Visualizzazione immunoistochimica di ippocampale Neuron attività dopo Spatial apprendimento in un modello murino di disturbi dello sviluppo neurologico

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di rilevare i cambiamenti nella fosforilazione dell'irk ippocampale a seguito dell'apprendimento spaziale in due topi knockout Grailed come modello di disturbi dello sviluppo neurologico. Ciò si ottiene testando prima sia i topi wild type che quelli knockout in grail nel labirinto d'acqua di Morris. Come seconda fase, il cervello dei topi viene rimosso e le fette di topi wild type e knockout vengono preparate mediante taglio a viome.

Successivamente, le fette di cervello di topi wild type e knockout vengono elaborate per l'immunoistochimica e utilizzate per rilevare i cambiamenti di fosforilazione nell'ippocampo. I risultati mostrano differenze nella fosforilazione RC ippocampale tra topi wild type e in grail two knockout sulla base della visualizzazione al microscopio ottico della colorazione immunoistochimica. Questo metodo consente di identificare sottogruppi specifici di neuroni dell'ippocampo che vengono attivati a seguito di un compito di apprendimento speciale dipendente dall'ippocampo come il labirinto d'acqua di Maurice.

Abbiamo aggiunto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo deciso di studiare la cascata molecolare che sottolinea il deficit molecolare in topi knockout di secondo grado, un modello murino per i disturbi dello spettro autistico. Per iniziare, addestrare topi provenienti da vari background di interesse in un compito di apprendimento spaziale come il Morris Water Mae. Seguire il regime di allenamento come descritto nel protocollo di testo allegato alla fine del periodo di allenamento, sopprimere i topi e poi sistemare e rimuovere il loro cervello.

Quando sei pronto per continuare con la procedura, usa un bisturi per rimuovere il cervelletto. Quindi incolla il resto del cervello in posizione verticale sulla piastra di supporto del vibrato. Tagliare il cervello in sezioni seriali spesse da 20 a 40 micron in tutto l'ippocampo dorsale.

Trasferire ogni fetta in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti riempita con un millilitro di PBS 0,1 molare, trasferire da tre a cinque sezioni ippocampali dorsali per ciascun topo nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti multipozzetti, contenente 500 microlitri di PBS molare 0,1 per ciascuna. Lavare bene le sezioni contenute in ogni pozzetto con 500 microlitri di PBS molare 0,1 eseguire tutti i lavaggi e le incubazioni a temperatura ambiente con leggera agitazione se non diversamente indicato. Sotto una cappa aspirante, incubare le sezioni in metanolo al 40% e perossido di idrogeno all'1% in PBS molare 0,1 molare per 20 minuti al fine di spegnere l'attività della perossidasi endogena.

Dopo altri tre lavaggi in PBS 0,1 molare permeare le sezioni incubandole in 500 microlitri di Triton X 100 allo 0,2% per cinque minuti mentre le sezioni sono in incubazione, preparare abbastanza tampone bloccante per l'intero esperimento. Quindi rimuovere la soluzione permeabile e aggiungere 100 microlitri di tampone bloccante a ciascuno. Incubare bene le sezioni per un'ora.

Successivamente, rimuovere il tampone bloccante e coprire le sezioni con chinasi regolata extracellulare fosforilata. L'anticorpo primario è stato diluito da uno a 500 in tampone bloccante. Incubare le sezioni per una notte a quattro gradi Celsius con una leggera agitazione il giorno successivo dopo aver lavato le sezioni tre volte in PBS 0,1 molare per cinque minuti.

Ciascuna incuba le sezioni con un anticorpo secondario coniugato con biotina diluito da uno a 250 in tampone bloccante per un'ora a temperatura ambiente durante l'incubazione. Preparare il reagente A BC almeno 30 minuti prima dell'uso per lasciare il tempo sufficiente per la formazione del complesso Aden e biotina. Dopo aver lavato le sezioni altre tre volte con PBS 0,1 molare, aggiungere il reagente A, b, C e lasciarlo incubare con il campione per 45 minuti.

Durante la successiva serie di tre lavaggi in PBS, preparare la soluzione di lavoro DAB nella cappa aspirante secondo le specifiche del produttore, aliquotare la soluzione di lavoro DAB nella piastra. Quindi trasferire le sezioni nei pozzetti contenenti la soluzione di lavoro DAB e far roteare lentamente la piastra per consentire la massima esposizione delle sezioni alla soluzione. Monitorare la reazione DAB su un microscopio fino a quando non si sviluppa un segnale adeguato.

In circa due-cinque minuti, interrompere la reazione all'intensità di colore desiderata lavando il tessuto in PBS molare 0,1. Dopo altri tre lavaggi in PBS, montare le sezioni su vetrini rivestiti di gelatina e asciugarle a temperatura ambiente per almeno tre o quattro ore. Una volta essiccato all'aria, il trasferimento scivola nella cappa aspirante e disidrata le sezioni posizionandole in sequenza con soluzioni di etanolo integrate per due minuti ciascuna, quindi elimina i vetrini in xilene al 100% per cinque minuti.

Coprire, infilare i vetrini utilizzando il supporto di montaggio e lasciarli nella cappa aspirante durante la notte per trasferire i vetrini su un microscopio a campo chiaro, dotato di una fotocamera e di un obiettivo 20x. Acquisisci più immagini in campo chiaro da ciascuna sezione con un ingrandimento di 200 volte che copre l'immagine dell'ippocampo dorsale. Da tre a cinque sezioni per ogni animale.

Qui sono mostrate sezioni delle regioni dorsali dell'ippopotamo di un topo selvatico e di un topo Grailed a due knockout colorato per fosforilato. Extracellulare regolato una lettura molecolare affidabile dell'attivazione neuronale dipendente dall'apprendimento. Entrambi questi topi erano stati sottoposti a un classico regime di attività di apprendimento spaziale dipendente dall'ippocampo, il labirinto d'acqua di Morris prima del sacrificio.

Nell'ultimo giorno di test, i due topi knockout Grailed hanno mostrato un significativo deficit di apprendimento spaziale rispetto ai topi wild type. Per analizzare le fette di cervello dei topi, è stato contato il numero totale di cellule positive in tutte le varie regioni dell'ippocampo. Nel livello a tre parametri CA, i topi wild type avevano significativamente più cellule RK positive fosforilate per area rispetto ai topi knockout.

Risultati opposti sono stati trovati nello strato di cellule hili e granulari o GCL. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come studiare la formulazione di phos su fette di cervello dell'ippocampo di modelli murini sia genetici che farmacologici di disturbi dello sviluppo neurologico caratterizzati da deficit cognitivi. Questa tecnica può essere utilizzata anche per studiare i cambiamenti della formulazione della forza irritante in altre aree del cervello, oltre a seguire compiti cognitivo-comportamentali diversi dal labirinto d'acqua di Maurice.

Non dimenticare che lavorare con la benzina DIA può essere estremamente disertore e per precauzioni, come indossare protezioni adeguate, dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.