Rilevamento Indel a seguito della mutagenesi CRISPR/Cas9 mediante analisi della fusione ad alta risoluzione nell'aegittito di Mosquito Aedes
10 settembre 2021
Questo articolo descrive in dettaglio un protocollo per la rapida identificazione degli indel indotti da CRISPR / Cas9 e la selezione delle linee mutanti nella zanzara Aedes aegypti utilizzando l'analisi del fuso ad alta risoluzione.
Questo protocollo è un modo molto semplice ed efficiente per rilevare i mutanti generati dalla tecnologia CRISPR / Cas9 da numerosi individui. I due principali vantaggi di questa tecnica sono che può essere fatto in poche ore e che è applicabile a una moltitudine di organismi. La progettazione del primer può essere impegnativa per alcuni geni e possono essere necessari più cicli di progettazione e verifica del primer per rendere efficiente l'HRMA.
Per eseguire una PCR sfumata, iniziare preparando un mix master. Quindi rimuovere 19 microlitri del mix master per il controllo non modello o NTC in una piastra a 96 pozzetti. Quindi, aggiungere il modello al mix master rimanente.
Aliquot 20 microlitri della miscela campione nella piastra a 96 pozzetti. Eseguire la PCR seguendo i parametri ciclici e quindi generare i profili di fusione termica utilizzando i parametri menzionati nel manoscritto. Dopo aver raccolto tutto il materiale richiesto, preparare una miscela principale con 0,5 microlitri del reagente di rilascio del DNA e 20 microlitri di tampone di diluizione per individuo da genotipizzare.
Utilizzando un pipetto multicanale, aliquota 20 microlitri della miscela in una piastra PCR e lasciare la piastra PCR sul ghiaccio. Quindi, posizionare le zanzare G1 anestetizzate in una capsula di Petri di vetro per tenerle sedate e posizionare otto zanzare selvatiche nella seconda capsula di Petri. Pulire un paio di pinzette con etanolo al 70% e utilizzare le pinzette disinfettate per rimuovere una delle zampe posteriori delle zanzare.
Quindi, immergere la gamba nella soluzione di reagente di rilascio del DNA. Posizionare la zanzara nella fiala corrispondente e chiudere la fiala con una spugna. Una volta fatto, pulire le pinzette con etanolo al 70% prima di procedere con la rimozione della gamba dalla zanzara successiva fino a quando la piastra a 96 pozzetti non è completata.
Successivamente, sigillare la piastra con un sigillo ottico della piastra PCR e incubare la piastra PCR contenente le gambe a temperatura ambiente per due-cinque minuti, seguita dall'incubazione a 98 gradi Celsius per due minuti. Lasciare raffreddare la piastra a temperatura ambiente. Per la PCR, preparare una miscela master contenente i componenti preferiti e quindi utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 19 microlitri della miscela master in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti.
Dopo aver trasferito un microlitro della soluzione di rilascio del DNA contenente DNA di zanzara precedentemente preparato sulla piastra, sigillare la piastra con un sigillo ottico della piastra PCR. Eseguire la PCR con gli opportuni parametri ciclici per generare profili termici di fusione seguendo i parametri descritti nel manoscritto, quindi esaminare i profili di fusione assegnando il controllo wild-type al cluster di riferimento. Contrassegnare i diversi cluster con i colori corrispondenti sul modello a 96 pozzetti.
Quindi, selezionare gli individui con curve di interesse e rimuovere gli individui selezionati dai tubi da incrociare. Il sangue nutre le femmine fatte, seguito dalla raccolta di G2A. Nell'analisi rappresentativa, viene mostrata l'analisi di sequenza del mutante ZIP11 di Aedes aegypti.
L'elettroferogramma di mutanti eterozigoti Aedes aegypti ZIP11 ha indicato la posizione nucleotidica in cui si è verificato l'indel. L'indel è rappresentato da uno spostamento da picchi singoli a doppi poiché le posizioni polimorfiche mostrano entrambi i nucleotidi contemporaneamente. Al termine dell'esecuzione, il numero di coppie di basi eliminate o inserite è stato calcolato contando i singoli picchi.
Le zanzare contenenti mutazioni nei geni Aedes aegypti ZIP11 e myo-fem sono state genotipizzate e sequenziate verificate utilizzando l'analisi del fuso ad alta risoluzione di HRMA. I segnali fluorescenti dei campioni sono stati normalizzati a valori relativi da uno a zero. Inoltre, ogni curva è stata sottratta dal riferimento wild-type e ha indicato l'ingrandimento corrispondente.
Un'assegnazione automatica del cluster non riuscita viene mostrata nei risultati rappresentativi, in cui non è stata fatta una distinzione adeguata tra i gruppi. Inoltre, ogni campione è stato analizzato individualmente e assegnato ai gruppi corretti in base alla somiglianza con campioni di riferimento di eterozigoti, omozigoti e transeterozigoti. Dopo aver eseguito gli HRMA, è necessario sequenziare il DNA dagli individui mutati per analizzare gli indel e identificare le altre mutazioni nella sequenza mirata.
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Panoramica
Questo articolo descrive un protocollo per l'identificazione rapida di inserzioni ed eliminazioni (indel) indotte da CRISPR/Cas9 e la selezione di linee mutanti nel morso Aedes aegypti mediante analisi di fusione ad alta risoluzione. Il metodo è efficiente e applicabile a diversi organismi, consentendo una rapida rilevazione dei mutanti.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Genetica
- Biologia molecolare
- Entomologia
Sfondo
- La tecnologia CRISPR/Cas9 è ampiamente utilizzata per la modifica genica.
- L'identificazione efficiente delle mutazioni è fondamentale per gli studi genetici.
- L'analisi di fusione ad alta risoluzione (HRMA) offre un metodo di rilevamento rapido.
- Le difficoltà nella progettazione dei primer possono influenzare l'efficienza dell'HRMA.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo per l'identificazione di mutazioni indotte da CRISPR.
- Dimostrare l'applicabilità dell'HRMA in diversi organismi.
- Ottimizzare il processo di selezione di linee mutanti.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di un mix master per la PCR.
- Utilizzo di controlli senza stampo (NTC) in una piastra a 96 pozzetti.
- PCR in gradiente per l'ottimizzazione delle condizioni.
- Analisi di fusione ad alta risoluzione per il rilevamento di indel.
Risultati principali
- Il protocollo consente un'identificazione rapida dei mutanti.
- L'HRMA può essere completata in poche ore.
- Potrebbero essere necessari diversi cicli di progettazione dei primer per ottenere efficienza.
- Il metodo è versatile su diverse specie.
Conclusioni
- Questo protocollo aumenta l'efficienza del rilevamento di mutanti.
- Fornisce uno strumento prezioso per la ricerca genetica nei moscerini.
- Studi futuri potranno basarsi su questo metodo per applicazioni più ampie.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il rilevamento rapido di indel indotti da CRISPR/Cas9 consente una valida verifica degli obiettivi nella ricerca sul controllo dei vettori, riducendo i tempi per gli studi funzionali dei geni. L'analisi di fusione ad alta risoluzione supporta un genotipaggio scalabile senza sacrificio dell'organismo, facilitando saggi fenotipici successivi ed incroci genetici. Questo approccio aumenta la sicurezza predittiva nella fase iniziale della scoperta fornendo un rilevamento quantitativo delle mutazioni a partire da campioni tissutali minimi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la rapida rilevazione di inserzioni e delezioni dopo mutagenesi con CRISPR.
- Valore operativo: Favorisce la riduzione dei rischi biologici identificando alleli mutanti senza sacrificare organismi, preservando i campioni per saggi successivi.
- Impatto sul portafoglio: Accelera i flussi di lavoro di validazione degli obiettivi, consentendo una più rapida priorizzazione di geni bersaglio in sistemi rilevanti per le malattie.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce curve di fusione fluorescenti normalizzate che consentono il confronto quantitativo tra genotipi wild-type e mutanti.
- Valore operativo: Compatibile con formati a piastre a 96 pozzetti, idonea per lo screening di media capacità di individui modificati.
- Prontezza del saggio: Genera profili di fusione distinguibili per eterozigoti, omozigoti e trans-eterozigoti, permettendo un assegnamento affidabile dei cluster.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Permette il genotipaggio seguito da fenotipizzazione o alimentazione con sangue, collegando la modifica genetica a risultati funzionali nei modelli di malattia.
- De-risking meccanicistico: Facilita la caratterizzazione di inserzioni e delezioni (indel) mediante sequenziamento successivo, confermando gli effetti sul bersaglio e identificando potenziali modifiche fuori bersaglio.
- Supporto per modelli preclinici: Consente l'istaurazione di linee mutanti in Aedes aegypti, un vettore chiave per gli studi sulla trasmissione degli arbovirus.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla mutagenesi CRISPR all'identificazione del composto guida, fornendo un punto di controllo di genotipizzazione prima della validazione funzionale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi identificando rapidamente le inserzioni e delezioni (indel) che interrompono la funzione genica nei percorsi mirati.
- Screening: Permette la standardizzazione dei saggi attraverso l'analisi normalizzata delle curve di denaturazione e il raggruppamento basato su riferimenti.
- Analisi: Genera spostamenti quantitativi nei profili di denaturazione correlati alla dimensione degli indel, consentendo analisi comparative tra campioni.
- Ricerca traslazionale: Collega la modifica genetica alla valutazione fenotipica permettendo l'utilizzo di organismi viventi dopo il genotipaggio.
- Riutilizzo aziendale: Riutilizzabile su diversi organismi e geni, con adattabilità nella progettazione dei primer che ne supporta l'applicabilità a un'ampia gamma di bersagli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione del bersaglio fornendo evidenze dirette degli esiti della modifica genica.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità attraverso protocolli standardizzati di PCR e analisi di denaturazione con controlli integrati.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale riducendo il tempo e le risorse necessarie per lo screening dei mutanti.
- Impatto sul portafoglio: Consente un avanzamento adeguato al rischio confermando la presenza della mutazione prima di investire in saggi fenotipici.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella progettazione e nell'ottimizzazione di primer, poiché alcuni geni potrebbero necessitare di più iterazioni di progettazione per un'efficiente HRMA.
- Dipende da strumentazione dotata di controllo preciso della rampa termica e di rilevamento della fluorescenza per l'analisi di fusione ad alta risoluzione.
- Necessita di una preparazione standardizzata dei campioni mediante tessuto delle zampe e reagenti per il rilascio del DNA per garantire una qualità costante dell'input.
- Richiede campioni di riferimento di tipo selvaggio per un'assegnazione accurata dei cluster e la normalizzazione dei profili di fusione.
- Limitato dalla necessità di sequenziamento post-HRMA per caratterizzare completamente le indel e rilevare mutazioni aggiuntive nella sequenza bersaglio.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:33
A Gradient PCR Using Genomic DNA (gDNA) from a Single Individual
1:09
Preparation of Genomic DNA from Mosquito Legs
2:31
Perform PCR
3:35
Results: Detection of CRISPR/Cas9-Induced Indels and the Establishment of Mutant Lines in the Mosquito Aedes aegypti
5:02
Conclusion
