Un Ex vivo Modello per studiare Hormone azione in seno umano

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un modello ex vivo del seno umano che mantenga l'architettura dei tessuti, le interazioni intercellulari e la reattività ormonale per studiare l'azione ormonale. Il modello si basa su microstrutture di tessuto umano che vengono preparate sezionando prima il parenchima mammario, che consiste in dotti e lobuli dallo stroma mammario grasso. Oltre agli adipociti, lo stroma contiene fibroblasti, cellule immunitarie e cellule endoteliali.

Una volta che il tessuto parenchimale è stato liberato dal grasso, viene dissociato meccanicamente in pezzi delle dimensioni di una capocchia di spillo utilizzando bisturi opposti. Successivamente, la massa tissutale viene sottoposta a digestione enzimatica con stimolazione dell'ormone collagenasi che può essere associata a questo passaggio se lo si desidera. Le microstrutture tissutali vengono quindi recuperate mediante centrifugazione, seguita dalla rimozione della frazione arricchita di fibroblasti e dei globuli rossi rimanenti nel tessuto adiposo.

Dopo una procedura di recupero, la sospensione del restante tessuto mammario digerito viene arricchita per le microstrutture tissutali contenenti cellule luminali e mioepiteliali con la lamina basale circostante, le cellule endoteliali dei fibroblasti e le cellule immunitarie. In definitiva, la coltura ex vivo viene utilizzata per valutare la morfologia della microstruttura. La selezione cellulare attivata dalla fluorescenza viene utilizzata per separare le sottopopolazioni di cellule mammarie e l'analisi proteica e trascrittomica viene utilizzata per gli studi di risposta ormonale.

Gli ormoni controllano lo sviluppo del seno e sono importanti nella tumorgenesi del seno. La segnalazione ormonale è stata studiata principalmente nel cancro al seno, nelle linee cellulari in coltura tissutale, nelle malattie plastiche. Tuttavia, quando le cellule epiteliali mammarie primarie vengono coltivate in vitro, perdono l'espressione del recettore ormonale.

Ora, le microstrutture tissutali che otteniamo dal materiale di scarto chirurgico rimangono sensibili agli ormoni e i campioni dei pazienti si riflettono nella diversità individuale. La dimostrazione visiva di questo metodo è importante per le fasi di digestione dei tessuti e per l'ottenimento di microstrutture da eterogenee. La ghiandola mammaria umana è complessa.

La concentrazione di collagene e il tempo di digestione sono fondamentali per evitare una digestione parziale o eccessiva. Questo modello ex vivo può aiutarci a capire come gli ormoni riproduttivi agiscono sulla mammella umana e con quali meccanismi ostacolano lo sviluppo e la progressione del cancro. Per iniziare, trasferire le bottiglie contenenti i campioni di tessuto in una cappa a flusso laminare in una cella P due chiamata stanza, lavorando su un tagliere sterile.

Tenere il materiale con una pinza e raschiare il grasso rimanente e i vasi dal parenchima mammario con un bisturi. Mettere il materiale bianco in soluzione salina tamponata con fosfato o PBS in una piastra di coltura cellulare di 10 centimetri. Dopo aver rimosso il tessuto adiposo da tutti i pezzi e averli smaltiti secondo le norme di sicurezza del laboratorio, riposizionare le parti bianche contenenti i tessuti epiteliali sul tagliere utilizzando bisturi opposti, tagliare il fazzoletto e tagliarlo in pezzi di diametro inferiore ai due millimetri

Mettere il materiale macinato in tubi di dimensioni adeguate per la paraffina, l'incorporazione e la stimolazione ormonale. Utilizzare un millilitro di materiale in un tubo da cinque millilitri. Quando si esegue la selezione delle cellule attivate dalla fluorescenza, utilizzare 2,5 millilitri di materiale in una provetta da 15 millilitri.

Se si congelano le aliquote, utilizzare 10 millilitri di materiale tritato in un tubo da 50 millilitri. Quindi aggiungere la digestione. Master mix contenente collagenasi A in volume, fino a quattro volte la quantità di materiale digerito per garantire un'adeguata agitazione e aerazione.

Successivamente, aggiungere ormoni alla concentrazione desiderata per la stimolazione con 17 beta estradiolo e calcoli progestinici. Utilizzare una concentrazione finale di 20 nanomolari. Aggiungere il veicolo solo al controllo, agitare o mescolare molto bene i campioni per garantire che tutto il materiale si distribuisca lungo le provette della centrifuga.

Quindi posizionare i tubi sul miscelatore a rulli all'interno di un'incubatrice a 37 gradi Celsius e 40 giri/min durante la notte. Lasciare che la digestione avvenga per almeno 12 ore per recuperare il tessuto. Le microstrutture centrifugano prima le provette a 400 Gs per cinque minuti.

Dopo aver aspirato il grasso dalla parte superiore della provetta da centrifuga, trasferire il surnatante acquoso rimanente, arricchito in fibroblasti, in una nuova provetta da centrifuga. Quindi centrifugare il surnatante acquoso a 1.250 g per cinque minuti. Poiché le microstrutture del tessuto mammario sono molto appiccicose per tutti i successivi, ad eccezione del reus, si sconsiglia di utilizzare il pellet mediante pipettaggio con leggera agitazione a causa del rischio di perdita di materiale.

Successivamente, resus sospendere i pellet arricchiti in microstrutture in PBS 2%FCS e risospendere anche i pellet arricchiti in fibroblasti derivati dal surnatante acquoso in PBS 2%FCS dopo la centrifugazione di entrambe le provette. Come in precedenza, scartare il surnatante e risus, sospendere i pellet in tre o cinque millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi e incubarli per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi aggiungere PBS 2%FCS due volte il volume di lisi dei globuli rossi, tampone e centrifugare dopo la centrifugazione.

Per preparare i campioni per la citometria a flusso, aggiungere uno o due millilitri di tripsina allo 0,25% di tripsina al pellet e mescolarlo pipettando su e giù molto delicatamente con una pipetta da 1000 microlitri per due minuti per dissociare le cellule dopo aver inibito l'attività della tripsina con l'aggiunta di nove millilitri di centrifuga PBS 2%FCS a 450 g per cinque minuti. Resus sospendere il pellet in 10 millilitri di PBS 2%FCS e trasferire la sospensione cellulare su un colino cellulare da 40 micron posizionato sopra una provetta da centrifuga da 50 millilitri per preparare singole cellule Dopo la centrifugazione, separare le cellule immunitarie, i fibroblasti e le cellule endoteliali dalle microstrutture con un cocktail di anticorpi prima di selezionarli con i fatti per preparare le cellule per l'istologia. Lavare e digerire i campioni come prima, quindi fissare il pellet in un millilitro di aldeide paraforma al 4% in PBS a temperatura ambiente per 30 minuti.

Centrifugare a 1,250 GS per cinque minuti e lavare con uno o due millilitri di PBS due volte dopo aver lavato la centrifuga a 16,000 GS per 10 minuti. Durante questo periodo, preparare l'1% di aros multiuso in tampone EDTA di tris acetato e riscaldare la soluzione nel forno a microonde fino a quando la soluzione non raggiunge il bollore. Togliere la soluzione dal forno a microonde e agitare delicatamente per mescolare la soluzione e sospendere nuovamente le particelle di aros rimanenti.

Raffreddare la soluzione di aro a 50 gradi Celsius prima di versare un millilitro in uno stampo a base di paraffina. Quindi, scartare il surnatante e posizionare i pellet sopra lo strato solidificato di aros con un'estremità piatta del cucchiaio a spatola. Coprite il tutto con un ulteriore strato di agro insieme ai campioni di aro.

Metti un pezzo di carta bianca da ufficio nella cassetta con le informazioni sul numero di riduzione, le condizioni sperimentali e la data scritte a matita per resistere a tutte le fasi successive del trattamento. Dopo che l'agarro si è solidificato, mettere i blocchi aros nelle cassette istologiche per l'inclusione della paraffina. Mettere le cassette in PBS per una notte o in etanolo al 70% per la conservazione durante il fine settimana a quattro gradi Celsius prima di trasferire le cassette istologiche alle strutture istologiche per l'inclusione di paraffina per preparare i campioni per il congelamento, sospendere le microstrutture in mezzo di congelamento costituito da FCS con il 10% di ossido di dimetilsolfo e congelare un millilitro di aliquote.

Nelle fiale criogeniche, il numero di fiale criogeniche dipende dalla quantità di materiale primario ottenuto dalla riduzione. Tessuto per mastoplastica da riduzione fresca. La mammoplastica è dissociata meccanicamente ed enzimaticamente.

Le microstrutture tissutali risultanti hanno dotti e lobuli caratteristici del tessuto mammario di origine. L'analisi immunoistochimica delle microstrutture tissutali incluse in aros e paraffina colorate per il marcatore mioepiteliale delta NP 63 rivela che le microstrutture mantengono non solo le caratteristiche morfologiche del tessuto mammario normale, ma anche il profilo molecolare delle popolazioni cellulari per valutare la risposta ormonale al tessuto. Le microstrutture sono state trattate con un agonista sintetico del recettore del progesterone, un calcolo promega o un controllo dell'etanolo per arricchire le cellule luminali positive al recettore ormonale.

citometria a flusso è stata eseguita sulla base di marcatori epiteliali e mioepiteliali dopo la deplezione per i fibroblasti endoteliali e le cellule immunitarie con un cocktail di anticorpi anti CD 31, anti FAP e anti CD 45. L'analisi Q-R-T-P-C-R delle cellule EPAM positive CD 10 negative ha mostrato una sovraregolazione del gene bersaglio del progesterone vento quattro nella popolazione arricchita di cellule luminali dalle microstrutture tissutali esposte al calcolo Promega Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni se eseguita correttamente. È importante sottolineare che la concentrazione di collagene, la digestione, la temperatura, la durata e la velocità di rotazione durante la digestione dei tessuti sono tutti dettagli significativi specificati nel protocollo.

Questo metodo può essere esteso a studi farmacologici, in particolare, una migliore caratterizzazione dei modulatori selettivi del recettore degli estrogeni o progestinici. In effetti, i progestinici sono ampiamente utilizzati nel contesto della contraccezione ormonale. Tuttavia, si sa poco sulla sua azione sul seno umano Dopo il suo sviluppo.

Questo modello di microstruttura tissutale x vivo ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dello sviluppo del seno e della cancerogenesi per esplorare il contributo e l'azione ormonale nel seno umano.