Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticelle per applicazioni di imaging multimodale molecolari

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di sintetizzare nanoparticelle bio-funzionalizzate di blu di Prussia per l'uso di agenti di imaging molecolare multimodale. Ciò si ottiene sintetizzando prima le nanoparticelle blu di Prussia che contengono ioni gadolinio o manganese, che migliorano il segnale MRI. Il secondo passo consiste nell'attaccare l'avadon fluorescente sulla superficie delle nanoparticelle, che conferisce la capacità di imaging fluorescente.

Successivamente, le nanoparticelle rivestite di avadon vengono biofunzionalizzate con la cellula desiderata che ha come bersaglio gli anticorpi biotinilati. Un ultimo passo consiste nell'eseguire un controllo di qualità sulle nanoparticelle bio-funzionalizzate misurando le loro dimensioni, il potenziale zeta e la stabilità temporale. In definitiva, le nanoparticelle biofunzionalizzate vengono utilizzate in applicazioni di imaging molecolare multimodale per visualizzare una specifica popolazione mirata di cellule all'interno di una miscela utilizzando l'imaging a fluorescenza e la risonanza magnetica.

Gli attuali agenti di imaging commerciali sono in genere monomodali e offrono una risoluzione solo a livello anatomico. Le nanoparticelle blu di Prussia combinano due modalità di imaging complementari, risonanza magnetica e fluorescenza, e consentono l'imaging molecolare e i livelli subcellulari. Le applicazioni delle nanoparticelle multimodali si estendono alla diagnosi di cancro e malattie infiammatorie, oltre al monitoraggio delle loro risposte al trattamento.

Questo perché le nanoparticelle bio-funzionalizzate possono mirare e legarsi a una popolazione di cellule all'interno di una regione specifica del corpo. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla diagnosi del cancro e delle malattie infiammatorie e sulla risposta al trattamento, può essere applicato anche ad altre condizioni patologiche che trarranno vantaggio dalla sensibilità e dalla specificità dell'imaging molecolare. Utilizzando la fluorescenza e la risonanza magnetica, abbiamo avuto l'idea di produrre queste nanoparticelle quando abbiamo determinato che il blu di Prussia e l'agente approvato dalla FDA per il consumo orale umano potevano essere sintetizzati stabilmente utilizzando uno schema di sintesi in una parte e robustamente bio-funzionalizzati utilizzando tecniche standard di bioconiugato.

Per iniziare, preparare una soluzione da 5 milioni di molari di potassio esasano ferrate, due su cinque millilitri di acqua deionizzata per preparare la soluzione A, la successiva soluzione di riparazione B, contenente 2,5 millimolari di ferro, tre cloruro e 2,5 millimolari di manganese. Due cloruri in 10 millilitri di acqua deionizzata per la sintesi di nanoparticelle di manganese blu di Prussia. Altre nanoparticelle possono essere sintetizzate come indicato nel protocollo di testo, trasferire la soluzione B in un pallone a fondo rotondo e agitare la soluzione a 1000 giri/min a temperatura ambiente.

Utilizzando una pompa peristaltica, aggiungere la soluzione, A goccia nel recipiente a una velocità di 10 millilitri all'ora. Dopo aver completato l'aggiunta della soluzione A, mescolare la miscela a 1000 giri/min per altri 30 minuti. Quindi trasferire un millilitro di aliquote della miscela in provette da microcentrifuga e aggiungere 0,2 millilitri di cinque millilitri di cloruro di sodio a ciascuna provetta.

Centrifugare le provette a 20.000 volte G per almeno 10 minuti, quindi rimuovere con cura il supinato, lasciando il pellet di nanoparticelle. Quindi, aggiungi un millilitro di acqua deionizzata a ciascun pellet. Utilizzare una micro punta per sospendere le nanoparticelle in modo uniforme in soluzione mediante sonicazione.

Lavare le nanoparticelle almeno altre tre volte per rimuovere i componenti della reazione iniziale dalla sospensione dopo la centrifuga finale, risospendere le nanoparticelle in un millilitro di acqua deionizzata dopo aver rivestito le nanoparticelle con tana fluorescente come descritto nel protocollo di testo, rimuovere le scorte di anticorpi biotinilati dal frigorifero. Qui. Utilizzare l'antigene gliale antineuronale due e l'eotassina umana tre. Trasferire l'anticorpo biotinilato in un filtro micro fuge in micro nylon 0,2, quindi centrifugare la provetta a 14.000 volte G per 10 minuti.

Successivamente, aggiungere meno o uguale a 0,05 milligrammi di anticorpo per milligrammo di nanoparticelle rivestite di Aden e coprire i tubi con un foglio di alluminio per proteggerli dalla luce. Incubare le provette agitando delicatamente per due-quattro ore a quattro gradi Celsius. Dopo aver attaccato gli anticorpi, aggiungere 10 microlitri di un milligrammo per millilitro di campione di nanoparticelle a 990 microlitri di acqua deionizzata in un tappo di plastica usa e getta e mescolarlo.

Bene, quindi determina la dimensione media delle nanoparticelle utilizzando un sistema di diffusione dinamica della luce con un angolo di misurazione di 173 gradi. Iniziare preparando sospensioni da 10 millilitri di cellule in PBS a una concentrazione di circa 100.000 cellule per millilitro per colture miste, devono essere preparate provette contenenti rapporti variabili di ciascuna linea cellulare come descritto nel protocollo di testo a due millilitri di BS al 5%, A per ciascuna provetta per bloccare le cellule e ridurre al minimo il legame non specifico. Quindi aggiungere un millilitro di un milligrammo per millilitro, biofunzionalizzare le nanoparticelle in ciascuna provetta e incubare la miscela per un'ora.

Quindi, sciacquare le cellule per liberarle dalle nanoparticelle non legate facendo girare i tubi a 1000 volte G per cinque minuti e piegando nuovamente i pellet in un millilitro di PBS. Ripeti questo processo almeno altre due volte. Fissare le cellule usando il 10% di formaldeide in PBS e poi aggiungere 10 microgrammi per millilitro, sette amminoactina e micina D in PBS per colorare le cellule, incubare la provetta su ghiaccio per 30 minuti e poi sciacquare le cellule con PBS.

Successivamente, caricare il campione nel citometro a flusso e analizzare 10.000 cellule gate da ciascun campione. Una procedura simile alle cellule di immagine legate a nanoparticelle fluorescenti utilizzando la microscopia confocale laser è descritta nel protocollo di testo. Per iniziare, indossare le cellule in fiasche T 75 a circa l'80% di confluenza, quindi sciacquare le cellule senza terreno con cinque millilitri di PBS.

Aggiungere cinque millilitri di BSA all'1% in PBS e bloccare le cellule per un'ora. Quindi aggiungere cinque millilitri di nanoparticelle rivestite di anticorpi da 0,5 milligrammi per millilitro al pallone e incubare le cellule per un'ora per consentire alle nanoparticelle di legarsi. Quindi, sciacquare le cellule tre volte con cinque millilitri di PBS per rimuovere le nanoparticelle non legate.

Quindi aggiungere due millilitri di soluzione di EDTA allo 0,25% di tripsina e incubare le cellule per cinque minuti per staccarle dal pallone. Aggiungere otto millilitri di DMEM per spegnere la tryina e quindi trasferire la sospensione cellulare in provette da centrifuga. Girali a 1000 volte G per cinque minuti per pellettare le cellule.

Successivamente, aspirare il supinato e risospendere le cellule in un millilitro di PBS. Aggiungere un millilitro di formaldeide al 10% in PBS per fissare le cellule e quindi trasferire 100 microlitri di ciascun campione in pozzetti separati di una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti. Aggiungere 100 microlitri di aros fuso all'1% in acqua deionizzata in ogni pozzetto e mescolare pipettando su e giù.

Lasciare solidificare il gel a quattro gradi Celsius per 12 ore per ottenere un fantasma. Dopo che il gel si è solidificato, posizionare il fantasma in un magnete clinico orizzontale a tre T accanto a un solido blocco cubo di 150 centimetri di agar al 2%. Quindi fissare il fantoccio e il blocco di agar all'interno del centro di una bobina cerebrale HD a otto canali per misurare i tempi di rilassamento, utilizzare fette coronali spesse 0,5 millimetri prelevate a metà altezza dei 96 saggi di diffusione dinamica della luce della piastra a 96 pozzetti sono stati utilizzati per determinare il diametro idrodinamico della stabilità delle nanoparticelle generate Gli studi hanno verificato che la stabilità a lungo termine delle nanoparticelle viene utilizzata sia in esperimenti basati sull'acqua che su mezzi cellulari.

La microscopia confocale laser ha mostrato nanoparticelle fluorescenti caricate con anticorpi per EOT 3 trovate specificamente sulla superficie delle cellule EOL uno. Quando vengono utilizzati anticorpi per un NG due, questi si legano specificamente alla superficie delle neurosfere BSG. Le nanoparticelle bio-funzionalizzate sono state in grado di etichettare con successo in modo fluorescente una popolazione di cellule bersaglio misurate mediante citometria a flusso.

Inoltre, le nanoparticelle sono state in grado di mirare a una specifica sottopopolazione di cellule in una miscela anche a bassa cellula bersaglio per controllare i rapporti cellulari. Infine, le nanoparticelle bio funzionalizzate hanno aumentato il contrasto MRI delle cellule bersaglio, cellule trattate con nanoparticelle caricate con un nng. Due anticorpi hanno mostrato iperintensità nelle sequenze pesate T uno rispetto alle cellule trattate con particelle di controllo.

Al contrario, le due nanoparticelle A NNG hanno conferito ipointensità nelle due sequenze pesate T rispetto alle particelle di controllo. Una volta padroni. La sintesi di nanoparticelle bio-funzionalizzate di blu di pressione può essere completata entro due giorni se eseguita correttamente.

Analogamente a questa procedura, le nanoparticelle possono essere bio-funzionalizzate con diversi biopolimeri e ligandi mirati per studiare nuove malattie e nuove condizioni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sintetizzare le nanoparticelle di blu di Prussia per applicazioni di fluorescenza e imaging per etichettare la popolazione di cellule. Non dimenticare di seguire rigorosamente le linee guida di sicurezza e le procedure operative standard per condurre gli studi nel magnete per risonanza magnetica clinica.