Design, Trattamento delle superfici, Cellular placcatura, e Coltura di neuronali modulari reti composte di circuiti funzionalmente interconnessi
15 aprile 2015
Questo manoscritto descrive un protocollo di crescere in vitro reti modulari composti da spazialmente confinate, circuiti neuronali funzionalmente interconnessi. Una maschera polimerica viene usata per modello uno strato proteico per favorire l'adesione cellulare su substrato di coltura. Neuroni placcato crescono su aree rivestite stabilire connessioni spontanee e che presentano attività elettrofisiologica.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di far crescere reti modulari in vitro costituite da circuiti neuronali spazialmente confinati, funzionali e interconnessi. Ciò si ottiene preparando prima gli stencil PDMS per modellare uno strato proteico per promuovere l'adesione cellulare sul substrato di coltura. Il secondo passo è pulire i substrati di coltura.
In particolare le superfici delle piastre di Petri, dei vetrini coprioggetto e degli array multielettrodo. Successivamente, gli stencil PDMS vengono depositati sul substrato di coltura e vengono creati i modelli di strato proteico adesivo desiderati. La fase finale è la placcatura delle cellule gliali neuronali.
In definitiva, le registrazioni di array multi-elettrodo e l'imaging del calcio vengono utilizzate per mostrare la dinamica delle reti neuronali modulari raggiunte. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande aperte chiave nel campo delle neuroscienze, come lo studio delle dinamiche di comunicazione tra assemblaggi neuronali, e lì contrasterà le condizioni sperimentali. Il polimetilsoano o PDMS viene prodotto mescolando prima una parte di agente indurente con 10 parti di agente di base.
Dopo cinque minuti di miscelazione, spostare la miscela in una camera a vuoto per 15 minuti. Dopo 15 minuti, controllare la presenza di bolle e rimettere la soluzione nella camera per altri 15 minuti. Quindi, prepara un wafer sullo spin coder.
Aprire le manopole del gas per l'azoto gassoso. Metti un wafer sulla centrifuga e fissala in posizione con l'aspirapolvere. Quindi versare uno strato sottile di PDMS sul wafer.
Centrifugare il wafer con PDMS per un minuto a 1000 giri/min per creare un rivestimento PDMS di 100 micron di spessore sul wafer. Quindi trasferire il wafer su una piastra calda a 100 gradi Celsius. Lasciate cuocere lì per 30 minuti.
Dopo che il PDMS si è indurito, utilizzare una pipetta per delineare i bordi degli stencil con altro PDMS. Quindi cuocere il PDMS aggiunto sul wafer. Come prima, quando i bordi del PDMS si sono induriti, tagliare lo stencil lungo i bordi e lo stencil in silicone dal wafer per iniziare i RIN.
Il coperchio in vetro quadrato da 23 millimetri scivola con acqua distillata, seguita da etanolo al 70%, quindi acetone, quindi isopropanolo e infine acqua distillata. Ancora una volta, asciugare i quadrati sotto un flusso di azoto gassoso. Quindi, premere delicatamente uno stencil PDMS su ciascun vetrino coprioggetti.
Mettere i vetrini coprioggetti con gli stencil in una camera a vuoto per 15 minuti. Una volta aspirato, far cadere un millilitro di PDL sugli stencil e rimettere gli assemblaggi nella camera a vuoto per 20 minuti. Ripetere il ciclo di vuoto di 20 minuti una volta, quindi lasciare asciugare il PDL durante la notte il giorno successivo.
Preparare le piastre di Petri che sosterranno le celle di rete. Primo. Coprire i piatti da 3,5 centimetri con un millilitro di PDL per due ore. Successivamente, a temperatura ambiente, rimuovere il PDL dalla capsula mediante aspirazione.
Quindi lavate i piatti con acqua distillata e lasciateli asciugare. Una volta che una pirofila è asciutta, aggiungere un piccolo volume di grasso siliconico alla pirofila secondo i quattro angoli del vetrino coprioggetti. Posizionare i vetrini coprioggetto sul piatto con il PDMS rivolto verso l'alto e premerli delicatamente verso il basso per assicurarsi che siano attaccati.
Ora delicatamente pinzetta A-P-D-M-S dai vetrini coprioggetto lasciando il modello PDL. Infine, sterilizzare i piatti esponendoli ai raggi UV per sette minuti. Per prima cosa, pulire l'array di elettrodi multipli lavandolo sotto l'acqua del rubinetto e poi sonicarlo in un detergente enzimatico concentrato.
Ripeti questi passaggi tre volte. Quindi sonicare il MEA in acqua distillata pura tre volte, dopodiché sotto una cappa. Lavare prima il MEA con acqua distillata.
Sterilizzarlo con luce UV per 30 minuti. Quindi, prepara prima la rete di supporto. Versare il PDMS in una piastra a 12 o 24 pozzetti.
Una volta che il PDMS si è indurito, rimuoverlo con un ago. Ora tagliate dei fori al centro dei dischi per fare degli anelli, che funzionano come supporto per lo stampo. Ora posiziona un supporto stampo al centro del MEA e copri la superficie esterna esposta del MEA.
Lasciate riposare per due ore in camera. Quindi aspirare il lavaggio PDL, la superficie esterna esposta del MEA con acqua distillata e rimuovere il supporto dello stampo in modo che il MEA possa essere lasciato asciugare. Ora attacca uno stencil a un micro manipolatore preparato al microscopio invertito.
Ispezionare e allineare la struttura modellata in modo che corrisponda agli elettrodi del MEA. Quindi utilizzare il micro manipolatore per abbassare lo stencil sulla superficie MEA. Una volta collegato, sollevare il manipolatore microm e, se necessario, utilizzare una pinzetta per applicare una piccola quantità di pressione per evitare che il PDMS si stacchi.
A questo punto trasferire il MEA nella camera a vuoto per 15 minuti. Quindi applicare una goccia di un millilitro di PDL sullo stencil e rimetterlo nella camera a vuoto per due cicli di 20 minuti. Lasciare asciugare il PDL per una notte il giorno successivo.
Rimuovere gli stencil P DM S dai meas usando una pinzetta. Infine, sterilizzare i meas con i raggi UV per sette minuti. Sono quindi pronti per le cellule in preparazione, le cellule di coltura e preparano le sospensioni come nel protocollo di testo.
Dopo aver sospeso il numero richiesto di celle, placcarle al centro dell'area modellata sul MEA o sul vetrino coprioggetto. Un MEA deve essere caricato con volumi da 100 microlitri e un vetrino coprioggetto. Contiene 1000 microlitri.
Incubare le cellule della piastra per 40 minuti, quindi aggiungere il terreno di placcatura per mantenere le cellule ogni quattro giorni. Aggiungere nuovamente il terreno di coltura fresco e integrato. Dopo il sesto o settimo giorno, le connessioni neuronali tra i moduli dovrebbero iniziare a formarsi a quel punto.
Diluire il terreno di coltura con un agente antimitotico per prevenire la crescita eccessiva gliale. Dopo quattro giorni in vitro, è possibile osservare che i neuroni attaccati all'interno del PD DL codificano macchie di 600 micron quadrate dopo 14 giorni. Nella cultura, il neurone ha stabilito spontaneamente una connessione all'interno dei moduli e tra i moduli che formano reti funzionali attive.
Sono stati osservati circuiti neuronali di 300 micron quadrati mantenendo la stessa concentrazione di placcatura. L'imaging del calcio è stato eseguito utilizzando un obiettivo Forex per un'ampia attività nelle reti coltivate. Tra i moduli verde e rosa si vede un numero maggiore di connessioni mentre i moduli blu e rosso sono meno collegati agli altri moduli.
Viene mostrato un grafico dell'insorgenza degli eventi di calcio per un film acquisito a 30 hertz con un'immagine da 1 milione di pixel. I moduli verde e rosa erano altamente sincronizzati, mentre i moduli blu e rosso erano meno. Una rete modulare corticale composta da tre circuiti distinti è stata registrata a 21 giorni in vitro.
Utilizzando un MEA, si è scoperto che i circuiti neuronali a circa 600 micron di distanza sono interconnessi. La loro attività elettrofisiologica è stata ricostruita. Utilizzando un preciso algoritmo di rilevamento dei picchi di temporizzazione, è stato realizzato un grafico del roster di cinque minuti di questi dati con dati cluster codificati a colori.
In questo modo si ottiene un confronto tra l'intera rete e l'attività di un singolo cluster e si ottiene una visione approfondita della sincronia all'interno del cluster. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare gli stencil PDM e usarli per modellare l'adesione delle cellule neurogliali portando alla creazione di una rete modale funzionale.
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Panoramica
Questo manoscritto descrive un protocollo per coltivare in vitro reti modulari costituite da circuiti neuronali funzionalmente interconnessi e confinati spazialmente. Questo risultato viene ottenuto preparando stencil in PDMS per definire un livello proteico che promuove l'adesione cellulare sul substrato di coltura.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Elettrofisiologia
Sfondo
- Le reti neuronali in vitro sono essenziali per lo studio della connettività neuronale.
- Il confinamento spaziale dei circuiti neuronali può potenziare l'interconnessione funzionale.
- L'adesione cellulare è fondamentale per una crescita neuronale efficace.
- I telai in PDMS sono comunemente utilizzati per la definizione di modelli nella coltura cellulare.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per creare reti neuronali modulari in vitro.
- Studiare le proprietà elettrofisiologiche di queste reti.
- Stabilire connessioni spontanee tra neuroni seminati.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di stencil in PDMS per il patterning di proteine.
- Pulizia di substrati per la coltura, come piastre di Petri e coprioggetti.
- Deposizione di stencil in PDMS sul substrato per creare pattern adesivi.
- Piastramento di cellule neuronali e gliali sul substrato stampato.
Risultati principali
- Corretto assestamento di circuiti neuronali confinati spazialmente.
- Dimostrazione di connessioni spontanee tra neuroni.
- Attività elettrofisiologica osservata nelle reti coltivate.
- Convalida del protocollo per futuri studi sulla connettività neuronale.
Conclusioni
- Il protocollo crea in modo efficace reti neuronali modulari in vitro.
- Il confinamento spaziale migliora l'interconnettività funzionale.
- Questo metodo può essere utilizzato per ulteriori studi elettrofisiologici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Questa metodologia in vitro di rete neuronale modulare consente un controllo spaziale preciso degli assemblaggi neuronali, supportando la riduzione del rischio meccanicistica nella validazione degli obiettivi per la scoperta di farmaci nel campo delle neuroscienze. Stabilendo circuiti funzionalmente interconnessi con letture elettrofisiologiche e di imaging del calcio quantificabili, l'approccio fornisce un'elevata affidabilità predittiva nei saggi di connettività neuronale. Affronta una sfida fondamentale nella fase di scoperta: modellare la dinamica dei circuiti cerebrali per valutare gli effetti dei composti sulla sincronia e sulla comunicazione della rete.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche modulando la distanza tra compartimenti per regolare la sincronizzazione tra moduli.
- Valore operativo: Fornisce un sistema rilevante per la patologia per valutare l'interazione con il bersaglio mediante la formazione spontanea di circuiti neuronali e l'instaurazione di una rete funzionale.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera misurazioni quantitative di variabili dipendenti mediante registrazioni con array multiplo di elettrodi e imaging del calcio per valutare la dinamica dell'attività della rete.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione dei saggi attraverso un patterning riproducibile con stencil in PDMS e il deposito di strati proteici per un'adesione cellulare costante.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Offre un allineamento traslazionale dei biomarcatori correlando la densità di connessione con l'insorgenza della sincronizzazione, consentendo decisioni di avanzamento corrette in base al rischio.
- Valore operativo: Facilita la continuità del modello preclinico permettendo l'osservazione della formazione delle connessioni neuronali dopo 6-7 giorni in vitro e della stabilizzazione entro il giorno 14.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta, consentendo la verifica di ipotesi sulle dinamiche della comunicazione neuronale, con risultati che informano direttamente l'identificazione dei composti promettenti mediante il profilo dell'attività della rete.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi permettendo un'indagine controllata su come la densità di connessione regola la sincronizzazione tra moduli nelle reti modulari.
- Screening: Garantisce la prontezza per saggi mediante protocolli standardizzati di trattamento della superficie e di semina cellulare che assicurano un attacco neuronale riproducibile alle aree trattate con PDL.
- Analisi: Fornisce il rilevamento di impulsi elettrofisiologici e la misurazione dell'inizio degli eventi di calcio, consentendo un confronto quantitativo della sincronia intra- e inter-cluster in diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla validazione preclinica dimostrando la formazione spontanea di reti funzionali che rispecchiano i principi di comunicazione dei circuiti in vivo.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile per la creazione di reti neuronali su diversi substrati (vetrini, MEA) al fine di supportare campagne ripetute di screening e studi di validazione degli obiettivi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione dei bersagli neuronali fornendo un sistema controllabile per studiare come la topologia strutturale influenzi la connettività funzionale.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità grazie a passaggi di rivestimento con PDL assistito da vuoto e sterilizzazione con raggi UV, che garantiscono una preparazione superficiale costante tra esperimenti.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione consentendo test di risposta dose-dipendente di composti sulla sincronia delle reti, riducendo il rischio biologico in fase avanzata nello sviluppo di farmaci per il sistema nervoso centrale.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sulla gestione del rischio quantificando le soglie di sincronizzazione dipendenti dalle connessioni, fornendo informazioni per la riduzione del rischio meccanicistica dei bersagli neuronali.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella fabbricazione di stencil microfluidici, nella coltura cellulare neuronale e nelle tecniche di registrazione elettrofisiologiche/ottiche.
- Presuppone l'accesso a strumentazione per la deposizione mediante centrifugazione, camere a vuoto, sterilizzatori a raggi UV, matrici di microelettrodi e sistemi di imaging al calcio.
- Necessita di una standardizzazione tra gruppi di lavoro per quanto riguarda la progettazione degli stencil, i protocolli di rivestimento proteico e le densità di semina, al fine di garantire la riproducibilità tra laboratori.
- Comporta considerazioni di adattamento per diversi sottotipi neuronali o rapporti di co-coltura con cellule gliali, per mantenere la stabilità della rete e prevenire la sovracrescita.
- Comprende limitazioni pratiche, come la necessità di un allineamento preciso degli stencil rispetto agli elettrodi della MEA e la dipendenza dalle dimensioni delle strutture in PDMS per definire le dimensioni del circuito (ad esempio, moduli quadrati di 300 micron).
