Design, Trattamento delle superfici, Cellular placcatura, e Coltura di neuronali modulari reti composte di circuiti funzionalmente interconnessi

Questo manoscritto descrive un protocollo di crescere in vitro reti modulari composti da spazialmente confinate, circuiti neuronali funzionalmente interconnessi. Una maschera polimerica viene usata per modello uno strato proteico per favorire l'adesione cellulare su substrato di coltura. Neuroni placcato crescono su aree rivestite stabilire connessioni spontanee e che presentano attività elettrofisiologica.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di far crescere reti modulari in vitro costituite da circuiti neuronali spazialmente confinati, funzionali e interconnessi. Ciò si ottiene preparando prima gli stencil PDMS per modellare uno strato proteico per promuovere l'adesione cellulare sul substrato di coltura. Il secondo passo è pulire i substrati di coltura.

In particolare le superfici delle piastre di Petri, dei vetrini coprioggetto e degli array multielettrodo. Successivamente, gli stencil PDMS vengono depositati sul substrato di coltura e vengono creati i modelli di strato proteico adesivo desiderati. La fase finale è la placcatura delle cellule gliali neuronali.

In definitiva, le registrazioni di array multi-elettrodo e l'imaging del calcio vengono utilizzate per mostrare la dinamica delle reti neuronali modulari raggiunte. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande aperte chiave nel campo delle neuroscienze, come lo studio delle dinamiche di comunicazione tra assemblaggi neuronali, e lì contrasterà le condizioni sperimentali. Il polimetilsoano o PDMS viene prodotto mescolando prima una parte di agente indurente con 10 parti di agente di base.

Dopo cinque minuti di miscelazione, spostare la miscela in una camera a vuoto per 15 minuti. Dopo 15 minuti, controllare la presenza di bolle e rimettere la soluzione nella camera per altri 15 minuti. Quindi, prepara un wafer sullo spin coder.

Aprire le manopole del gas per l'azoto gassoso. Metti un wafer sulla centrifuga e fissala in posizione con l'aspirapolvere. Quindi versare uno strato sottile di PDMS sul wafer.

Centrifugare il wafer con PDMS per un minuto a 1000 giri/min per creare un rivestimento PDMS di 100 micron di spessore sul wafer. Quindi trasferire il wafer su una piastra calda a 100 gradi Celsius. Lasciate cuocere lì per 30 minuti.

Dopo che il PDMS si è indurito, utilizzare una pipetta per delineare i bordi degli stencil con altro PDMS. Quindi cuocere il PDMS aggiunto sul wafer. Come prima, quando i bordi del PDMS si sono induriti, tagliare lo stencil lungo i bordi e lo stencil in silicone dal wafer per iniziare i RIN.

Il coperchio in vetro quadrato da 23 millimetri scivola con acqua distillata, seguita da etanolo al 70%, quindi acetone, quindi isopropanolo e infine acqua distillata. Ancora una volta, asciugare i quadrati sotto un flusso di azoto gassoso. Quindi, premere delicatamente uno stencil PDMS su ciascun vetrino coprioggetti.

Mettere i vetrini coprioggetti con gli stencil in una camera a vuoto per 15 minuti. Una volta aspirato, far cadere un millilitro di PDL sugli stencil e rimettere gli assemblaggi nella camera a vuoto per 20 minuti. Ripetere il ciclo di vuoto di 20 minuti una volta, quindi lasciare asciugare il PDL durante la notte il giorno successivo.

Preparare le piastre di Petri che sosterranno le celle di rete. Primo. Coprire i piatti da 3,5 centimetri con un millilitro di PDL per due ore. Successivamente, a temperatura ambiente, rimuovere il PDL dalla capsula mediante aspirazione.

Quindi lavate i piatti con acqua distillata e lasciateli asciugare. Una volta che una pirofila è asciutta, aggiungere un piccolo volume di grasso siliconico alla pirofila secondo i quattro angoli del vetrino coprioggetti. Posizionare i vetrini coprioggetto sul piatto con il PDMS rivolto verso l'alto e premerli delicatamente verso il basso per assicurarsi che siano attaccati.

Ora delicatamente pinzetta A-P-D-M-S dai vetrini coprioggetto lasciando il modello PDL. Infine, sterilizzare i piatti esponendoli ai raggi UV per sette minuti. Per prima cosa, pulire l'array di elettrodi multipli lavandolo sotto l'acqua del rubinetto e poi sonicarlo in un detergente enzimatico concentrato.

Ripeti questi passaggi tre volte. Quindi sonicare il MEA in acqua distillata pura tre volte, dopodiché sotto una cappa. Lavare prima il MEA con acqua distillata.

Sterilizzarlo con luce UV per 30 minuti. Quindi, prepara prima la rete di supporto. Versare il PDMS in una piastra a 12 o 24 pozzetti.

Una volta che il PDMS si è indurito, rimuoverlo con un ago. Ora tagliate dei fori al centro dei dischi per fare degli anelli, che funzionano come supporto per lo stampo. Ora posiziona un supporto stampo al centro del MEA e copri la superficie esterna esposta del MEA.

Lasciate riposare per due ore in camera. Quindi aspirare il lavaggio PDL, la superficie esterna esposta del MEA con acqua distillata e rimuovere il supporto dello stampo in modo che il MEA possa essere lasciato asciugare. Ora attacca uno stencil a un micro manipolatore preparato al microscopio invertito.

Ispezionare e allineare la struttura modellata in modo che corrisponda agli elettrodi del MEA. Quindi utilizzare il micro manipolatore per abbassare lo stencil sulla superficie MEA. Una volta collegato, sollevare il manipolatore microm e, se necessario, utilizzare una pinzetta per applicare una piccola quantità di pressione per evitare che il PDMS si stacchi.

A questo punto trasferire il MEA nella camera a vuoto per 15 minuti. Quindi applicare una goccia di un millilitro di PDL sullo stencil e rimetterlo nella camera a vuoto per due cicli di 20 minuti. Lasciare asciugare il PDL per una notte il giorno successivo.

Rimuovere gli stencil P DM S dai meas usando una pinzetta. Infine, sterilizzare i meas con i raggi UV per sette minuti. Sono quindi pronti per le cellule in preparazione, le cellule di coltura e preparano le sospensioni come nel protocollo di testo.

Dopo aver sospeso il numero richiesto di celle, placcarle al centro dell'area modellata sul MEA o sul vetrino coprioggetto. Un MEA deve essere caricato con volumi da 100 microlitri e un vetrino coprioggetto. Contiene 1000 microlitri.

Incubare le cellule della piastra per 40 minuti, quindi aggiungere il terreno di placcatura per mantenere le cellule ogni quattro giorni. Aggiungere nuovamente il terreno di coltura fresco e integrato. Dopo il sesto o settimo giorno, le connessioni neuronali tra i moduli dovrebbero iniziare a formarsi a quel punto.

Diluire il terreno di coltura con un agente antimitotico per prevenire la crescita eccessiva gliale. Dopo quattro giorni in vitro, è possibile osservare che i neuroni attaccati all'interno del PD DL codificano macchie di 600 micron quadrate dopo 14 giorni. Nella cultura, il neurone ha stabilito spontaneamente una connessione all'interno dei moduli e tra i moduli che formano reti funzionali attive.

Sono stati osservati circuiti neuronali di 300 micron quadrati mantenendo la stessa concentrazione di placcatura. L'imaging del calcio è stato eseguito utilizzando un obiettivo Forex per un'ampia attività nelle reti coltivate. Tra i moduli verde e rosa si vede un numero maggiore di connessioni mentre i moduli blu e rosso sono meno collegati agli altri moduli.

Viene mostrato un grafico dell'insorgenza degli eventi di calcio per un film acquisito a 30 hertz con un'immagine da 1 milione di pixel. I moduli verde e rosa erano altamente sincronizzati, mentre i moduli blu e rosso erano meno. Una rete modulare corticale composta da tre circuiti distinti è stata registrata a 21 giorni in vitro.

Utilizzando un MEA, si è scoperto che i circuiti neuronali a circa 600 micron di distanza sono interconnessi. La loro attività elettrofisiologica è stata ricostruita. Utilizzando un preciso algoritmo di rilevamento dei picchi di temporizzazione, è stato realizzato un grafico del roster di cinque minuti di questi dati con dati cluster codificati a colori.

In questo modo si ottiene un confronto tra l'intera rete e l'attività di un singolo cluster e si ottiene una visione approfondita della sincronia all'interno del cluster. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare gli stencil PDM e usarli per modellare l'adesione delle cellule neurogliali portando alla creazione di una rete modale funzionale.