Rapido ed efficiente Zebrafish genotipizzazione Uso PCR con ad alta risoluzione Melt Analysis

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di eseguire rapidamente lo screening di diversi genotipi, mutazioni o transgeni nel pesce zebra. Ciò si ottiene estraendo prima il DNA da clip sottili e poi amplificando il DNA mediante PCR. Il passo successivo consiste nel denaturare gli ampliconi PCR durante la registrazione delle curve di fusione, che vengono analizzate dal software.

In definitiva, i risultati mostrano curve di fusione distinguibili per diversi genotipi. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto al metodo esistente come l'elettroforesi su gel PCR volumetrica, è che è sensibile ai cambiamenti di un singolo nucleotide, al piccolo inserimento, a tutte le delezioni e questa tecnica è veloce e affidabile. Sebbene questa tecnica possa essere utilizzata per genotipizzare in modo rapido ed efficace il pesce zebra, può essere applicata anche ad altri sistemi e organismi modello, tra cui linee cellulari, topi e altri animali.

Il giorno della preparazione del DNA, aggiungere la proteinasi K fresca al tampone di lisi a una concentrazione di un milligrammo per millilitro. Il tessuto può essere raccolto da un pesce adulto utilizzando una clip sottile o da un pesce embrionale. Per prima cosa anestetizzare il pesce in soluzione di Trica.

Aspetta che i movimenti branchiali rallentino. Quindi metti il pesce su una pila di fazzoletti e con una lama di rasoio sterile, taglia un piccolo pezzo della pinna caudale lungo circa due o tre millimetri. Metti rapidamente il pesce in una vasca etichettata con acqua dolce per il recupero.

Prelevare la clip dell'aletta con una punta per pipetta sterile e trasferirla in una provetta riempita con 100 microlitri di tampone per la lisi del DNA. Assicurati di etichettare sia la vasca dell'animale che il tubo, incubare tutti i tessuti raccolti per almeno quattro ore e fino a una notte a 55 gradi Celsius dopo l'incubazione. Inattivare la proteina ACE K riscaldando i tubi a 95 gradi Celsius per 15 minuti.

Questi campioni devono essere utilizzati immediatamente per la PCR, ma possono anche essere conservati a meno 20 gradi Celsius per un massimo di tre mesi. Eseguire la PCR in una piastra da 96 o 384 pozzetti per ogni reazione. Combina non più di un microlitro di DNA adulto con quattro microlitri di scanner luminoso.

Master mix contenente la sonda fluorescente e i primer ad una concentrazione finale di cinque pico molari ciascuno. Se il DNA proviene da un embrione, utilizzare fino a tre microlitri. Coprire le reazioni con 30 microlitri di olio minerale e poi chiuderle con il tappo.

Quindi, coprire la piastra PCR caricata con un sigillo adesivo otticamente trasparente. Ora ottimizza le condizioni di ciclo PCR. Un set di condizioni tipico inizia con cinque minuti di tempo di fusione.

Seguono 30 cicli di PCR con fusioni di dieci secondi, 25 secondi di inginocchiamento e 30 secondi di allungamento. La reazione dovrebbe terminare con l'aggiunta di un 32° fuso e poi raffreddarsi a 15 gradi Celsius. Analizza la piastra PCR inserendola in un sistema di analisi del fuso nel software.

Imposta la temperatura e crea un nuovo file di archiviazione dati. Impostare un sottoinsieme. Seleziona i pozzetti con i campioni nella parte inferiore sinistra dello schermo.

Seleziona la scheda normalizzata per eliminare le varianti fluorescenti. Posiziona manualmente la doppia linea parallela nelle regioni prem, melt e post melt e normalizza i segnali fluorescenti premel e post melt di tutti i campioni rispettivamente a uno e zero. Successivamente, distingui i genotipi in base alla loro temperatura di fusione selezionando prima il raggruppamento.

Quindi selezionare il raggruppamento automatico dall'elenco di selezione standard. Nella sezione di raggruppamento, selezionare normale o alto per fondere i profili rispettivamente con transizioni singole o multiple. Si trovano nell'elenco di selezione della sensibilità nella sezione di raggruppamento.

Ora seleziona i gruppi di calcolo nella sezione di raggruppamento, quindi vai al menu file e fai clic su Salva per salvare i risultati. Il protocollo può essere eseguito in un solo giorno o separato in fasi nell'arco di più giorni. Quando si esegue la PCR, le temperature per il fuso dell'amplicone dipendono dalle dimensioni e dal contenuto di GC, ma generalmente le temperature iniziali e finali di 60 gradi Celsius e 95 gradi Celsius sono appropriate una volta eseguito il fuso.

L'analisi delle curve di fusione fluorescenti richiede tipicamente la normalizzazione della variazione delle diverse curve del campione utilizzando come standard le regioni pre e post fusione. Ciò migliora il confronto dei risultati di diversi campioni in cui la variazione della fluorescenza è correlata a variazioni sperimentali minori. Ogni coppia di linee di temperatura per la normalizzazione deve essere posizionata a circa un grado Celsius di distanza.

I dati possono essere rappresentati in due modi: da un grafico che mostra i file dei profili della curva di fusione, o da un grafico che mostra un grafico di differenza sottrattiva rispetto a un campione di riferimento a seguito dell'analisi HRMA, possono essere rilevate mutazioni o transgeni. Due diverse mutazioni nel gene EIF due B 5 sono notate dalle curve rosse e blu. Questi campioni mutanti sono identificati dalla loro differenza significativa nella curva di fusione, nelle forme o nel cambiamento della fluorescenza rispetto alle curve standard di tipo selvatico.

Questo esempio di quattro diversi genotipi in un'unica collezione di embrioni illustra la potenza e la sensibilità del metodo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di otto ore. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'HRMA per uno screening efficiente su larga scala dei genotipi di zebrafish.