Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticelle per applicazioni di imaging multimodale molecolari

L'obiettivo generale di questa procedura è sintetizzare nanoparticelle di blu di Prussia biofunzionalizzate da utilizzare come agenti per imaging molecolare multimodale. Questo risultato si ottiene innanzitutto sintetizzando nanoparticelle di blu di Prussia contenenti ioni di gadolinio o manganese, che potenziano il segnale di risonanza magnetica (MRI). Il secondo passaggio consiste nell'aggiungere sulla superficie delle nanoparticelle un fluorocromo, conferendo così la capacità di imaging fluorescente.

Successivamente, le nanoparticelle rivestite con avadon vengono biofunzionalizzate con gli anticorpi biotinilati desiderati per il targeting cellulare. Un passaggio finale consiste nell'eseguire un controllo di qualità sulle nanoparticelle biofunzionalizzate misurandone la dimensione, il potenziale zeta e la stabilità temporale. Infine, le nanoparticelle biofunzionalizzate vengono utilizzate in applicazioni di imaging molecolare multimodale per visualizzare una specifica popolazione cellulare target all'interno di una miscela, mediante imaging fluorescente e risonanza magnetica (MRI).

Gli agenti di imaging attualmente disponibili in commercio sono tipicamente monomodali e offrono risoluzione solo a livello anatomico. Le nanoparticelle di blu di Prussia combinano due modalità di imaging complementari, risonanza magnetica (MRI) e fluorescenza, consentendo l'imaging molecolare e a livello subcellulare. Le applicazioni delle nanoparticelle multimodali si estendono alla diagnosi di tumori e malattie infiammatorie, oltre al monitoraggio della risposta ai trattamenti.

Questo perché le nanoparticelle biofunzionalizzate possono bersagliare e legarsi a una popolazione di cellule all'interno di una regione specifica del corpo. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni utili per la diagnosi del cancro e delle malattie infiammatorie e per la risposta al trattamento, può essere applicato anche ad altre condizioni patologiche che trarrebbero vantaggio dalla sensibilità e specificità dell'imaging molecolare. Utilizzando la fluorescenza e la risonanza magnetica, abbiamo avuto per la prima volta l'idea di produrre queste nanoparticelle quando abbiamo determinato che il blu di Prussia, un agente approvato dalla FDA per il consumo orale umano, poteva essere sintetizzato in modo stabile mediante uno schema di sintesi in un unico passaggio e biofunzionalizzato in modo robusto utilizzando tecniche standard di bioconjugazione.

Per iniziare, preparare una soluzione 5 millimolare di esacicanoferroato di potassio(II) in 5 millilitri di acqua deionizzata per ottenere la soluzione A. Successivamente, preparare la soluzione B contenente cloruro di ferro(III) 2,5 millimolare e cloruro di manganese(II) 2,5 millimolare in 10 millilitri di acqua deionizzata per la sintesi di nanoparticelle di blu di Prussia al manganese. Altre nanoparticelle possono essere sintetizzate come indicato nel protocollo del testo. Trasferire la soluzione B in un pallone a fondo tondo e agitare la soluzione a 1000 giri/min a temperatura ambiente.

Utilizzando una pompa peristaltica, aggiungere la soluzione A goccia a goccia nel recipiente a una velocità di 10 millilitri all'ora. Al termine dell'aggiunta della soluzione A, mescolare la miscela a 1000 giri al minuto per ulteriori 30 minuti. Successivamente, trasferire aliquote di un millilitro della miscela in provette da microcentrifuga e aggiungere 0,2 millilitri di cloruro di sodio 5 millimolare a ciascuna provetta.

Centrifugare i tubi a 20.000 ×g per almeno 10 minuti, quindi rimuovere con attenzione il sopranatante, lasciando il pellet di nanoparticelle. Successivamente, aggiungere un millilitro di acqua deionizzata a ciascun pellet. Utilizzare una micropunta per sospendere uniformemente le nanoparticelle in soluzione mediante sonificazione.

Lavare le nanoparticelle almeno altre tre volte per rimuovere i componenti della reazione iniziale dalla sospensione dopo l'ultima centrifugazione, risospendere le nanoparticelle in un millilitro di acqua deionizzata dopo averle rivestite con den fluorescente come descritto nel protocollo del testo, rimuovere le scorte di anticorpi biotinilati dal frigorifero. Qui, utilizzare l'antigene neurone-gliale due e l'anti-eotassina umana tre. Trasferire l'anticorpo biotinilato in un filtro microfuga in nylon da 0,2 micrometri e quindi centrifugare il tubo a 14.000 × g per 10 minuti.

Successivamente, aggiungere meno di o uguale a 0,05 milligrammi di anticorpo per ogni milligrammo di nanoparticelle rivestite con Aden e coprire le provette con carta d'alluminio per proteggerle dalla luce. Incubare le provette con agitazione delicata per due-quattro ore a quattro gradi Celsius. Dopo aver fissato gli anticorpi, aggiungere 10 microlitri di un campione di nanoparticelle da un milligrammo per millilitro a 990 microlitri di acqua deionizzata in una vete di plastica monouso, chiudere il tappo della vete e agitare per miscelare.

Quindi determinare la dimensione media delle nanoparticelle utilizzando un sistema di scattering dinamico della luce con un angolo di misura di 173 gradi. Iniziare preparando sospensioni da 10 millilitri di cellule in PBS a una concentrazione di circa 100.000 cellule per millilitro; per i tubi con colture miste, devono essere preparati diversi rapporti di ciascuna linea cellulare come descritto nel protocollo testuale. Aggiungere due millilitri di BSA al 5% a ciascun tubo per bloccare le cellule e ridurre al minimo il legame non specifico. Successivamente, aggiungere un millilitro di nanoparticelle biofunzionalizzate ad una concentrazione di un milligrammo per millilitro a ciascun tubo e incubare la miscela per un'ora.

Successivamente, rimuovere le nanoparticelle non legate lavando le cellule centrifugando i tubi a 1000 ×g per cinque minuti e risospendendo il pellet in un millilitro di PBS. Ripetere questo processo almeno altre due volte. Fissare le cellule utilizzando formaldeide al 10% in PBS, quindi aggiungere 10 microgrammi per millilitro di sette amino attinina e micina D in PBS per colorare le cellule, incubare il tubo sul ghiaccio per 30 minuti e successivamente lavare le cellule con PBS.

Successivamente, caricare il campione nel citometro a flusso e analizzare 10.000 cellule selezionate da ciascun campione. Una procedura simile per l'immagine di cellule legate a nanoparticelle fluorescenti mediante microscopia confocale a laser è descritta nel protocollo testuale. Per iniziare, coltivare le cellule in fiasche T75 fino a raggiungere una confluenza di circa l'80%, quindi rimuovere il mezzo lavando le cellule con cinque millilitri di PBS.

Aggiungere cinque millilitri di BSA al 1% in PBS e bloccare le cellule per un'ora. Quindi aggiungere cinque millilitri di nanoparticelle ricoperte di anticorpi a 0,5 milligrammi per millilitro al flacone e incubare le cellule per un'ora per consentire il legame delle nanoparticelle. Successivamente, risciacquare le cellule tre volte con cinque millilitri di PBS per rimuovere le nanoparticelle non legate.

Quindi aggiungere due millilitri di soluzione di tripsina-EDTA al 0,25% e incubare le cellule per cinque minuti per staccarle dal flask. Aggiungere otto millilitri di DMEM per bloccare l'azione della tripsina, quindi trasferire la sospensione cellulare in provette da centrifuga. Centrifugare a 1000 ×g per cinque minuti per formare il pellet cellulare.

Successivamente, aspirare il soprannatante e risospendere le cellule in un millilitro di PBS. Aggiungere un millilitro di formaldeide al 10% in PBS per fissare le cellule, quindi trasferire 100 microlitri di ogni campione in pozzi separati di una piastra a 96 pozzetti con fondo piatto. Aggiungere 100 microlitri di agarosio fuso all'1% in acqua deionizzata in ogni pozzetto e mescolare aspirando e dispensando con la pipetta.

Lasciare solidificare il gel a quattro gradi Celsius per 12 ore per ottenere un fantoccio. Dopo che il gel si è solidificato, posizionare il fantoccio accanto a un blocco solido cubico di agar al 2% di 150 centimetri all'interno di un magnete clinico orizzontale da tre T. Quindi fissare il fantoccio e il blocco di agar al centro di una bobina cerebrale HD a otto canali per misurare i tempi di rilassamento, utilizzando sezioni coronali di 0,5 millimetri di spessore prelevate a metà altezza della piastra a 96 pozzetti. Saggi di scattering dinamico della luce sono stati utilizzati per determinare il diametro idrodinamico delle nanoparticelle generate. Studi di stabilità hanno verificato la stabilità a lungo termine delle nanoparticelle, che vengono utilizzate sia in esperimenti basati su acqua sia in esperimenti basati su mezzi cellulari.

La microscopia laser confocale ha mostrato nanoparticelle fluorescenti caricate con anticorpi per EOT tre, localizzate specificamente sulla superficie delle cellule EOL uno. Quando vengono utilizzati anticorpi per NG due, questi si legano specificamente alla superficie delle neurosfere BSG. Le nanoparticelle biofunzionalizzate sono state in grado di etichettare con successo in modo fluorescente una popolazione di cellule bersaglio, come misurato mediante citometria a flusso.

Inoltre, le nanoparticelle sono state in grado di bersagliare una specifica sottopopolazione di cellule in una miscela, anche a basse proporzioni tra cellule bersaglio e cellule di controllo. Infine, le nanoparticelle biofunzionalizzate hanno aumentato il contrasto in risonanza magnetica delle cellule bersagliate, rispetto alle cellule trattate con nanoparticelle caricate con un nng. Due anticorpi hanno mostrato un'iperintensità nelle sequenze pesate in T1 rispetto alle cellule trattate con particelle di controllo.

Al contrario, le due nanoparticelle A NNG hanno conferito un'ipo intensità nelle sequenze pesate in T2 rispetto alle particelle di controllo. Una volta preparati. La sintesi di nanoparticelle di blu di prussiane biofunzionalizzate può essere completata entro due giorni, se eseguita correttamente.

In modo analogo a questo procedimento, le nanoparticelle possono essere biofunzionalizzate con diversi biopolimeri e ligandi mirati per studiare nuove malattie e nuove condizioni. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come sintetizzare nanoparticelle di blu di Prussia per applicazioni di fluorescenza e di imaging al fine di etichettare popolazioni di cellule. Non dimenticare di seguire rigorosamente le linee guida per la sicurezza e le procedure operative standard per condurre gli studi con il magnete MRI clinico.