Ricostituzione di una proteina transmembrana, la tensione gated canali ionici, KvAP, in Giant unilamellari vescicole per la microscopia e Patch Clamp Studies

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di incorporare canali ionici voltaggio-dipendenti in vescicole uni-lamellari giganti e caratterizzare la loro attività con misure di patch clamp. Ciò si ottiene disidratando parzialmente una soluzione di piccole vescicole contenenti il canale ionico KVAP per creare un film proteico lipidico. Successivamente, il film lipidico viene reidratato, il che provoca la formazione e la crescita di vescicole ALR giganti delle dimensioni cellulari o gvs contenenti il canale.

Quindi i gvs vengono trasferiti nella nostra camera di registrazione e un pezzo di membrana GUV viene asportato con una pipetta patch per misurare le correnti ioniche. I risultati mostrano che i canali ionici nella membrana GUV si attivano in risposta alle variazioni di tensione della membrana in base all'analisi delle registrazioni di corrente. La fisica unilaterale gigante può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biofisica relative alle interazioni tra proteine di membrana.

Ad esempio, l'interazione delle proteine transmembrana con le proprietà fisiche della membrana lipidica. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla funzione del canale di ferro KVAP, può essere applicato anche ad altri canali di ferro, trasportatori e pompe e proteine transmembrana in generale. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, così come lo sono le fasi che coinvolgono la manipolazione delle vescicole giganti.

Come iniziare a leggere gli articoli Dopo aver preparato soluzioni e piccole vescicole unali contenenti KVAP. Secondo il protocollo di testo, preparare la camera di elettroformazione inserendo prima i fili attraverso i fori e ruotando e pulendo i fili per assicurarsi che siano puliti, solari e asciugati sotto un flusso di azoto o aria. Preparare 30 microlitri di sospensioni SUV da tre milligrammi per millilitro nel tampone SUV come descritto nel protocollo di testo, mescolare energicamente la soluzione per depositare la soluzione SUV.

Utilizzare una pipetta da due microlitri o una siringa di vetro da cinque microlitri per posizionare piccole goccioline della soluzione SUV sui fili. Assicurati che le gocce siano abbastanza piccole e distanziate abbastanza da non toccarsi o fondersi. Lasciare asciugare i SUV depositati per circa 30 minuti all'aria aperta.

Quando le goccioline si sono depositate, ruotare il filo in modo che i depositi lipidici siano più facili da osservare con il microscopio. Quindi, utilizzare una siringa per applicare il grasso sottovuoto sul fondo della camera attorno ai tre pozzetti e premere delicatamente un vetrino coprioggetti da 40 millimetri per 22 millimetri contro di esso per sigillare il fondo della camera in modo che aderisca senza spazi vuoti. Quindi utilizzare la pasta per soffitti per sigillare i lati della camera e applicare il grasso sottovuoto sulla parte superiore della camera delineando i tre pozzetti.

Aggiungere lentamente il tampone di crescita fino a riempire ogni pozzetto fino in cima. Evitare qualsiasi movimento rapido della soluzione nei pozzetti in quanto ciò può essere fatto. Spelare il film lipidico dagli elettrodi.

Chiudere la camera premendo delicatamente il cursore del coperchio superiore sul grasso. Fare attenzione a non rimuovere il vetrino coprioggetto inferiore. Utilizzare due clip a coccodrillo per collegare il generatore di segnale ai cavi.

Impostare la frequenza in base alla concentrazione di sale del tampone utilizzato e con un multimetro misurare e regolare la tensione attraverso i fili. Sempre in base al tuo tampone, usa un foglio di alluminio per coprire la camera per proteggere i quattro della flora dalla luce. Lasciare crescere gli UUV G per due o tre ore nel tampone a basso contenuto di sale e 12 ore o durante la notte per il tampone ad alto contenuto di sale.

Dopo l'incubazione, scollegare la camera dal generatore e posizionarla con cura su un microscopio invertito. Per valutare il plasma di crescita GUV, pulire un vetrino di copertura per un minuto in modo che la soluzione ARO si diffonda bene su di esso. Entro 15 minuti dalla pulizia del vetrino di copertura, applicare 200 microlitri di soluzione aro calda preparata secondo il protocollo di testo in modo che bagni l'intera superficie.

Inclinare il vetrino verticalmente e toccare il bordo inferiore di un fazzoletto per rimuovere il liquido in eccesso, lasciando uno strato sottile e liscio di aros sul vetrino. Posizionare il vetrino su una piastra calda o su un forno a 60 gradi Celsius e lasciarlo asciugare per almeno 30 minuti. Successivamente, posiziona un vetrino coprioggetti rivestito AROS in una capsula di Petri standard da 3,5 centimetri.

Quindi, dopo aver preparato la soluzione SUV, applicare delicatamente circa 15 microlitri in circa 30 piccolissime gocce sulla superficie dell'aros. Fare attenzione a non distorcere troppo lo strato di aros. Posizionare il vetrino sotto un leggero getto di azoto per circa 10-15 minuti e seguire l'evaporazione del tampone a occhio.

Poiché le goccioline si asciugano non appena i SUV si sono asciugati, aggiungere circa un millilitro di tampone di crescita per coprire la superficie del vetrino. Lasciare procedere il gonfiore per circa 30 minuti, quindi utilizzare un microscopio invertito con contrasto di fase o DIC Per esaminare la crescita degli UUV GU nella camera di crescita per bloccare i patch gu UUV hanno mangiato la camera aggiungendo una soluzione di beta Caine da cinque milligrammi per millilitro, che impedisce al Gus di aderire, diffondendosi e rompendosi. Incubare per cinque minuti e risciacquare, inserire l'elettrodo di terra e utilizzare il tampone di osservazione per riempire la camera.

Successivamente, trasferire i G UUV nella camera di osservazione per i GU UUV elettroformati. Aprire la camera di crescita rimuovendo delicatamente il vetrino copritore superiore. Posizionare la punta della pipetta direttamente sopra ciascun filo e per staccare le GU UUV aspirare lentamente circa 10 microlitri mentre si sposta la punta della pipetta lungo il filo per il rigonfiamento assistito da gel GU UUV.

Per prima cosa picchiettare alcune volte il lato della capsula di Petri per staccare gli UUV GU dalla superficie del vetrino coprioggetti. Posizionare la punta della pipetta appena sopra il vetrino coprioggetto e aspirare 10 microlitri mentre si tira indietro la punta sulla superficie, trasferire direttamente il GVS raccolto nella camera di osservazione. Attendi qualche minuto che il Gus si depositi sul fondo per fissare il morsetto del GVS.

Utilizzare il tampone di osservazione per riempire una nuova pipetta per cerotti e montarla sul tavolino della testa del morsetto per patch. Cerca nella camera per individuare un GUV privo di difetti e verifica che contenga una proteina fluorescente. Applicare una pressione positiva costante di oltre 100 pascal per mantenere pulito l'interno della pipetta per cerotti e inserire la pipetta per cerotti nella camera.

Portare la pipetta patch nel campo visivo e applicare impulsi di prova per misurare o compensare l'offset di tensione e la resistenza della pipetta. Quindi esaminare la pipetta sotto illuminazione fluorescente per verificare che il puntale sia pulito. Portare la pipetta a cerotto verso il GUV e, se necessario, ridurre contemporaneamente la pressione positiva in modo che il flusso verso l'esterno della pipetta a cerotti non faccia scappare il GUV.

Quando la pipetta per cerotti è vicina al GUV, applicare una pressione negativa per tirare il GUV contro la pipetta per patch. Monitora la resistenza quando la linguetta della membrana GUV entra nella pipetta patch e si forma la giga seal. Quando il cerotto della membrana dall'interno verso l'esterno è stato asportato dal GUV e la tenuta giga è stabile, spegnere gli impulsi di prova e applicare un protocollo di tensione come descritto nel testo.

Questa figura mostra le immagini DIC ed epifluorescenza di un GUV privo di difetti. La fluorescenza uniforme delle proteine nella membrana GUV conferma che KVAP è incorporato nel GUV piuttosto che rimanere nel film lipidico e non ha formato aggregati che Gus prodotti utilizzando i tre metodi sono visti qui. I segnali lipidici e proteici fluorescenti sono stati scalati alla stessa densità media in modo che gli UUV g con una densità proteica bassa o alta abbiano una tonalità magenta o verde nelle immagini di sovrapposizione, mentre i GV con una densità proteica media siano bianchi.

Sono stati identificati UUV G isolati privi di difetti e la distribuzione dimensionale dei GUV è mostrata qui. Tipicamente, l'elettroformazione produce più UUV G privi di difetti rispetto al rigonfiamento assistito da gel, ma i GUS prodotti dall'elettroformazione sono più piccoli. Qui è mostrata la distribuzione della densità proteica dedotta dalla fluorescenza GUV.

L'elettroformazione con tampone ad alto contenuto salino produce UUV GU con densità proteiche variabili. La densità varia molto meno per l'elettroformazione con basso tampone salino e la densità proteica degli UUV GU prodotti dal rigonfiamento assistito da gel è notevolmente uniforme a seconda della concentrazione proteica nel cerotto asportato. Le tracce correnti mostrano singoli canali o un insieme di canali.

KVAP mostra l'apertura dipendente dalla tensione. Mentre si tenta questa procedura, è importante ricordare le vescicole giganti di oggetti fragili non resistenti allo stress puro e osmotico. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire metodi come l'estrazione di nanotubi lipidici per rispondere a domande aggiuntive come il rilevamento della curvatura delle proteine.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come produrre GVS contenenti proteine funzionalmente ricostituite.