I metodi per aumentare la sensibilità di High Resolution Melting polimorfismo a singolo nucleotide genotipizzazione a malaria

L'obiettivo generale del seguente esperimento di fusione ad alta risoluzione è quello di aumentare la sensibilità di rilevamento degli alleli mutanti presenti a basse concentrazioni con un singolo campione. Ciò si ottiene preparando prima il DNA estratto diluendo il modello ai volumi e alle concentrazioni necessarie. Il secondo passo consiste nel preparare i saggi con proporzioni asimmetriche del primer diretto e inverso per aumentare il prodotto della sonda modello.

Dopo aver preparato le reazioni, la temperatura di ricottura viene impostata tra le temperature di fusione della sonda quando è legata al tipo selvatico o al modello mutante. Il passaggio finale consiste nell'analizzare i prodotti amplificati sulla piattaforma HRM appropriata. In definitiva, il bias di amplificazione dell'allele mutante e la PCR asimmetrica basata su sonda consentono un rilevamento più sensibile della mutazione SNP impegnativa a basse concentrazioni presenti nei campioni.

Questa maggiore sensibilità è utile per la sorveglianza delle mutazioni nelle popolazioni. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la fusione standard ad alta risoluzione o la genotipizzazione tac man, è che consente una maggiore sensibilità per gli alleli presenti a basse concentrazioni e consente anche la genotipizzazione di SNP situati prossimalmente l'uno all'altro nel genoma. Tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sulla diffusione della resistenza ai farmaci nel parassita della malaria.

Può anche essere applicato ad altri sistemi, come la sorveglianza di altri tipi di malattie infettive come l'HIV o il rilevamento di rare varianti tumorali in una popolazione di cellule. A dimostrare la procedura sarà Caitlin Durphy. Un tecnico del nostro laboratorio.

I modelli per la fusione ad alta risoluzione o HRM sono preparati da campioni di plasmodium falciparum ottenuti direttamente dal sangue di pazienti che partecipano a studi sul campo. I campioni possono essere conservati su carta da filtro, su test di rilevamento rapido o come campioni di globuli rossi pellettati possono anche essere adattati alla coltura per crescere in vitro. Alcuni ceppi di laboratorio standard per l'analisi possono essere ordinati presso il centro di ricerca sulla malaria e i campioni di reagenti di riferimento possono essere estratti da sangue intero, globuli rossi o carta da filtro, oppure utilizzati direttamente da globuli rossi pellettati o colture per l'amplificazione diretta da globuli rossi pellettati.

Per prima cosa determinare il para dei globuli rossi utilizzando la microscopia a striscio sottile seguendo la procedura dei Centers for Disease Control and Prevention. I globuli rossi con para superiori allo 0,5% vengono quindi diluiti da uno a 400. Nella TE verranno utilizzati tre microlitri di globuli rossi diluiti per ogni reazione da 5 a 10 microlitri dovuta a una variabilità compresa tra una variabilità, i controlli positivi e negativi devono sempre essere inclusi nelle analisi HRM.

Preparare da 10 picogrammi a 10 nanogrammi per un microlitro di diluizioni di plasmidi o standard con genotipi snip verificati in sequenza come troll positivi. Utilizzare l'acqua di grado PCR come controllo negativo senza modello per le reazioni di amplificazione. Iniziare questa procedura preparando 10 scorte di lavoro degli inneschi e delle sonde.

Lo stesso protocollo è applicabile ai saggi che utilizzano piastre a 96 pozzetti, piastre a 384 pozzetti, otto strisce di provette o capillari di vetro. Ma ai fini di questa dimostrazione, verranno utilizzate solo piastre a 96 pozzetti e capillari di vetro. Questa tabella mostra le concentrazioni raccomandate di 10 volte il materiale di lavoro e le concentrazioni finali per la genotipizzazione HRM basata su sonda bloccata.

Preparare miscele di reazione per ciascuno. Aggiungere un microlitro di ciascuno dei 10 inneschi e sonde in avanti e all'indietro. Da quattro a cinque microlitri di master HRM, miscelano un microlitro di dima e acqua di grado PCR per un volume di reazione totale di 10 microlitri.

Fai lo stesso per ogni capillare di vetro. Coprire le piastre e i capillari di vetro. Utilizzare guarnizioni ottiche per piastre per l'amplificazione basata su piastre e tappi in plastica per sistemi basati su capillari.

Assicurati che la copertura sia completa e che le piastre e i tappi siano completamente sigillati e fissati per evitare l'evaporazione. Durante l'amplificazione. Centrifugare i campioni per rimuovere le bolle d'aria.

Centrifugare le piastre in una centrifuga da tavolo per tre minuti a 1, 800 volte G.Far girare i capillari di vetro in un pico fuge per 10-15 secondi. Posizionare la piastra di reazione e i capillari in vetro in un termociclatore con sonda bloccata standard o protocolli di amplificazione MAAB. Dopo l'amplificazione della PCR, procedere all'analisi di fusione dall'interfaccia software del sistema.

Fondere la piastra da 40 gradi Celsius a 80 gradi Celsius per produrre picchi di fusione sia della sonda che dell'amplicone. Il primo passo dell'analisi della fusione sul light cycler four 80 è la normalizzazione dalla derivata negativa della fluorescenza normalizzata rispetto alla vista della temperatura. Spostare le barre di normalizzazione per circondare la regione di fusione della sonda.

La regione di fusione della sonda è la temperatura più bassa delle due regioni di fusione. Le barre di normalizzazione dovrebbero essere alla base dei picchi di fusione. Dopo la normalizzazione, selezionare Calcola gruppi per assegnare automaticamente i campioni ai gruppi, se necessario, riassegnare manualmente i campioni a gruppi specifici.

Selezionare campioni che non si sono amplificati o che presentano picchi di fusione frastagliati. Quindi vai su nuova chiamata e seleziona negativo. Dopo aver selezionato i campioni errati rimanenti, passare a una nuova chiamata, selezionare il raggruppamento appropriato e fare clic su Applica modifica Assegna genotipi per ciascun gruppo in base agli standard.

Dopo aver verificato che i gruppi calcolati siano corretti, selezionare Modifica nomi gruppi nella scheda Raggruppamento. Immettere i genotipi degli standard nella casella colorata corrispondente. Ad esempio, se il 3D 7 standard ha un genotipo C noto ed è nel gruppo uno, tutti i campioni nel gruppo uno hanno risultati di stampa del genotipo C e i genotipi vengono visualizzati accanto ai campioni.

Infine, esporta i risultati come file TXT A per un'ulteriore analisi della popolazione campione. Al termine della corsa sul light cycler 2.0, registrare i nomi e le posizioni dei campioni sotto i dati del campione Prima di iniziare l'analisi, etichettare i controlli negativi e i genotipi degli standard di fusione. Inizia l'analisi del fuso selezionando l'analisi, scegliendo la genotipizzazione nell'analisi della curva di fusione e la pressatura. Ok.

Per aumentare la sensibilità del raggruppamento automatico, selezionare tutti i campioni in modo che la visualizzazione nelle curve di fusione venga tracciata. Far scorrere la barra di normalizzazione fino al limite superiore dei picchi di fusione della sonda. Verificare che i campioni siano stati raggruppati correttamente selezionando singolarmente ciascun gruppo sotto il nome del gruppo.

Esporta i genotipi per ogni campione selezionando tutti i campioni, copiando i dati e incollandoli in un foglio di lavoro. Il grafico della derivata negativa della fluorescenza normalizzata rispetto alla temperatura è in genere il modo più semplice per visualizzare i picchi di fusione e determinare i genotipi. L'impostazione della finestra di analisi su una sola regione della sonda comporta una chiara differenziazione dei picchi corrispondenti a specifici SNP.

Le corrispondenze perfette determinano picchi di fusione più elevati indicati in rosso. Mentre i disallineamenti SNP hanno temperature di fusione più basse indicate in grigio quando entrambi gli alleli sono presenti in un campione. L'analisi HRM basata su Prob rappresenta entrambi gli alleli come due curve di picco mostrate in arancione con picchi che corrispondono a singoli campioni di alleli mostrati in rosso e grigio, riducendo progressivamente la temperatura di Ealing durante l'amplificazione si ottiene una distorsione verso l'allele mutante rappresentato dal picco sul lato sinistro in un campione poligenomico o poliallelico.

Questo bias di amplificazione dell'allele mutante si traduce in sensibilità HRM per rilevare alleli minori presenti a meno dell'1% in campioni poligenomici o poliallelici. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la qualità del campione è fondamentale. Piccole differenze nelle concentrazioni dei tamponi possono spostare le curve HRM.

L'utilizzo dei controlli è un modo utile per standardizzare i risultati. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la PCR asimmetrica basata su prob e il bias di amplificazione dell'allele mutante per genotipizzare in modo accurato e sensibile gli SNP della malaria da una varietà di tipi di campioni.