Name: Un Ex vivo Modello per studiare Hormone azione in seno umano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Scopri un modello ex vivo per studiare l'azione ormonale nel seno umano utilizzando microstrutture tissutali. Questo metodo preserva l'architettura cellulare e le interazioni intercellulari per ricerche accurate.

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Gli autori ringraziano M. Fiche di Ospedale universitario di Losanna per fornire la fotografia mastoplastica, M. Wirth e A. Ayyanan dell&#39;Istituto svizzero per la ricerca sperimentale sul cancro, Centro Nazionale di Competenza nella Ricerca Oncologia Molecolare, Facoltà di Scienze della Vita, Ecole Polytechnique Fédérale de Losanna per l&#39;assistenza tecnica e R. Clarke dell&#39;Università di Manchester per i commenti critici. La ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto il sostegno di SNF3100A0-112090, Oncosuisse 531.817, e l&#39;iniziativa sui medicinali innovativi impresa comune nell&#39;ambito dell&#39;accordo di concessione n. 115.188, le risorse di cui si compone del contributo finanziario dal Settimo Programma Quadro dell&#39;Unione Europea (FP7 / 2007-2013) e la Federazione europea delle industrie e associazioni farmaceutiche aziende in contributi in natura. L&#39;indirizzo web di medicinali innovativi è <a href="http://www.imi.europa.eu/" target="_blank">http://www.imi.europa.eu/</a> . &lt;/ P&gt;

Considerazioni generali: prima del tempo, istituire un protocollo etico, preparano questionari per i pazienti, e vedere per la formazione del personale clinico. Prima di usare il materiale dalla chirurgia mastoplastica riduttiva, procurarsi le autorizzazioni, e garantire il consenso del paziente. Tissue può essere contagioso e deve essere gestito di conseguenza. Questo protocollo è stato approvato dal comitato etico di ISREC - Istituto svizzero di ricerca sperimentale sul cancro. 1. Tissue Recupero, lavorazione e Bio-banking Per garantire la qualità del campione ottimale per la bio-banking, una serie di misure vengono effettuate in ospedale prima del trasporto al laboratorio. All&#39;ospedale: <ol><li> Ottenere tessuti mammari umani in condizioni sterili da campioni di chirurgia mastoplastica riduttiva e sangue, se necessario. Tissue ha bisogno di essere esaminato da patologo che campione per escludere la presenza di lesioni maligne. </li><li> Posizionare la t senorilasciare sotto il cofano su una tavola sterili e preparare forbici, bisturi chirurgici e pinze che sono già sterilizzati con sterilizzatore a vapore. Fai taglio profondo in diversi siti del tessuto mammario con un bisturi per aprirlo. Nel tessuto mammario umano cercare filamenti bianchi, comprensivi di condotti e lobuli, che sono incorporati nel tessuto adiposo giallo. NOTA: Il rapporto tra il parenchimale bianco al tessuto adiposo giallo differisce tra le donne; in genere le donne più giovani hanno più tessuto epiteliale. </li><li> Scegli pezzi di materiale bianco e tenerli con una pinza, poi separarli delicatamente dal tessuto adiposo con le forbici. Evitare di prendere i vasi sanguigni. </li><li> Sciacquare pezzi di tessuto in PBS (PBS) pH 7,2 per rimuovere il sangue. Trasferire il tessuto di bottiglie di plastica da 250 ml contenenti mezzo F12 (Medium F12 Modified Eagle di Dulbecco) senza rosso con 2% di penicillina / streptomicina fenolo (comprese 5.000 unità / ml di penicillina e 5.000 g / ml di streptomicina) e l&#39;1% di unantibiotica / amfotericina B (comprese le 10.000 unità / ml di penicillina, 10.000 mg / ml di streptomicina, e 25 mg / ml di amfotericina B). Negozio tessuti nel mezzo per il trasporto al laboratorio. </li><li> Preparare pezzi di 3 - 5 mm di diametro per l&#39;estrazione di RNA e proteine ​​e flash congelarli in cryovials con il freddo (ghiaccio secco) isopentano. Trasferirli contenitore di ghiaccio secco per il trasporto al laboratorio. </li><li> Mettete i pezzi di 3-5 mm nel stampo e coprire con uno strato di Optimal taglio temperatura (OCT) e quindi inserire la muffa sul fondo piatto della scatola piena di isopentano freddo. Dopo aver completato il trasferimento di congelamento dello stampo alla casella ghiaccio secco. </li><li> Fissare 5 pezzi di 3 - 5 mm di diametro in paraformaldeide (PFA) 4% e altri 5 pezzi in formaldeide (FA) 4% in PBS a RT analisi istologica seguito. Due diversi fissativi sono raccomandati in alcuni anticorpi funzionano meglio con uno o l&#39;altro dei due. </li></ol> In laboratorio: <ol start="8"><li> Farecumento tutte le informazioni sulla mastoplastica riduttiva, data di chirurgia e se i campioni sono derivati ​​da sinistra contro mammella destra. </li><li> Posizionare i campioni congelati a -80 ° C e trasferire i tessuti fissi in cassette istologici dopo 2 ore di fissazione. Poi metterli sia in PBS o etanolo al 70%, per O / storage N a 4 ° C. Il giorno successivo, il trasferimento le cassette istologici alle strutture istologici per paraffina. </li></ol> 2. Tissue Digestione e stimolazione ormonale <ol><li> Trasferire le bottiglie contenenti i campioni di tessuto a un armadio flusso laminare in una camera di coltura cellulare P2. Mettere i pezzi di tessuto sul tagliere sterile (29 x 19 cm). Tenere il materiale con una pinza e raschiare il grasso e vasi rimanendo lontano dal parenchima mammario (parte bianca) con il bisturi. Posizionare il materiale bianco in PBS in un piatto di cultura 10 cm. </li><li> Dopo aver rimosso il materiale grasso da tutti i pezzi e disporli secondo la regola di sicurezzas del laboratorio, posizionare le parti bianche contenenti i tessuti epiteliali di nuovo sul tagliere. Utilizzando bisturi opposte tagliare il tessuto e tagliarla a pezzi di diametro fino a 2 mm. </li><li> Il materiale macinato in provette di dimensioni adeguate: fino a 1, 2,5 e 10 ml in un 5, 15 o 50 ml tubi, rispettivamente. Tipicamente a 5 ml rendimenti tubo di materiale sufficiente per paraffina embedment e ormonali stimoli, e 15 ml produce tubo di materiale sufficiente per fluorescenza cellulare Attivato (FACS). Tubi più grandi sono utilizzati per il congelamento aliquote. </li><li> Preparare master mix digestione composto di media (DMEM / F12 senza rosso fenolo) con 1% di penicillina / streptomicina / amfotericina B e collagenasi A (Clostridiopeptidase A da Clostridium histolyticum). Dose collagenasi secondo i tempi di digestione. <ol><li> Per 12, 24, e 36 h di incubazione, utilizzare concentrazione finale di collagenasi di 1,5 mg / ml, 1,0 mg / ml e 0,5 mg / ml. Aggiungere mix digestione padrone fino a 4 volte ilvolume del materiale digerito per garantire un&#39;adeguata agitazione e aerazione. NOTA: A seconda del disegno sperimentale e la durata della stimolazione ormonale, aggiungere ormoni durante o dopo la digestione enzimatica fase e microstruttura recupero. </li></ol></li><li> Aggiungere ormone (s) alla concentrazione desiderata per testare campioni ed il veicolo al controllo. Per la stimolazione con 17-β-estradiolo, e promegestone (R5020) utilizzare una concentrazione finale di 20 nM. NOTA: R5020 è un agonista del recettore del progesterone sintetica, che è più stabile del progesterone naturale in mezzo. <ol><li> Porre le provette del mixer rullo interno un incubatore a 37 ° C e 40 rpm O / N. Prima di mettere i campioni del mixer, li risospendere molto bene per garantire che tutto il materiale distribuisce lungo le provette. </li></ol></li><li> Come digestione richiede almeno 12 ore (O / N), per tempi di stimolazione ormonale inferiori a 12 ore, aggiungere gli ormoni dopo il recupero delle microstrutture (decoda sotto il punto 3). Aggiungere gli ormoni, come si sospendere nuovamente le microstrutture e posizionare la sospensione su piastre di fissaggio ultra-basse. Microstrutture tessuti possono essere conservati su piastre di fissaggio ultra-bassi per un massimo di 7 giorni in mezzo di crescita-libera-factor di conservazione di circa il 70% della redditività. </li><li> Per RNA e l&#39;analisi delle proteine, raccogliere microstrutture tessuti per centrifugazione a 400 xg per 5 minuti e flash freeze in provette. </li></ol> 3. Recupero di microstrutture del tessuto <ol><li> Centrifugare il tubo (s) a 400 xg per 5 min. Aspirare il grasso dalla parte superiore della provetta e trasferire il supernatante del surnatante acquoso rimanente, che si arricchisce in fibroblasti, in un provetta da centrifuga e centrifugare a 1250 xg per 5 min. NOTA: le microstrutture del tessuto del seno sono molto appiccicoso, per tutte le fasi successive risospendere il pellet agitando delicatamente il tubo. Pipettaggio non è raccomandato a causa del rischio di perdere materiale. </li&gt; <li> Risospendere il pellet arricchiti in microstrutture ed in fibroblasti derivati ​​da surnatante acquoso in PBS, 2% Fetal Calf Serum (FCS). Successivamente girare entrambi i tubi a 1.250 xg per 5 minuti e poi scarta il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet in 3 - 5 ml rosso tampone di lisi del sangue cellulare e trasferirli a pulire i tubi. Li Incubare per 5 minuti a RT. </li><li> Aggiungere 2x volume di PBS, 2% FCS e centrifugare a 1250 xg per 5 min. Lavare il pellet con PBS, 2% FCS e centrifugare a 1250 xg per 5 min. Ripetere questa operazione due volte. </li></ol> 4. I campioni di Citometria a Flusso <ol><li> Aggiungere 1 - 2 ml di tripsina 0,25% al ​​pellet e mescolare pipettando su e giù delicatamente per 2 minuti con una Pipetman 1.000 microlitri a dissociarsi cellule. </li><li> Inibire l&#39;attività tripsina aggiungendo 9 ml PBS, 2% FCS. Centrifugare a 450 xg per 5 min e risospendere il pellet in 10 ml di PBS, 2% FCS. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare su un filtro cella 40 micron posto su top di un tubo da centrifuga da 50 ml per preparare singole cellule. Se pochi microlitri di sospensione cellulare rimangono sulla sommità del filtro, aiutare passano attraverso il filtro da essi aspirando dall&#39;altro lato del filtro con una pipetta e aggiungere alle microstrutture filtrati. </li><li> Cellule immunitarie separati, fibroblasti e cellule endoteliali di microstrutture con un cocktail di anti-CD45, anti-FAP e anti-CD31 anticorpi e poi ordinare con FACS, sulla base di pan-epiteliale EpCAM marcatore CD10 e di separare le cellule luminali e basali, rispettivamente 10 . </li></ol> 5. I campioni di Istologia <ol><li> Dopo aver lavato il materiale meccanicamente enzimaticamente digerito come sopra descritto, fissare pellets da 1,5 ml materiale iniziale in 1 ml di 4% PFA in PBS a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Centrifugare a 1.250 xg per 5 minuti e lavare con 1-2 ml di PBS due volte. </li><li> Centrifugare a 16.000 xg per 10 min. Durante questo tempo, preparare 1% polivalente agarosio in Tris-acetato-EDTA (TAE) tampone e riscaldare la soluzione nel forno a microonde fino a quando la soluzione viene a ebollizione. <ol><li> Rimuovere la soluzione dal forno a microonde e agitare il matraccio delicatamente per miscelare la soluzione e risospendere le particelle rimanenti agarosio. Soluzione di agarosio Raffreddare a 50 ° C e versare 1 ml in uno stampo di base di paraffina dimensionato 31 × 23 × 13,5 millimetri. </li></ol></li><li> Eliminare il supernatante e posizionare i pellet sopra dello strato solidificato (1 - 3 mm) di agarosio utilizzando una spatola con un&#39;estremità piatta. Tutti Coprire con un ulteriore strato di agarosio (40 ° C). </li><li> Dopo le solidifica agarosio, di solito entro 5 minuti, mettere i blocchi agarosio nelle cassette per istologia paraffina incastro. Insieme con i campioni di agarosio posto un ufficio carta bianca nella cassetta con tutte le informazioni sul numero mastoplastica riduttiva, condizione sperimentale, e la data scritta in lettere minuscole a matita; questa scrittura resiste tutte le fasi di trattamento successive. </li><li> Mettere le cassette inPBS O / N, o in 70% di etanolo per immagazzinaggio durante il fine settimana, a 4 ° C. Non abbiamo notato alcuna differenza tra le due soluzioni di memorizzazione. Poi il trasferimento cassette istologici alle strutture istologici per paraffina. </li></ol> 6. microstrutture congelamento (Future) la coltura <ol><li> Risospendere microstrutture del tessuto a congelamento mezzo costituito da FCS con il 10% dimetilsolfossido (DMSO) e congelare 1 ml aliquote in cryovials. Il numero di cryovials ottenuti dipende dalla quantità di materiale primario ottenuto da mastoplastica riduttiva. </li><li> Bloccare le cryovials contenenti microstrutture tessuto utilizzando un tasso freezer controllata con il seguente programma: 5 min dimora a 4 ° C, diminuendo la temperatura a -7 ° C con velocità di 6 ° C / min, diminuendo la temperatura a -12 ° C con velocità di 6 ° C / min, 10 min dimora, diminuendo la temperatura a -40 ° C con velocità di 6 ° C / min, diminuzione della temperatura a -80 ° C convelocità di 6 ° C / min. Poi trasferire i cryovials a -80 ° C freezer. </li><li> Il giorno dopo, trasferire i cryovials da -80 ° C a serbatoio di azoto liquido per la conservazione a lungo. </li></ol>

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<li>Yalcin-Ozuysal, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+roles+of+Notch+and+p63+in+controlling+mammary+epithelial+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Antagonistic roles of Notch and p63 in controlling mammary epithelial cell fate.</a> Cell Death Differ. 17 (10), 1600-1610 (2010).</li>
<li>Hines, W. C., Su, Y., Kuhn, I., Polyak, K., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+out+the+FACS%3A+a+devil+in+the+details%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Sorting out the FACS: a devil in the details.</a> Cell Rep. 6 (5), 779-781 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La cultura ex vivo qui descritto fornisce microstrutture del tessuto del seno contenenti dotti e lobuli intatte, insieme ad altri tipi di cellule che normalmente si trovano in seno femminile umano. Nella lavorazione del tessuto mammario umano normalmente ottenuti da mammoplastiche riduzione, rimozione del tessuto adiposo, la digestione enzimatica e meccanica della matrice stromale, e lisi dei globuli rossi arricchisce per frammenti condotto latte e unità lobulare duttali terminali. Digestione enzimatica Gentle ...

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Marie Shamseddin
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Marie Shamsheddin

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Erratum: An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

Informazioni sul paesaggio mutazionale di cancro al seno sta aumentando a ritmi sostenuti. Meno attenzione è stata rivolta a fattori sistemici che influenzano lo sviluppo del cancro al seno. L&#39;esposizione agli ormoni riproduttivi ha un impatto importante sulla progressione della malattia 1-3. Tuttavia, i meccanismi con cui gli ormoni riproduttivi incidono sul seno umano sono poco conosciuti. Lavora con modelli di topo geneticamente ha rivelato che coinvolgono cellule segnalazione intrinseca e paracrine attraverso diversi effettori a valle 4. La conoscenza limitata su azione ormonale nel seno umano è in gran parte attribuibile alla mancanza di modelli adeguati. Maggior parte dei lavori sui meccanismi di recettore per gli estrogeni (ER) e del recettore del progesterone (PR) segnalazione è stata eseguita con linee di cellule del recettore dell&#39;ormone positivi cancro al seno, come MCF-7 e T47D. Questi sono stati ottenuti da versamento pleurico di pazienti con carcinoma mammario avanzato che aveva already ricevuto trattamenti multipli 5. La rilevanza biologica dei risultati di tali modelli semplici in vitro del seno umano è geni discutibili e bersaglio identificati in questi modelli in vitro sono differiscono da geni bersaglio che sono identificati in modelli animali 6. Quando le cellule epiteliali mammarie umane primaria sono coltivati ​​in vitro tendono a perdere l&#39;espressione del recettore ormonale e, quindi, la risposta ormonale 7,8. Questo problema può essere circumventd da approcci 3D sofisticati con matrigel. In questo modo, C. Clarke e colleghi sono riusciti a stabilire cellule epiteliali mammarie che hanno mantenuto l&#39;espressione del recettore ormonale e hanno mostrato una risposta proliferativa di progesterone stimolazione 9. Tuttavia, due importanti in vivo dei recettori del progesterone geni bersaglio, Wnt-4 e RANKL, non sono state indotte dopo stimolazione progesterone in questo sistema 9. Questo approccio è stato recentemente approvato ulteriormente con in vitro </em&gt; ormone pretrattamento e induzione RANKL è stato raggiunto 10. Un avvertimento resta che matrigel ha attività che dipendono in batch, è costoso, e richiede un disegno sperimentale che è adatto solo per il numero di cellule piccole. Sulla base della constatazione che in ER vivo e segnalazione PR sono in gran parte mediata da interazioni paracrine 11, abbiamo sostenuto che le interazioni intercellulari devono essere mantenuti. Un altro fattore importante che si perde come tessuti sono correlate alle cellule singole per la cultura in vitro sono le interazioni delle cellule epiteliali con la matrice extracellulare; ma questi sono cruciali per la differenziazione epiteliale e la loro distruzione è importante nella tumorigenesi 12. Con questo in mente, abbiamo stabilito un metodo per isolare microstrutture del tessuto mammario da fresco materiale chirurgico scarto 13. Il parenchima mammario, costituito da un epitelio doppio strato con luminale interna ed esterna myoepithelicellule al, viene sezionato dal tessuto adiposo e sottoposti alla dissociazione enzimatica e meccanica. Dopo il lavaggio e centrifugazione, frammenti di condotti del latte si ottengono che mantengono una stretta interazione con molte cellule stromali. Queste microstrutture del tessuto rimangono ormone reattivo. Il modello è stato validato in campioni clinici 13. Come tale, il presente procedimento può aiutare a studiare l&#39;azione ormonale nel seno in un contesto biologicamente e clinicamente rilevante.

<table><tbody><tr><td>Centrifuga per microlitri</td><td>Heraeus Biofuge Fresco</td><td>75005521</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>5810 000.327</td><td></td></tr><tr><td>Cryobox</td><td>Nalgene&nbsp; &nbsp;</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Congelatore a velocità controllata EF600 Grant</td><td>Asymptote&nbsp;</td><td>Incubatore CO<</td>sub>2 EF600 <td></td></tr><tr><td></td><td>Hera Cell Heraeus</td><td>51022391</td><td></td></tr><tr><td>Roller Mixer SRT9D</td><td>Sturt</td><td>SRT9D</td><td></td></tr><tr><td>Cassette istologiche</td><td>Medizintechnik</td><td>81-0021-00</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Strile Surgical Blade&nbsp;</td><td>Aesculap</td><td>BB536&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Aesculap</td><td>BB084R</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Aesculap</td><td>BD047R</td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Aesculap</td><td>BC374R</td><td></td></tr><tr><td>Stampo a base di paraffina</td><td>SAKURA</td><td>4166</td><td></td></tr><tr><td>Temperatura di taglio ottimale (OCT) Cryomatrix</td><td>Thermoscientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina&nbsp;</td><td>Tecnologie di vita</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotico/antimicotico</td><td>Tecnologie di vita</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F/12</td><td>Tecnologie di vita</td><td>11039-021</td><td>Preriscaldamento (37 &deg; C)</td></tr><tr><td>Collagenasi</td><td>Roche</td><td>11 088 793 001</td><td>Preriscaldamento (37 &deg; C)</td></tr> <tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Life Technologies</td><td>10270</td><td>Può essere sostituito con</td></tr><tr><td>tampone per lisi ematica di cellule di</td> siero fetale di vitello <td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td> <td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Roth</td><td>335</td><td></td></tr><tr><td>Isopentano</td><td>Sigma</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Merck</td><td>1009831000</td><td></td></tr><tr><td>Fiale criogeniche (5,0 ml)</td><td>VWR, International</td><td>479-0820</td><td></td></tr><tr><td>Piatto di coltura a bassissimo attacco</td><td>Corning, NY 14831</td><td>3471</td><td></td></tr></tbody></table>

un<em&gt; ex vivo</em&gt; modello per studiare hormone azione in seno umano

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

Lo studio di azione dell&#39;ormone nel seno umano è stata ostacolata dalla mancanza di adeguati sistemi modello. Alla cultura in vitro, cellule epiteliali mammarie primarie tendono a perdere l&#39;espressione del recettore dell&#39;ormone. Ampiamente recettore ormone linee di cellule di cancro al seno positivo utilizzati sono di scarsa rilevanza per la situazione in vivo. Qui, descriviamo un modello ex vivo per studiare l&#39;azione di ormoni nel seno umano. Campioni di tessuto mammario umano fresco da materiale di scarto chirurgico quali mammoplastiche riduzione o mammectomies sono meccanicamente ed enzimaticamente digerite per ottenere frammenti di tessuto contenenti dotti e lobuli e molteplici tipi di cellule stromali. Queste microstrutture tessuti conservati in terreno di base senza fattori di crescita mantenere i contatti intercellulari, l&#39;architettura dei tessuti, e rimangono ormone reattivo per diversi giorni. Essi sono facilmente elaborati per l&#39;RNA e l&#39;estrazione di proteine, l&#39;analisi istologica o memorizzati in congelamento medio. Fluorescenzaattivato ordinamento delle cellule (FACS) può essere utilizzato per arricchire per specifiche popolazioni cellulari. Questo protocollo offre un approccio standard semplice per gli studi traslazionali con altamente complessi, variegati campioni umani.

Per studiare il ruolo di estrogeni e progesterone e per capire meglio le loro funzioni molecolari nel seno umano, raccogliamo campioni freschi umani del tessuto del seno da pazienti sottoposti mammoplastiche riduzione (Figura 1) dopo aver ottenuto il loro consenso informato. Abbiamo anche ottenere medica e riproduttiva storia del paziente, così come un campione di sangue per determinare i livelli sierici di progesterone al momento dell&#39;intervento. Tissue da mammoplastiche riduzione freschi è meccani...

Abbiamo sviluppato un nuovo modello di ex vivo per studiare l&#39;azione di ormoni nel seno umano. Si basa su microstrutture tessuti isolati da campioni di tessuto del seno chirurgici che conservano l&#39;architettura del tessuto, le interazioni intercellulari, e segnalazione paracrina.

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modello per studiare Hormone azione in seno umano

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è fornire un modello ex vivo della mammella umana che mantenga l'architettura tissutale, le interazioni intercellulari e la risposta ormonale, al fine di studiare l'azione degli ormoni. Il modello si basa su microstrutture tissutali umane preparate mediante il primo passaggio di dissezione del parenchima mammario, costituito da dotti e lobuli, separandolo dallo stroma mammario adiposo. Oltre agli adipociti, lo stroma contiene fibroblasti, cellule immunitarie e cellule endoteliali.Una volta che il tessuto parenchimale è stato liberato dal tessuto adiposo, viene dissociato meccanicamente in frammenti delle dimensioni di una capocchia di spillo utilizzando bisturi opposti. Successivamente, la massa tissutale è sottoposta a digestione enzimatica con collaghenasi; se desiderato, la stimolazione ormonale può essere associata a questo passaggio. Le microstrutture tissutali vengono quindi recuperate mediante centrifugazione, seguita dalla rimozione del tessuto adiposo residuo, della frazione arricchita in fibroblasti e dei globuli rossi.Dopo una procedura di recupero, la sospensione del tessuto mammario residuo digerito è arricchita per microstrutture tissutali contenenti cellule luminari e mioepiteliali con la lamina basale circostante, cellule endoteliali fibroblastiche e cellule immunitarie. In definitiva, la coltura ex vivo viene utilizzata per valutare la morfologia delle microstrutture. La citometria a flusso attivata da fluorescenza è utilizzata per separare le sottopopolazioni cellulari del tessuto mammario e l'analisi proteica e trascrittomica viene impiegata per studi sulla risposta agli ormoni.Gli ormoni controllano lo sviluppo del seno e hanno un ruolo importante nella tumorigenesi mammaria. La segnalazione ormonale è stata studiata principalmente nel cancro al seno, in linee cellulari di colture tessutali e in modelli di malattia su plastica. Tuttavia, quando le cellule epiteliali mammarie primarie vengono coltivate in vitro, perdono l'espressione dei recettori ormonali.Ora, le microstrutture tissutali ottenute da materiale chirurgico di scarto rimangono sensibili agli ormoni e i campioni dei pazienti riflettono la diversità individuale. La dimostrazione visiva di questo metodo è importante poiché i passaggi di digestione del tessuto e l'ottenimento di microstrutture da tessuti eterogenei sono complessi. La ghiandola mammaria umana è complessa.La concentrazione di collagene e il tempo di digestione sono fattori critici per evitare una digestione parziale o eccessiva. Questo modello ex vivo può aiutarci a comprendere come gli ormoni riproduttivi agiscano sul tessuto mammario umano e attraverso quali meccanismi influiscano sullo sviluppo e sulla progressione del cancro. Per iniziare, trasferire i flaconi contenenti i campioni di tessuto in una cappa a flusso laminare situata in una stanza per colture cellulari di livello P2, operando su un tagliere sterile.Tenere il materiale con una pinzetta e rimuovere con un bisturi il grasso e i vasi residui dal parenchima mammario. Posizionare il materiale bianco in soluzione salina tamponata al fosfato o PBS in una piastra per colture cellulari da 10 centimetri. Dopo aver rimosso il tessuto adiposo da tutti i pezzi e averlo smaltito secondo le norme di sicurezza del laboratorio, riposizionare le parti bianche contenenti i tessuti epiteliali sulla tavoletta da taglio utilizzando due bisturi opposti, tagliare il tessuto e sminuzzarlo in pezzi di diametro inferiore a due millimetri.Collocare il materiale tritato in provette di dimensione adeguata per l'inclusione in paraffina e le stimolazioni ormonali. Utilizzare un millilitro di materiale in una provetta da cinque millilitri. Quando si esegue la citofluorimetria attivata da fluorescenza o FACS, utilizzare 2,5 millilitri di materiale in una provetta da 15 millilitri.Se si congelano aliquote, utilizzare 10 millilitri di materiale tritato in un tubo da 50 millilitri. Quindi aggiungere la miscela di digestione. La miscela master contenente collagenasi A in un volume pari fino a quattro volte la quantità di materiale digerito per garantire un'adeguata agitazione e aerazione.Successivamente, aggiungere gli ormoni alla concentrazione desiderata per la stimolazione con 17 beta estradiolo e progest stone. Utilizzare una concentrazione finale di 20 nanomolar. Aggiungere il veicolo solo al campione di controllo, agitare o mescolare accuratamente i campioni per assicurare una distribuzione uniforme di tutti i materiali nei tubi della centrifuga.Quindi posizionare i tubi sul mixer a rulli all'interno di un incubatore a 37 gradi Celsius e 40 giri al minuto per tutta la notte. Lasciare avvenire la digestione per almeno 12 ore per recuperare il tessuto. Centrifugare i tubi delle microstrutture a 400 G per cinque minuti.Dopo aver aspirato il grasso dalla parte superiore del tubo da centrifuga, trasferire il residuo soprannatante acquoso, arricchito in fibroblasti, in un nuovo tubo da centrifuga. Quindi centrifugare il soprannatante acquoso a 1.250 G per cinque minuti. Poiché le microstrutture del tessuto mammario sono molto adesive in tutti i passaggi successivi tranne che per il riutilizzo, non si consiglia di risospendere il pellet mediante pipettaggio delicato per evitare il rischio di perdere materiale.Successivamente, risospendere i pellet arricchiti in microstrutture in PBS con 2% FCS e risospendere anche i pellet arricchiti in fibroblasti derivati dal soprannatante acquoso in PBS con 2% FCS, dopo la centrifugazione di entrambe le provette. Come in precedenza, eliminare il soprannatante e risospendere i pellet in tre-cinque millilitri di buffer per la lisi dei globuli rossi, quindi incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Aggiungere quindi PBS con 2% FCS in un volume pari al doppio di quello del buffer per la lisi dei globuli rossi e centrifugare dopo l'aggiunta.Risospendere il pellet in PBS-FCS 2%. Per preparare i campioni per la citometria a flusso, aggiungere da uno a due millilitri di tripsina 0,25% al pellet e mescolare delicatamente su e giù con una pipetta da 1000 microlitri per due minuti per dissociare le cellule, quindi inibire l'attività della tripsina aggiungendo nove millilitri di PBS 2% FCS e centrifugare a 450 ×g per cinque minuti. Risospendere il pellet in 10 millilitri di PBS 2% FCS e trasferire la sospensione cellulare su un filtro cellulare da 40 micron posizionato sopra un tubo da centrifuga da 50 millilitri per ottenere cellule singole. Dopo la centrifugazione, separare le cellule immunitarie, i fibroblasti e le cellule endoteliali dalle microstrutture mediante un cocktail di anticorpi prima di ordinarle con FACS per preparare le cellule per l'istologia. Lavare e digerire i campioni come in precedenza, quindi fissare il pellet in un millilitro di paraformaldeide al 4% in PBS a temperatura ambiente per 30 minuti.Centrifugare a 1.250 ×g per cinque minuti e lavare con uno o due millilitri di PBS per due volte; dopo il lavaggio, centrifugare a 16.000 ×g per 10 minuti. Nel frattempo, preparare l’agarosio allo 0,1% in tampone tris acetato EDTA e riscaldare la soluzione nel forno a microonde fino a raggiungere l’ebollizione. Rimuovere la soluzione dal forno a microonde e agitare delicatamente per mescolarla e risospendere eventuali particelle di agarosio residue.Raffreddare la soluzione di aro a 50 gradi Celsius prima di versare un millilitro in uno stampo di base in paraffina. Successivamente, eliminare il soprannatante e posizionare i pellet sulla parte superiore dello strato solidificato di aros utilizzando l'estremità piatta di una spatola. Coprirli tutti con uno strato aggiuntivo di agros insieme ai campioni di aro.Posizionare un foglio di carta bianca da ufficio nella cassetta con le informazioni sul numero di riduzione, la condizione sperimentale e la data scritte a matita, in modo da resistere a tutti i successivi passaggi di trattamento. Dopo che l'agarro si è solidificato, inserire i blocchi di aros nelle cassette di istologia per l'inclusione in paraffina. Collocare le cassette in PBS per tutta la notte o in etanolo al 70% per la conservazione durante il fine settimana a quattro gradi Celsius, prima di trasferire le cassette di istologia al laboratorio di istologia per l'inclusione in paraffina, al fine di preparare i campioni per il congelamento; sospendere le microstrutture in un mezzo di congelamento costituito da FCS con il 10% di dimetilsulfossido e congelare aliquote di un millilitro.In provette criogeniche, il numero di provette dipende dalla quantità di materiale primario ottenuto dalla riduzione. Tessuto di mammoplastica da riduzione fresca. La mammoplastica viene dissociata meccanicamente ed enzimaticamente.Le microstrutture tissutali risultanti presentano dotti e lobuli caratteristici del tessuto mammario di origine. L'analisi immunohistochimica di microstrutture tissutali in paraffina colorate per il marcatore miotepiteliale delta NP 63 rivela che le microstrutture conservano non solo le caratteristiche morfologiche del tessuto mammario normale, ma anche il profilo molecolare delle popolazioni cellulari per valutare la risposta ormonale del tessuto. Le microstrutture sono state trattate con un agonista sintetico del recettore della progesterone, promega stone, oppure con etanolo come controllo, al fine di arricchire le cellule luminari positive ai recettori ormonali.La citometria a flusso &egrave; stata eseguita in base ai marcatori epiteliali e mioepiteliali, dopo l'eliminazione di fibroblasti endoteliali e cellule immunitarie mediante un cocktail di anticorpi anti-CD31, anti-FAP e anti-CD45. L'analisi Q-R-T-P-C-R di cellule EPAM positive e CD10 negative ha mostrato un'upregolazione del gene bersaglio della progesterone wind four nella popolazione arricchita di cellule luminari proveniente dalle microstrutture tissutali esposte alla pietra Promega. Una volta padroneggiata questa tecnica, &egrave; possibile completarla in due giorni, se eseguita correttamente. In modo particolarmente importante, la concentrazione di collagene, la digestione, la temperatura, la durata e la velocit&agrave; di rotazione durante la digestione del tessuto sono tutti dettagli significativi specificati nel protocollo.Questo metodo può essere esteso a studi farmacologici, in particolare per una migliore caratterizzazione dei modulatori selettivi del recettore degli estrogeni o dei progestinici. In effetti, i progestinici sono ampiamente utilizzati nel contesto della contraccezione ormonale. Tuttavia, si conosce poco dell'azione sui tessuti mammarî umani dopo il suo sviluppo.Questo modello di microstruttura tissutale x vivo ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dello sviluppo mammario e della carcinogenesi per esplorare il contributo e l'azione ormonale nella mammella umana.

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