Name: Rapido ed efficiente Zebrafish genotipizzazione Uso PCR con ad alta risoluzione Melt Analysis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-05T17:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Impara la genotipizzazione rapida di Danio rerio con PCR e HRMA. Questo metodo efficiente rileva mutazioni e transgeni con alta sensibilità, accelerando lo screening genetico in biologia dello sviluppo.

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Ringraziamo i membri delle Blaschke, Grunwald, e Wittwer laboratori per consulenza e assistenza tecnica. Questo lavoro è supportato dalla Fondazione PCMC, NIH R01 MH092256 e DP2 MH100008, e la March of Dimes Foundation assegno di ricerca # 1-FY13-425, a JLB.

1. Preparazione del DNA <ol><li> Preparare DNA tampone di lisi: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,3% Tween 20, 0,3% NP40. Aggiungi fresco proteinasi K a una concentrazione finale di 1 mg / ml il giorno di utilizzo 12. </li><li> Collezione Tessuto: <ol><li> Per l&#39;adulto clip di pinna di pesce: <ol><li> Anestetizzare il pesce: Mettere il pesce in 0,004% MS-222 la soluzione (tricaine). Attendere fino a quando il movimento branchia rallenta. </li><li> Mettere pesce su una pila di 5-10 Kimwipes e tagliare un piccolo pezzo di pinna caudale, circa 2-3 mm, con una lama di rasoio sterile. </li><li> Introdurre rapidamente il pesce in un serbatoio etichettato con acqua dolce per recupero; etichettare accuratamente sia il serbatoio e tubo corrispondente che conterrà la clip pinna. Cambiare l&#39;acqua e alimentare il pesce ogni altro giorno. </li><li> Sollevare la clip pinna con un puntale sterile e trasferirlo in un tubo riempito con 100 microlitri di buffer di lisi del DNA. </li><li> Gettare la punta della pipetta, e scartare il lametta in un apposito contenitore. </li></ol></li><li> Per la clip di embrione di coda: <ol><li> Mettere gli embrioni in 0,004% MS-222 la soluzione (tricaine). Attendere 2 min. </li><li> Tagliare un pezzo di coda con una pinza sotto un microscopio da dissezione. </li><li> Mettere la coda in una provetta riempita con 30 microlitri DNA tampone di lisi. </li><li> Mettere rapidamente l&#39;embrione in un tubo contenente 100 ml paraformaldeide al 4%. </li><li> Etichettare le provette con embrioni e dei loro tubi di coda corrispondenti. </li><li> Conservare le provette con embrioni a 4 ° C durante la notte per il fissaggio. </li><li> Pulire le pinze con acqua Milli-Q e Kimwipes tra ogni embrione per minimizzare la contaminazione. </li></ol></li><li> Per gli embrioni interi: <ol><li> Mettere gli embrioni in 0,004% MS-222 la soluzione (tricaine). Attendere 2 min. </li><li> Mettere 1-5 embrioni in un tubo riempito con 100 microlitri di tampone di lisi DNA. Dechorionation non è necessario. </li></ol></li></ol></li><li> Digestione DNA Incubare le provette con il tessuto (o pinna di coda clip o embrioni) a 55 ° Cper 4 ore fino a tutta la notte 12. </li><li> Inattivare il proteinasi K Tubi di calore a 95 ° C per 15 min 12. DNA deve essere usato per la PCR immediatamente o conservato a -20 ° C per 3 mesi. </li></ol> 2. PCR <ol><li> Primer design manualmente o mediante iniettore software di progettazione (es. Lightscanner Primer Design Software-Biofire). I prodotti di PCR per HRMA sono di solito 50-200 bp; prodotti di PCR per il rilevamento SNP dovrebbero essere più piccole, tipicamente 50-80 bp. </li><li> PCR <ol><li> Eseguire reazione di PCR in una piastra a 96 pozzetti o 384 pozzetti. </li><li> Utilizza 10 microlitri volume totale: 4 microlitri master mix LightScanner (0,1 U hot-start Taq-AB polimerasi, tampone, 0.2 dNTP mm, 2 mm cloruro di magnesio, e 1x fluorescente DNA-binding dye a doppio filamento); 5 pmol ciascun primer, e 1 ml modello di DNA genomico estratto da pinna caudale adulti o 3 ml di DNA genomico da coda embrionale 13. </li><li> Campioni Coprire con 30 ml di olio minerale. </li&gt; <li> Coprire la piastra con un sigillo adesivo otticamente trasparente. </li><li> Ottimizzare PCR-ciclismo condizioni tipiche condizioni sono 95 ° C per 5 minuti e 30 cicli di 10 secondi a 95 ° C, 25 sec a 60 ° C, 30 sec a 72 ° C, che termina con 95 ° C per 30 sec e raffreddati a 15 ° C. </li><li> Conservare le piastre PCR a 4 ° C o direttamente continuano a HRMA. </li><li> Confermare il prodotto di PCR mediante analisi della sua dimensione mediante elettroforesi su gel di agarosio durante l&#39;ottimizzazione iniziale di PCR, e se indicato, mediante sequenziamento del prodotto PCR. </li></ol></li></ol> 3. HRMA <ol><li> Piastre di calore <ol><li> Posizionare la piastra in un sistema di analisi melt. </li><li> Aprire il software (LightScanner Software Call-IT 2.0). </li><li> Piastre di calore 60-95 ° C. </li><li> Creare un nuovo file di archiviazione dei dati. </li></ol></li><li> Analizzare i dati HRMA (Figura 2). Più passaggi di analisi sono possibili. Mostriamo il set più comunemente usato di dati manipulations. <ol><li> Impostazione sottoinsieme Fare clic sulla scheda sottoinsiemi. Selezionare i pozzetti con i campioni. </li><li> Normalizzazione <ol><li> Selezionare la scheda Normalize nel pannello di sinistra. Per eliminare la fluorescenza varianza, posizionare manualmente la doppia linea parallela in pre-(iniziale) e le regioni posto (finale)-fusione come illustrato (Figura 2C, punte di freccia) e normalizzare prefusione e fluorescenza post-fusione segnali di tutti i campioni a 1 e 0 rispettivamente 14. </li><li> Regolare il posizionamento delle linee in modo che la regione di fusione è nella regione tra le linee pre-e post-fusione, ma non selezionato. In generale, la Bassa Min e Max Inferiore (e Alto Min e Max Superiore) le linee di temperatura devono essere posizionati a circa 1 ° C a parte. </li><li> Scegliere posizioni di temperatura per la normalizzazione tale che tutti i campioni hanno (100%) fluorescenza massima o totale per la regione Premelt e minimo o nullo (0%) fluorescenza per la regione post-fusione (come meglio posbile). Normalizzazione dovrebbe comportare una linea quasi orizzontale nella fluorescenza massimo 1 che si estende fino al punto di fusione e poi una linea quasi orizzontale dal punto di fusione alla fluorescenza minimo di 0, non ci dovrebbe essere livelli di fluorescenza 1 o minori di 0 . Per esempio, nella Figura 2C, normalizzare le curve prefusione utilizzando intervalli di temperatura di 79-80 ° C. </li></ol></li><li> Raggruppamento / Clustering Distinguere genotipi in base alla loro temperatura di fusione (Figura 2C, scatola verde). Selezionare Raggruppamento. <ol><li> Selezionare Autogroup dall&#39;elenco di selezione Standards sotto la sezione Raggruppamento. </li><li> Selezionare Normale o Alta per la fusione dei profili con i singoli passaggi o più transizioni rispettivamente dalla lista di selezione di sensibilità nella sezione Raggruppamento. </li><li> Seleziona ComputeGruppi nella sezione Raggruppamento. </li><li> Vai al menu File e fare clic su Salva per salvare i risultati. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li>
<li>Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev. Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li>
<li>Sander, J. D., Cade, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+disruption+in+somatic+zebrafish+cells+using+engineered+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.</a> Nat. Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).</li>
<li>Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+gene+targeting+in+zebrafish+using+customized+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs.</a> Nat. Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).</li>
<li>Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+melting+analysis+%28HRMA%29%3A+more+than+just+sequence+variant+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mutation%22%5BJournal%5D)">High-resolution melting analysis (HRMA): more than just sequence variant screening.</a> Hum. Mutation. 30 (6), 860-866 (2009).</li>
<li>Dahlem, T. J., Hoshijima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+methods+for+generating+and+detecting+locus-specific+mutations+induced+with+TALENs+in+the+zebrafish+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome.</a> PLoS Genet. 8 (8), (2012).</li>
<li>Liew, M., Pryor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+of+single-nucleotide+polymorphisms+by+high-resolution+melting+of+small+amplicons%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons.</a> Clin. Chem. 50 (7), 1156-1164 (2004).</li>
<li>Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Bromley, L. K., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V+Amplicon+DNA+melting+analysis+for+mutation+scanning+and+genotyping%3A+cross-platform+comparison+of+instruments+and+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">V Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes.</a> Clin. Chem. 52 (3), 494-503 (2006).</li>
<li>Carrillo, J., Martínez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melting+analysis+for+the+identification+of+novel+mutations+in+DKC1+and+TERT+genes+in+patients+with+dyskeratosis+congenita%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cell.+Mol.+Dis.%22%5BJournal%5D)">High resolution melting analysis for the identification of novel mutations in DKC1 and TERT genes in patients with dyskeratosis congenita.</a> Blood Cell. Mol. Dis.. 49 (3-4), 140-146 (2012).</li>
<li>Thomsen, N., Ali, R. G., Ahmed, J. N., Arkell, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melt+analysis+%28HRMA%29%3B+a+viable+alternative+to+agarose+gel+electrophoresis+for+mouse+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High resolution melt analysis (HRMA); a viable alternative to agarose gel electrophoresis for mouse genotyping.</a> PloS one. 7 (9), (2012).</li>
<li>Vorkas, P. A., Poumpouridou, N., Agelaki, S., Kroupis, C., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIK3CA+hotspot+mutation+scanning+by+a+novel+and+highly+sensitive+high-resolution+small+amplicon+melting+analysis+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">PIK3CA hotspot mutation scanning by a novel and highly sensitive high-resolution small amplicon melting analysis method.</a> J. Mol. Diagn. 12 (5), 697-704 (2010).</li>
<li>Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+of+genotyping+zebrafish+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants.</a> Dev. Dyn. 238 (12), 3168-3174 (2009).</li>
<li>Xing, L., Hoshijima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+foxP2+zinc+finger+nuclease+mutant+has+normal+axon+pathfinding%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Zebrafish foxP2 zinc finger nuclease mutant has normal axon pathfinding.</a> PloS one. 7 (8), (2012).</li>
<li>Raghavendra, A., Siji, A., Sridhar, T. S., Phadke, K., Vasudevan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+High+Resolution+Melting+analysis+as+an+alternate+tool+to+screen+for+risk+alleles+associated+with+small+kidneys+in+Indian+newborns%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of High Resolution Melting analysis as an alternate tool to screen for risk alleles associated with small kidneys in Indian newborns.</a> BMC Nephrol. 12 (1), 60 (2011).</li>
<li>Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V+Expanded+instrument+comparison+of+amplicon+DNA+melting+analysis+for+mutation+scanning+and+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">V Expanded instrument comparison of amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping.</a> Clin. Chem. 53 (8), 1544-1548 (2007).</li>
<li>Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Genotyping+by+Amplicon+Melting+Analysis+Using+LCGreen%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen.</a> Clin. Chem. 49 (6), 853-860 (2003).</li>
<li>Dimitrakopoulos, L., Vorkas, P. A., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+closed-tube+methylation-sensitive+high+resolution+melting+assay+%28MS-HRMA%29+for+the+semi-quantitative+determination+of+CST6+promoter+methylation+in+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">A closed-tube methylation-sensitive high resolution melting assay (MS-HRMA) for the semi-quantitative determination of CST6 promoter methylation in clinical samples.</a> BMC Cancer. 12, 486-48 (2012).</li>
<li>Jeng, K., Gaydos, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+two+broad-range+PCR+assays+for+pathogen+detection+in+positive-blood-culture+bottles%3A+PCR-high-resolution+melting+analysis+versus+PCR-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of two broad-range PCR assays for pathogen detection in positive-blood-culture bottles: PCR-high-resolution melting analysis versus PCR-mass spectrometry.</a> J. Clin. Microbiol. 50 (10), 3287-3292 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

PCR combinata con HRMA è una potente tecnologia per la genotipizzazione zebrafish. I vantaggi di questo approccio sono la velocità, robustezza e sensibilità per rilevare anche mutazioni puntiformi. L&#39;intero protocollo, dalla pinna-clip analisi per fondere curva, può essere eseguito in meno di otto ore da un singolo individuo. Inoltre, la tecnica è suscettibile di screening ad alto rendimento, non richiede l&#39;uso di bromuro di etidio, ed è sigillato per tutta PCR e fasi di analisi che aiuta a ridurre i problemi di...

Zebrafish (Danio rerio) è un sistema modello vertebrato ampiamente usato per studi di sviluppo e modellazione della malattia. Recentemente, numerose tecnologie transgeniche e mutazione sono stati sviluppati per zebrafish. Tecniche di transgenesi rapida, di solito basati su un sistema di trasposoni Tol2 1, sono stati combinati con le opzioni di clonazione migliorate per aerei frammento di DNA di montaggio 2. Nucleasi zinc-finger (ZFNs) e trascrizione nucleasi effettrici attivatore-like (Talens) sono stati utilizzati per indirizzare loci in entrambe le cellule somatiche e germinali in zebrafish 3,4. Queste tecniche possono efficacemente generare animali geneticamente modificati, con la creazione mutazione ad alta frequenza e la trasmissione germinale 3,4. Nonostante questi progressi, tecniche di genotipizzazione tradizionali in zebrafish limitano tutta la potenza degli strumenti di mutagenesi e transgenesi. PCR seguita da elettroforesi su gel, a volte combinati con RESTRIZIONn digestione enzimatica, è ampiamente utilizzato per rilevare modifiche genoma, ma richiede tempo e meno sensibile per identificare piccole inserzioni o delezioni. Saggi sonda TaqMan hanno elevati costi iniziali e richiedono un&#39;attenta ottimizzazione. Sequenziamento dei prodotti di PCR può richiede parecchi giorni e non è pratico per lo screening su larga scala. Frammento di restrizione polimorfismo della lunghezza (RFLP) analisi può discriminare solo SNPs che colpiscono un numero limitato di siti di riconoscimento degli enzimi di restrizione. Ad alta risoluzione fusione analisi (HRMA), un post-PCR metodo di analisi chiuso tubo, è un metodo sviluppato di recente che è rapida, sensibile, poco costoso, e suscettibili di screening di un gran numero di campioni. HRMA può essere utilizzato per rilevare SNP, mutazioni, e transgeni 5-7. HRMA è basato su denaturazione termica di DNA a doppio filamento, e ogni amplicone PCR ha un unico dissociazione (melt) caratteristica 5. I campioni possono essere discriminati a causa to la loro diversa composizione nucleotidica, contenuto di GC, o lunghezza, tipicamente in combinazione con un colorante fluorescente che si lega solo a doppio filamento di DNA 8. Così, HRMA può distinguere diversi genotipi in base alle diverse caratteristiche melt-curva. Poiché HRMA utilizza reagenti economici ed è un passo singolo processo di post-PCR, può essere utilizzato per strategie ad alto rendimento. HRMA è non distruttiva, così in seguito all&#39;analisi gli ampliconi della PCR possono essere utilizzati per altre applicazioni. HRMA è stato applicato in molti organismi e sistemi, inclusi linee cellulari, topi e nell&#39;uomo 9-11. Il suo uso è stato recentemente descritto in zebrafish per rilevare le mutazioni indotte da nucleasi dito di zinco (ZFNs) e Talens 6,12,13. In questo articolo, descriviamo come eseguire HRMA PCR-based in zebrafish embrionali e adulte (Figura 1). Questo protocollo è adatto per rivelare SNP, transgeni, e mutazioni, comprese SINGLE modifiche base-pair, inserimenti o eliminazioni.

<table><tbody><tr><td>100 Reaction LightScanner Master Mix</td><td>BioFire</td><td>HRLS-ASY-0002</td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>PCR a guscio rigido Piastre BLK/WHT a 96 pozzetti</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>HSP9665</td><td>www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>Microseal 'B' Guarnizioni adesive</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>MSB1001 www.bio-rad.com</td><td></td></tr><tr><td>Strumento LightScanner a 96 pozzetti</td><td>BioFire</td><td>LSCN-ASY-0040</td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>Software LightScanner con Call-IT 2.0</td><td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>Analisi di fusione ad alta risoluzione 2.0</td><td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>LightScanner Software di progettazione Primer</td> Software <td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>Vector NTI</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>www.invitrogen.com</td></tr><tr><td>Tricaina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rapido ed efficiente zebrafish genotipizzazione uso pcr con ad alta risoluzione melt analysis

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish è un potente sistema modello vertebrato per studiare lo sviluppo, la modellazione della malattia, e l&#39;esecuzione di screening di stupefacenti. Recentemente una varietà di strumenti genetici sono state introdotte, tra cui più strategie per indurre mutazioni e la generazione di linee transgeniche. Tuttavia, lo screening su larga scala è limitato con metodi tradizionali di genotipizzazione, che sono termini di tempo e di manodopera. Qui si descrive una tecnica per analizzare i genotipi di zebrafish per PCR combinato con alta risoluzione fusione di analisi (HRMA). Questo approccio è rapido, sensibile e poco costoso, con un minor rischio di artefatti contaminazione. Genotipizzazione mediante PCR con HRMA può essere utilizzato per gli embrioni o pesci adulti, anche nei protocolli di screening high-throughput.

Il protocollo può essere eseguita durante un singolo giorno o separato in fasi di diversi giorni (diagramma di flusso di lavoro è mostrata in Figura 1). Estrazione del DNA è seguita dalla fusione e analisi di ampliconi PCR. Le temperature per la fusione del amplicone dipendono dalle dimensioni e GC-contenuti, ma iniziano in genere e temperature finali di 50 ˚ C e 95 ˚ C siano appropriate (Figure 2A e 2B). Una volta eseguita la fusione, analisi delle curve di fluorescenz...

PCR combinata con alta risoluzione melt analisi (HRMA) è dimostrato come un metodo rapido ed efficace al genotipo zebrafish.

Rapido ed efficiente Zebrafish genotipizzazione Uso PCR con ad alta risoluzione Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di effettuare rapidamente lo screening di diversi genotipi, mutazioni o transgeni nel pesce zebra. Questo viene ottenuto innanzitutto estraendo il DNA da piccoli prelievi e successivamente amplificando il DNA mediante PCR. Il passaggio successivo consiste nel denaturare gli ampliconi della PCR registrando nel contempo le curve di fusione, che vengono analizzate da un software.Infine, i risultati mostrano curve di fusione distinguibili per i diversi genotipi. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'elettroforesi su gel dopo PCR volumetrica è la sua sensibilità alle variazioni di singoli nucleotidi, alle piccole inserzioni e alle delezioni; inoltre, questa tecnica è rapida e affidabile. Sebbene possa essere utilizzata per genotipizzare rapidamente ed efficacemente il pesce zebra, la tecnica può essere applicata anche ad altri sistemi e organismi modello, inclusi lignaggi cellulari, topi e altri animali.Nel giorno della preparazione del DNA, aggiungere proteina K fresca al buffer di lisi alla concentrazione di un milligrammo per millilitro. Il tessuto può essere prelevato da un pesce adulto mediante un piccolo prelievo o da un pesce embrionale. Prima anestetizzare il pesce in soluzione Trica.Attendere finché i movimenti delle branchie rallentano. Quindi posizionare il pesce su un mucchio di fazzoletti e, con una lametta sterile, tagliare una piccola porzione della pinna caudale lunga circa due-tre millimetri. Rimettere rapidamente il pesce in un contenitore etichettato con acqua fresca per il recupero.Prelevare il frammento di pinna con una punta di pipetta sterile e trasferirlo in un tubo contenente 100 microlitri di tampone di lisi per il DNA. Assicurarsi di etichettare sia il serbatoio dell'animale sia il tubo, quindi incubare tutti i tessuti raccolti per almeno quattro ore fino a tutta la notte a 55 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, inattivare la proteina ACE K riscaldando i tubi a 95 gradi Celsius per 15 minuti.Questi campioni devono essere utilizzati immediatamente per la PCR, ma possono anche essere conservati a meno 20 gradi Celsius per un periodo massimo di tre mesi. Eseguire la PCR in una piastra da 96 o 384 pozzetti per ogni reazione. Combinare non più di un microlitro di DNA adulto con quattro microlitri di light scanner.Mix master contenente la sonda fluorescente e i primer a una concentrazione finale di cinque pico moli ciascuno. Se il DNA proviene da un embrione, utilizzare fino a tre microlitri. Ricoprire le reazioni con 30 microlitri di olio minerale e quindi chiuderle con il cappuccio.Successivamente, coprire la piastra PCR caricata con un sigillo adesivo otticamente trasparente. Ora ottimizzare le condizioni di termociclaggio. Un set tipico di condizioni inizia con cinque minuti di tempo di denaturazione.Seguire con 30 cicli di PCR con fusioni di dieci secondi, un tempo di annealing di 25 secondi e un allungamento di 30 secondi. La reazione deve terminare con una fusione aggiuntiva di 32° ciclo e quindi raffreddarsi a 15 gradi Celsius. Analizzare la piastra PCR posizionandola in un sistema di analisi di fusione nel software.Impostare la temperatura e creare un nuovo file di archiviazione dati. Impostare un sottoinsieme. Selezionare le pozzette con i campioni nell'angolo inferiore sinistro dello schermo.Selezionare la scheda normalizzata per eliminare le varianti fluorescenti. Posizionare manualmente la doppia linea parallela nelle regioni pre-fusione, fusione e post-fusione e normalizzare i segnali fluorescenti pre-fusione e post-fusione di tutti i campioni rispettivamente a uno e a zero. Successivamente, distinguere i genotipi in base alla loro temperatura di fusione selezionando innanzitutto il raggruppamento.Quindi selezionare "raggruppamento automatico" dall'elenco di selezione standard. Nella sezione di raggruppamento, selezionare "normale" o "alta" per i profili di fusione con transizioni singole o multiple, rispettivamente. Queste opzioni si trovano nell'elenco di selezione della sensibilit&agrave; all'interno della sezione di raggruppamento.Ora selezionare i gruppi di calcolo nella sezione di raggruppamento, quindi andare al menu file e fare clic su salva per salvare i risultati. Il protocollo può essere eseguito in un singolo giorno oppure suddiviso in passaggi su più giorni. Durante l'esecuzione della PCR, le temperature di denaturazione dell'amplicone dipendono dalle dimensioni e dal contenuto di GC, ma in genere temperature iniziali e finali di 60 gradi Celsius e 95 gradi Celsius sono appropriate una volta effettuata la denaturazione.L'analisi delle curve di fusione fluorescenti richiede tipicamente la normalizzazione della variazione delle diverse curve campione utilizzando le regioni prima e dopo la fusione come riferimenti. Questo migliora il confronto dei risultati provenienti da campioni diversi, in cui la variazione della fluorescenza è legata a piccole variazioni sperimentali. Ogni coppia di linee di temperatura per la normalizzazione dovrebbe essere posizionata ad una distanza di circa un grado Celsius.I dati possono essere rappresentati in due modi: tramite un grafico che mostra i profili delle curve di denaturazione, oppure tramite un grafico che mostra un tracciato differenziale sottrattivo in confronto a un campione di riferimento dopo l'analisi HRMA; in questo modo è possibile rilevare mutazioni o transgeni. Due mutazioni diverse nel gene EIF two B five sono indicate dalle curve rossa e blu. Questi campioni mutati vengono identificati sulla base della differenza significativa nei loro profili di curva di denaturazione, nella forma delle curve o nella variazione della fluorescenza rispetto alle curve standard del tipo selvatico.Questo esempio di quattro diversi genotipi in un singolo campione di embrioni illustra la potenza e la sensibilità del metodo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di otto ore. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire l'HRMA per lo screening su larga scala dei genotipi di zebrafish.

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Biologia

Questo articolo descrive l'estrazione del DNA dalla clip della coda del pesce zebra. Il protocollo dimostra un metodo rapido ed efficiente per analizzare i genotipi del pesce zebra.

Estrazione del DNA dalla clip della coda: un metodo utilizzato nella genotipizzazione del pesce zebra

In questo video, descriviamo una tecnica di PCR di fusione ad alta risoluzione per determinare il polimorfismo di lunghezza di frammenti di DNA di varie lunghezze di sequenza, in base all'analisi della temperatura di fusione.

PCR di fusione ad alta risoluzione per determinare le variazioni di sequenza nelle sequenze di DNA mutanti

Mentre l'analisi alta risoluzione fusione offre la capacità di distinguere tra polimorfismi a singolo nucleotide in una popolazione eterogenea, allele mutante pregiudizi amplificazione può aumentare la sua capacità di individuare alleli presenti a relativamente basse percentuali all'interno di un campione. Questo protocollo descrive miglioramenti che migliorano la sensibilità dell'analisi fusione alta risoluzione.

I metodi per aumentare la sensibilità di High Resolution Melting polimorfismo a singolo nucleotide genotipizzazione a malaria

La tecnica qui descritta genotipizzazione, che accoppia fluorescente reazione a catena della polimerasi (PCR) per elettroforesi su gel capillare, permette high-throughput genotipizzazione di cloni knockout nucleasi-mediata. Elude limitazioni incontrate da altre tecniche di genotipizzazione ed è più conveniente rispetto ai metodi di sequenziamento.

Usando una tecnica fluorescente PCR-capillare elettroforesi su gel al genotipo CRISPR / Cas9 mediata Knockout Mutants in un formato high-throughput

L'editing genomico mirato nel sistema modello Danio rerio (pesce zebra) notevolmente è stata facilitata dall'emergere di approcci basati su CRISPR. Qui, descriviamo un protocollo semplificato, robusto per la generazione e l'identificazione degli alleli di assurdità CRISPR-derivato che incorpora l'analisi di mobilità dell'eteroduplex e identificazione delle mutazioni mediante sequenziamento di nuova generazione.

Produzione efficiente e identificazione di CRISPR/Cas9-generato Gene Ko nel sistema modello Danio rerio

Zebrafish recentemente sono stati utilizzati come un sistema di modello in vivo per studiare il tempo di replicazione del DNA durante lo sviluppo. Qui è dettagliato i protocolli per l'utilizzo di embrioni di zebrafish per tempo di replicazione di profilo. Questo protocollo può essere facilmente adattato per studiare il tempo di replicazione in mutanti, tipi di cellule individuali, modelli di malattia e altre specie.

Tempo di replicazione del DNA utilizzando Zebrafish come un sistema di modello In Vivo di profilatura

Zebrafish sono stati usati come organismi modello genetico affidabile nella ricerca biomedica, soprattutto con l'avvento delle tecnologie di modifica del gene. Quando sono previsti fenotipi larvali, identificazione di estrazione ed il genotipo di DNA può essere impegnativo. Qui, descriviamo una procedura efficiente genotipizzazione per larve di zebrafish, coda di ritaglio, più presto 72 h post-fertilizzazione.

Estrazione del DNA high-throughput e genotipizzazione delle larve di Zebrafish 3dpf di pinna Clipping

Le tecnologie di editing genico hanno permesso ai ricercatori di generare mutanti di pesci zebra per studiare la funzione genica con relativa facilità. Qui, forniamo una guida per eseguire la genotipizzazione embrionale parallela e la quantificazione dei segnali di ibridazione in situ nel pesce zebra. Questo approccio imparziale fornisce una maggiore precisione nelle analisi fenotipiche basate sull'ibridazione in situ.

Genotipizzazione e quantificazione della colorazione dell'ibridazione in situ nel pesce zebra

La rigenerazione del muscolo scheletrico è guidata dalle cellule staminali muscolari residenti nei tessuti, che sono compromesse in molte malattie muscolari come la distrofia muscolare, e questo si traduce nell'incapacità del muscolo di rigenerarsi. Qui, descriviamo un protocollo che consente l'esame della rigenerazione muscolare in modelli di zebrafish di malattia muscolare.

Esame della rigenerazione muscolare nei modelli zebrafish di malattia muscolare

Le tecnologie CRISPR-Cas hanno rivoluzionato il campo dell'editing del genoma. Tuttavia, trovare e isolare la modifica della linea germinale desiderata rimane un importante collo di bottiglia. Pertanto, questo protocollo descrive un metodo robusto per lo screening rapido dello sperma di zebrafish iniettato con F0 CRISPR per le modifiche della linea germinale utilizzando PCR standard, digestione di restrizione e tecniche di elettroforesi su gel.

Screening dello sperma per il rapido isolamento delle modifiche germinali nel pesce zebra

Qui, presentiamo un protocollo per marcare le proteine con un tag proteico di fluorescenza nelle larve di zebrafish, un sistema in vivo recentemente sviluppato e modificato particolarmente utile per visualizzare le proteine a bassa abbondanza nel zebrafish.

Marcatura a fluorescenza per visualizzare le proteine a bassa espressione nel pesce zebra

Impara la genotipizzazione rapida di Danio rerio con PCR e HRMA. Questo metodo efficiente rileva mutazioni e transgeni con alta sensibilità, accelerando lo screening genetico in biologia dello sviluppo.

Rapido ed efficiente Zebrafish genotipizzazione Uso PCR con ad alta risoluzione Melt Analysis

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