetta patch è vicino alla GUV, applicare una pressione negativa (fino a 5 cm H 2 O) per tirare la GUV contro la pipetta patch. Monitorare la resistenza come &quot;, La lingua &quot;della membrana GUV entra nella pipetta di patch e le forme gigaseal. </li><li> Se un gigaseal non formano, rimuovere la pipetta di patch dalla camera e tornare al punto 6.4. Se la patch di membrana formato un gigaseal, ma il GUV rimane attaccato alla pipetta, asportare la patch tirando dalla GUV, scoppiando il GUV contro il fondo della camera, o brevemente spostare la pipetta dalla soluzione. </li><li> Quando la patch membrana inside-out è stato asportato dal GUV e gigaseal è stabile, spegnere gli impulsi di prova e applicare un protocollo di tensione come quello mostrato in Figura 13. NOTA: Figura 13 segue la convenzione elettrofisiologico standard per una patch inside-out in cui la corrente che scorre nel patch-elettrodo è &quot;positivo&quot;, e bagno V = V - V pipetta. Tenendo la patch ad un potenziale negativo (ad esempio, V = -100 mV) per ~ 30 secondi posti KvAP in stato di riposo, mentre passi (100 msec a 5 sec) a potenziali più positivi (ad esempio, V = 100 mV) può quindi guidare in conduttivi (cioè, aperti) stati attivi. </li><li> Dopo misurazioni su un cerotto membrana sono finiti, rompere la patch con un impulso zapping o pressione e verificare che l&#39;offset dell&#39;elettrodo cerotto tensione non è spostata. Rimuovere la pipetta di patch dalla camera, e tornare al punto 6.4. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Sistemi modello biomimetici sono uno strumento importante per lo studio delle proprietà e le interazioni delle proteine ​​e delle membrane. Rispetto ad altri sistemi ricostituiti come BLM o membrane lipidiche supportati, GUV sistemi basati presenti diverse opportunità anche notevole controllo della composizione di membrana, la tensione e la geometria, oltre ad essere veramente senza olio. Tuttavia, incorporando proteine ​​transmembrana, come KvAP, in GUVs richiede adeguamenti significativi di protocolli convenzionali pe...

Quando si studiano i principi fisici che governano i sistemi viventi, approcci bottom-up permettono uno sperimentatore di controllare la composizione del sistema e altri parametri che non sono facilmente manipolabili in sistemi basati su celle 1. Per i processi basati membrana, Giant unilamellari vescicole (GUVs, diametro ~ 1-100 micron) hanno dimostrato di essere un sistema molto utile biomimetico 2-7 in quanto sono adatti per gli studi di microscopia e micromanipolazione 8-10. Mentre ci sono molti protocolli diversi per produrre GUVs, la maggior parte rientrano in due categorie - emulsione a base avvicina 11,12 e tecniche basate su reidratante un film lipidico 13-16. Nei metodi basati emulsione, i volantini interni ed esterni delle membrane GUV sono assemblati sequenzialmente da monostrati lipidici alle interfacce acqua / olio. Questo approccio è ideale per incapsulare proteine ​​solubili connei GUVs, e per formare GUVs con asimmetrico composizione lipidica volantino. Tuttavia, GUVs formati da emulsioni possono conservano tracce di solvente che modificano le proprietà meccaniche della membrana 17, e l&#39;approccio non è particolarmente adatto a trans-membrana proteica ricostituzione. Metodi reidratazione Film basano sul fatto che l&#39;essiccazione (disidratazione) provoca molti miscele lipidiche a formare una pila multi-lamellare membrane. Se questo stack viene poi messo in contatto con un tampone acquoso, membrane della pila si sposteranno flussi a parte come solventi tra loro e sulla superficie della pila, singoli membrane possono staccarsi per formare GUVs 13,18 (così un vero e proprio zoo altri oggetti lipidiche). Tuttavia, anche per il tampone e lipidi composizioni ottimali, questo classico metodo di &quot;gonfiore spontaneo&quot; ha una relativamente bassa resa di GUVs prive di difetti. Un metodo ampiamente utilizzato per aumentare la resa di GUVs privi di difetti è &quot;electroformation221 ;, in cui si applica un campo di corrente alternata (AC) durante pellicola reidratazione. Mentre il meccanismo resta poco conosciuto, &quot;electroformation&quot; può dare rendimenti GUV spettacolari (&gt; 90% in circostanze favorevoli) per i buffer di concentrazione bassa di sale (&lt;5 mm) 14,19, e può anche lavorare in tamponi fisiologici (~ 100 mm) con una frequenza più alta (500 Hz versus 10 Hz) campo AC e elettrodi di platino 15. Un approccio alternativo per aumentare la resa di GUVs senza difetti è &quot;gel assistita rigonfiamento&quot;, in cui la soluzione lipidica viene depositato su un substrato di gel polimerico piuttosto che passiva (ad esempio, di vetro, PTFE) substrati usati in classica &quot;gonfiore spontanea &quot;. Quando il film lipidico / gel risultante viene reidratato, GUVs possono rapidamente formare anche per i buffer fisiologici 16,20. Tutti questi metodi possono produrre solo GUVs lipidi che possono essere utilizzati per studiare membrana associata fenomeni come lainterazione tra proteine ​​solubili e le membrane. Tuttavia, a includere una proteina trans-membrana nella GUVs, sono necessarie modifiche significative per garantire che la proteina rimane in uno stato funzionale durante la procedura di ricostituzione. Mentre le soluzioni di lipidi in solventi organici (ad esempio, cloroformio, cicloesano) sono ideali per la produzione di film lipidici, proteine ​​transmembrana sono tipicamente stabile solo quando la loro idrofoba dominio trans-membrana viene incorporato in un doppio strato lipidico, o circondato da una micella detergente ( ad esempio, durante la purificazione della proteina). Così, il materiale di partenza per una ricostituzione è tipicamente membrane native, proteina purificata in una soluzione detergente, o piccole vescicole contenenti proteine ​​unilamellari (Proteo-SUV) e / o vescicole multi-lamellari (Proteo-MLV) formate da rimozione del detersivo nel presenza di lipidi. La maggior parte dei metodi per incorporare queste proteine ​​di membrana in GUVs rientrano in tre categorie. Diretta insertion: proteine ​​transmembrana sospeso nel detergente viene mescolato con preformati, lipidi-solo, GUVs solubilizzate leggermente detergenti, e il detersivo poi rimosso utilizzando biobeads 21. Mentre concettualmente semplice, questo metodo richiede un controllo preciso della concentrazione di detersivo, come troppo alta concentrazione di detersivo può sciogliere i GUVs mentre una concentrazione troppo bassa può causare la proteina di dispiegarsi o aggregata. GUV / Proteo-SUV Fusion: Proteine ​​in Proteo-SUV è combinato con preformati, lipidi soli GUVs e la fusione è facilitata con particolari peptidi fusogeniche 22 o detersivo 21. In genere il grado di fusione è limited portando a GUVs a bassa densità di proteine. Disidratazione / reidratazione: Un film lipidico contenente proteine ​​è formata mediante disidratazione parziale di un proteo-SUV (o Proteo-MLV) e soluzione GUVs vengono poi coltivata come un film lipidico pura. La sfida è ovvio per proteggere la proteina durante la dehydrati parzialiil passo 23, ma il metodo è stato utilizzato con successo per la ricostituzione delle proteine ​​trans-membrana, come batteriorodopsina, calcio-ATPasi, integrina e VDAC in GUVs 7,23 - 25. Questo articolo descrive i protocolli disidratazione / reidratazione per rendere GUVs contenenti il canale del potassio voltaggio-dipendenti, KvAP, dalla iper-termofila Archaea, Aeropyrum PERNIX. KvAP ha un alto grado di omologia con i canali del potassio voltaggio dipendenti eucariotiche 26 e una struttura cristallina nota 27 , il che rende un buon modello per studiare il meccanismo di tensione gating. Produzione di Proteo-SUV è stato descritto nel dettaglio in precedenza e non è parte di questo tutorial 26,28,29. È importante sottolineare che, KvAP Proteo-SUV non devono essere prodotte per ogni preparazione GUV, in quanto possono essere memorizzati in piccoli (ad esempio, 10 ml) aliquote a -80 ° C per lunghi periodi di tempo (&gt; 1 anno). Electroformationo gonfiore gel assistita può quindi essere utilizzato per far crescere GUVs dalle KvAP Proteo-SUV (o Proteo-MLV). I passi fondamentali per il protocollo electroformation sono illustrati nella Figura 1. Goccioline di una soluzione di SUV contenenti la proteina si depositano sui fili di platino (mostrati nella Figura 2). Disidratazione parziale della sospensione SUV porta alla formazione di un film lipidico proteine ​​mediante la fusione di SUV. Durante reidratazione, un campo AC viene applicata agli elettrodi per aiutare gli strati lipidici delaminazione e formare GUVs. Un campo 10 Hz funziona bene quando si usa &quot;basso contenuto di sale&quot; (&lt;5 mm) buffer di reidratazione 28 e GUVs richiedere diverse ore a crescere. Al contrario, i buffer fisiologici (contenente ~ 100 mM sale) lavorare bene con una tensione più bassa, 500 Hz campo AC ma richiedono un prolungato (~ 12 ore) gonfiore periodo 15. Questo metodo si basa su un protocollo precedente utilizzando ITO vetrini 24, ma utilizza una camera di cont personalizzatoaining due fili di platino, come illustrato nella figura 2 (vedi la discussione per i dettagli di design e suggerimenti per semplificare, camere improvvisato). La figura 3 illustra il metodo di soffiatura gel assistita. Il protocollo funziona bene con tamponi con concentrazioni saline fisiologiche, è rapido, e produce GUVs con una distribuzione più omogenea della proteina. Tuttavia, il rendimento di isolati, GUVs apparentemente difetto liberi (cioè, la membrana GUV è uniforme a lunghezza-righe ottiche e non racchiude oggetti) è inferiore, anche se fornisce un numero sufficiente di patch-clamp ed esperimenti micro-manipolazione . Questo metodo è basato su un protocollo utilizzando gel di agarosio per produrre solo lipidi GUVs 16 e richiede attrezzature meno specializzata rispetto al metodo electroformation. La caratterizzazione dei GUVs con microscopia a fluorescenza è descritto, così come procedure utilizzando uno standard patch-clamp set-up dimisurare l&#39;attività KvAP in &quot;inside-out&quot; escisse patch di membrana. Growing GUVs contenenti proteine ​​può essere più difficile che GUVs solo lipidi. In particolare, la resa finale può dipendere GUV sensibilmente esattamente come la soluzione SUV viene deposto e disidratato per formare la pila membrana. Per qualcuno senza alcuna precedente esperienza con GUVs, può essere utile a crescere prima GUVs solo lipidi seguendo un protocollo convenzionale 15,16 in cui il film membrana è formata depositando lipidi da un solvente organico. Una volta che il protocollo tradizionale funziona bene, SUV deposizione e disidratazione parziale possono essere masterizzati utilizzando SUV solo lipidi, che sono anche molto utile quando si regola il protocollo per una nuova composizione lipidica. Quando GUVs crescono in modo affidabile da SUV solo lipidi, è quindi solo un piccolo passo per la produzione di proteine ​​contenenti GUVs da Proteo-SUV.

<table><tbody><tr><td>DPhPC (1,2-difitanol-sn-glicero-3-fosfocolina)</td><td>Avanti Polar Lipids&nbsp;</td><td>850356P</td><td></td></tr><tr><td>Uovo PC L-&alfa;-fosfatidilcolina (uovo, pollo)&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids&nbsp;</td><td>840051P</td><td></td></tr><tr><td>Uovo PA L-&alfa;acido fosfatidico (uovo, pollo)</td><td>Avanti Polar Lipids&nbsp;</td><td>840101P</td><td></td></tr><tr><td>18:1 (&Delta; 9-cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Avanti Polar Lipids&nbsp;</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>Colesterolo (lana ovina, >98%)&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids&nbsp;</td><td>700000P</td><td></td></tr><tr><td>TRed-DHPE</td><td>Invirtogen</td><td>T-1395MP</td><td>lipidi marcati</td></tr><tr><td>BPTR-Ceramide</td><td>Invirtogen</td><td>D-7540&nbsp;</td><td>lipidi marcati</td></tr><tr><td>Choloroform</td><td>VWR</td><td>22711.290</td><td>AnalaR Normapur</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>VWR</td><td>20066.296</td><td>AnalaR Normapur</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>20821.330</td><td>AnalaR Normapur</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe Hamilton&nbsp;</td><td>Hamilton Bonaduz AG</td><td></td><td>diverse</td></tr><tr><td>Fiale di ambra e coppette in teflon</td><td>Sigma</td><td>SU860083 e SU860076</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>291-1214</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>diverse</td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Euromex</td><td>LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C)</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma</td><td>84097-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G8270-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Trealosio</td><td>Sigma</td><td>T9531-25G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H3375-100G</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Euromex</td><td>EU0011-A</td><td></td></tr><tr><td>Osmometro</td><td>Wescor</td><td>Vapro</td><td></td></tr><tr><td>ppH Misuratore</td><td>Schott strumenti</td><td>Lab850</td><td></td></tr><tr><td>Sonicatore</td><td>Elmasonic</td><td>S 180 H</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa 0,2 & micro; m</td><td>Sartorius steim</td><td>Minisart 16532</td><td></td></tr><tr><td>Generatore di funzioni</td><td>TTi</td><td>TG315</td><td></td></tr><tr><td>Fili di platino</td><td>Goodfellow</td><td>LS413074</td><td>99,99+%, d = 0,5 mm</td></tr><tr><td>Politetrafluoroetilene</td><td>Goodfellow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning 'grasso per alto vuoto'VWR</td><td></td> <td>1597418</td><td></td></tr><tr><td>pasta sigillante</td><td>Vitrex medical A/S, Danimarca</td><td>REF 140014</td><td>Sigillum Wax</td></tr><tr><td>Guide di copertura 22 x 40 mm No1.5</td><td>VWR</td><td>631-0136</td><td></td></tr><tr><td>Slitte di copertura 22 x 22 mm No1.5</td><td>VWR&nbsp;</td><td>631-0125</td><td></td></tr><tr><td>Pulitore al plasma</td><td>Harrick</td><td>PDC-32G</td><td>airplasma, impostazione 'alta'</td></tr> <tr><td>Piastre di Petri</td><td>Falcon BD</td><td>REF 353001</td> Amplificatore patch clamp <td>da 3,5 cm x 1 cm</td></tr><tr><td>Axon</td><td>instruments</td> Scheda DAQ <td>Multiclamp700B</td><td></td></tr><tr><td></td><td>National Instruments</td><td>PCI-6221</td><td></td></tr><tr><td>Versione</td><td>Labview National Instruments</td><td> 8.6</td><td></td></tr><tr><td>Pipette in vetro silicato di boro OD 1&nbsp; mm ID 0,58&nbsp; mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC100-15</td><td></td></tr><tr><td>Porta elettrodo</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td>Q45W-T10P</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Sutter&nbsp;</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per pipette</td><td>Sutter&nbsp;</td><td>P-2000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera</td><td>ProSilica&nbsp;</td><td>GC1380</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Zeiss</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 135</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo</td><td>Zeiss</td><td></td><td>40X lunga distanza di lavoro, Obiettivo a contrasto di fase</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td></td><td>100X Plan-Apochromat NA 1.3</td></tr><tr><td>Filterset GFP (per Alexa-488)</td><td>Horiba</td><td>XF100-3</td><td></td></tr><tr><td>Filterset Cy3 (per TexasRed)</td><td>Horiba</td><td>XF101-2</td><td></td></tr><tr><td>beta-caseina</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C6905-1G</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Nikon Eclipse TE 2000-E</td><td></td><td>D-Eclipse C1 testa confocale</td></tr><tr><td>Obiettivo</td><td>Nikon</td><td></td><td>Plan Fluor 100X NA 1.3</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>per l'elaborazione delle immagini e l'analisi delle tracce di corrente</td></tr></tbody></table>

ricostituzione di una proteina transmembrana, la tensione gated canali ionici, kvap, in giant unilamellari vescicole per la microscopia e patch clamp studies

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant unilamellari vescicole (GUVs) sono un popolare sistema biomimetico per studiare membrana fenomeni associati. Tuttavia, comunemente usato protocolli di crescere GUVs devono essere modificati in modo da formare GUVs contenenti proteine ​​transmembrana funzionali. Questo articolo descrive due metodi disidratazione-reidratazione - electroformation e gonfiore gel assistita - per formare GUVs contenenti il ​​canale del potassio voltaggio-dipendenti, KvAP. In entrambi i metodi, una soluzione di piccole vescicole unilamellari contenenti proteine ​​è parzialmente disidratato per formare una pila di membrane, che viene poi lasciata rigonfiare in un buffer reidratazione. Per il metodo electroformation, il film si deposita sugli elettrodi di platino in modo che un campo AC può essere applicato durante pellicola reidratazione. Al contrario, il metodo gonfiore gel assistita utilizza un substrato gel di agarosio per migliorare pellicola reidratazione. Entrambi i metodi possono produrre GUVs in (ad esempio, 100 mm) concentrazioni basse (ad esempio, 5 mm) e fisiologici di sale. I GUVs risultanti sono caratterizzati tramite microscopia a fluorescenza, e la funzione di canali ricostituiti misurate utilizzando la configurazione patch-clamp dentro-fuori. Mentre rigonfiamento in presenza di un campo elettrico alternato (electroformation) fornisce un alto rendimento di GUVs esenti da difetti, il metodo gonfiore gel assistita produce una distribuzione più omogenea della proteina e non richiede attrezzature speciali.

La crescita di GUVs può essere rapidamente valutata esaminando la camera di crescita al microscopio. Per electroformation, i GUVs tendono a crescere in grappoli lungo i fili di platino, come mostrato in Figura 4. Durante gonfiore gel assistita, GUVs appaiono come strutture sferiche che crescono rapidamente e si fondono insieme (Figura 5). GUVs senza difetti sono più facilmente individuati e valutati dopo il trasferimento ad una camera di osservazione. Misura...

La ricostituzione della proteina transmembrana, KvAP, in giganti vescicole unilamellari (GUVs) è dimostrato per due metodi di disidratazione, reidratazione - electroformation, e gonfiore gel assistita. In entrambi i metodi, piccole vescicole unilamellari contenenti la proteina sono fusi insieme per formare GUVs che possono poi essere studiate mediante microscopia a fluorescenza e patch-clamp elettrofisiologia.

Ricostituzione di una proteina transmembrana, la tensione gated canali ionici, KvAP, in Giant unilamellari vescicole per la microscopia e Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è incorporare canali ionici attivati da voltaggio in vescicole unilamellari giganti e caratterizzarne l'attività mediante misurazioni con tecnica del patch clamp. Questo viene ottenuto innanzitutto disidratando parzialmente una soluzione di vescicole piccole contenenti il canale ionico KVAP, al fine di creare un film lipidico-proteico. Successivamente, il film lipidico viene reidratato, inducendo la formazione e la crescita di vescicole giganti di dimensioni cellulari, dette gvs, contenenti il canale.Successivamente, i GVS vengono trasferiti nella nostra camera di registrazione e un frammento di membrana di GUV viene escisso con una pipetta per il patch per misurare le correnti ioniche. I risultati mostrano che i canali ionici nella membrana del GUV si attivano in risposta a variazioni del potenziale di membrana, in base all'analisi delle registrazioni di corrente. I giganti fisici unilaterali possono contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biofisica relative alle interazioni tra proteine di membrana.Ad esempio, l'interazione tra proteine transmembrana e le proprietà fisiche del doppio strato lipidico. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla funzione del canale del ferro sensibile al voltaggio KVAP, può essere applicato anche ad altri canali del ferro, trasportatori, pompe e proteine transmembrana in generale. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, proprio come lo sono i passaggi che coinvolgono la manipolazione di vescicole giganti.Come prelevare solo gli articoli di lettura Dopo aver preparato le soluzioni e le vescicole piccole contenenti KVAP. Secondo il protocollo descritto nel testo, preparare la camera di elettroformazione inserendo prima i fili attraverso i fori e ruotandoli e pulendoli per assicurarsi che siano puliti, quindi sottoporli a essiccazione sotto un flusso di azoto o aria. Preparare 30 microlitri di sospensione di SUV a 3 milligrammi per millilitro nel buffer SUV come descritto nel protocollo del testo, mescolare vigorosamente la soluzione per depositare la sospensione di SUV.Utilizzare una pipetta da due microlitri o una siringa di vetro da cinque microlitri per depositare piccole gocce della soluzione di SUV sui fili. Assicurarsi che le gocce siano sufficientemente piccole e distanziate in modo che non si tocchino né si fondano. Lasciare asciugare gli SUV depositati per circa 30 minuti all'aria aperta.Una volta che le gocce si sono depositate, ruotare il filo in modo che i depositi lipidici possano essere osservati più facilmente al microscopio. Successivamente, utilizzare una siringa per applicare grasso da vuoto sulla parte inferiore della camera intorno ai tre pozzetti e premere delicatamente un coprioggetto di 40 millimetri per 22 millimetri contro di essa per sigillare il fondo della camera, in modo che aderisca senza lasciare spazi. Quindi, utilizzare pasta per soffitto per sigillare i lati della camera e applicare grasso da vuoto sulla parte superiore della camera, delineando i tre pozzetti.Aggiungere lentamente il buffer di crescita fino a quando ogni pozzetto non sarà completamente riempito. Evitare qualsiasi movimento rapido della soluzione nei pozzetti, poiché ciò può. Rimuovere il film lipidico dagli elettrodi.Chiudere la camera premendo delicatamente il coperchio superiore sulla vaselina, facendo attenzione a non spostare il vetrino inferiore. Utilizzare due morsetti a coccodrillo per collegare il generatore di segnale ai fili.Impostare la frequenza in base alla concentrazione salina del buffer utilizzato e, con un multimetro, misurare e regolare la tensione tra i fili. In base al buffer, utilizzare della carta d'alluminio per coprire la camera e proteggere la flora fours dalla luce. Lasciare crescere i G UUVs per due o tre ore nel buffer a bassa concentrazione salina e per 12 ore o tutta la notte nel buffer ad alta concentrazione salina.Dopo l'incubazione, scollegare la camera dal generatore e posizionarla con attenzione su un microscopio invertito. Per valutare la crescita delle GUV nel plasma, pulire un'ampolla coprioggetto per un minuto in modo che la soluzione ARO si distribuisca uniformemente su di essa. Entro 15 minuti dalla pulizia del coprioggetto, applicare 200 microlitri di soluzione ARO calda preparata secondo il protocollo descritto nel testo, in modo che bagni l'intera superficie.Inclinare verticalmente il vetrino e toccare il bordo inferiore con un fazzoletto di carta per rimuovere il liquido in eccesso, lasciando uno strato sottile e uniforme di aros sul vetrino. Posizionare il vetrino su una piastra riscaldante o in un forno a 60 gradi Celsius e lasciarlo asciugare per almeno 30 minuti. Successivamente, posizionare un cover slip rivestito con AROS in una normale piastra di Petri da 3,5 centimetri.Successivamente, dopo aver preparato la soluzione di SUV, applicare delicatamente circa 15 microlitri in circa 30 gocce molto piccole sulla superficie di aros. Prestare attenzione a non alterare eccessivamente lo strato di aros. Posizionare il vetrino sotto un flusso delicato di azoto per circa 10-15 minuti e seguire l'evaporazione del tampone ad occhio.Poiché le gocce si seccano non appena gli SUV si sono asciugati, aggiungere circa un millilitro di buffer di crescita per coprire la superficie del vetrino. Lasciare procedere il rigonfiamento per circa 30 minuti, quindi utilizzare un microscopio invertito con contrasto di fase o DIC per esaminare la crescita delle GU UUV nel compartimento di crescita. Sigillare le GU UUV nella camera aggiungendo una soluzione di beta-caina a cinque milligrammi per millilitro, che impedisce alle GU di aderire, espandersi e rompersi. Incubare per cinque minuti, risciacquare, inserire l'elettrodo di terra e utilizzare il buffer di osservazione per riempire la camera.Successivamente, trasferire i G UUV nel compartimento di osservazione per i GU UUV elettroformati. Aprire il compartimento di crescita rimuovendo delicatamente il coprivetro superiore. Posizionare la punta della pipetta direttamente sopra ogni filo e, per staccare lentamente i GU UUV, aspirare circa 10 microlitri muovendo contemporaneamente la punta della pipetta lungo il filo per i GU UUV con gonfiamento assistito dal gel.Battere prima leggermente il lato della piastra di Petri alcune volte per staccare i GU UUVs dalla superficie del vetrino. Posizionare la punta della pipetta appena sopra il vetrino ed aspirare 10 microlitri, ritirando contemporaneamente la punta sulla superficie, quindi trasferire direttamente i GVS raccolti nella camera di osservazione. Attendere alcuni minuti affinché i Gus si depositino sul fondo, prima di effettuare il patch clamp sui GVS.Utilizzare il buffer di osservazione per riempire una pipetta per il patch-clamp fresca e montarla sul supporto del patch-clamp. Esplorare la camera per individuare una GUV priva di difetti e verificare che contenga la proteina fluorescente. Applicare una pressione positiva costante superiore a 100 pascal per mantenere pulito l'interno della pipetta e inserire la pipetta nella camera.Portare la pipetta per il patch nel campo visivo ed applicare impulsi di prova per misurare o compensare l'offset di tensione e la resistenza della pipetta. Successivamente, esaminare la pipetta sotto illuminazione fluorescente per verificare che la punta sia pulita. Avvicinare la pipetta per il patch al GUV e, se necessario, ridurre contemporaneamente la pressione positiva in modo che il flusso uscente dalla pipetta non spinga via il GUV.Quando la pipetta per il patch è vicina alla GUV, applicare una pressione negativa per tirare la GUV contro la pipetta per il patch. Monitorare la resistenza mentre la porzione a lingua della membrana della GUV entra nella pipetta per il patch e si forma il sigillo giga. Una volta che la membrana in configurazione inside-out è stata escissa dalla GUV e il sigillo giga è stabile, spegnere gli impulsi di prova e applicare un protocollo di voltaggio come descritto nel testo.Questa figura mostra immagini DIC e a fluorescenza epifluorescenza di un GUV privo di difetti. La fluorescenza proteica uniforme nella membrana del GUV conferma che KVAP è stato incorporato nel GUV anziché rimanere nel film lipidico, e non ha formato aggregati. Qui si osservano i GUV prodotti utilizzando i tre metodi. I segnali fluorescenti dei lipidi e delle proteine sono stati scalati alla stessa densità media in modo che i GUV con densità proteica bassa o alta presentino una tonalità magenta o verde nelle immagini sovrapposte, mentre i GUV con densità proteica media appaiono bianchi.Sono stati identificati GUV isolati privi di difetti e qui viene mostrata la distribuzione dimensionale dei GUV. Tipicamente, l'elettroformazione produce un numero maggiore di GUV privi di difetti rispetto al rigonfiamento assistito da gel, ma i GUV ottenuti mediante elettroformazione sono più piccoli. Qui viene mostrata la distribuzione della densità proteica dedotta dalla fluorescenza dei GUV.La formazione elettrochimica con tampone ad alta concentrazione salina produce UUV-GU con densità proteiche variabili. La variazione è molto minore nella formazione elettrochimica con tampone a bassa concentrazione salina e la densità proteica degli UUV-GU ottenuti mediante rigonfiamento assistito da gel è notevolmente uniforme, a seconda della concentrazione proteica nella membrana escissa. I tracciati della corrente mostrano o canali singoli o un insieme di canali.KVAP mostra un'apertura dipendente dalla tensione. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che le vescicole giganti sono oggetti fragili, non resistenti agli sforzi di taglio e allo stress osmotico. Dopo aver seguito questa procedura, possono essere eseguiti metodi come il trascinamento di nanotubi lipidici per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio sul riconoscimento della curvatura da parte delle proteine.Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come produrre GVS contenenti proteine funzionalmente reintrodotte.

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