Name: Visualizzazione immunoistochimica di ippocampale Neuron attività dopo Spatial apprendimento in un modello murino di disturbi dello sviluppo neurologico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Scopri l'immunoistochimica per analizzare l'attivazione neuronale ippocampale dopo l'apprendimento spaziale in modelli murini. Questo metodo consente di identificare pattern di fosforilazione in disturbi dello sviluppo neurologico.

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Desideriamo ringraziare il personale amministrativo di CIBIO (Università di Trento) e CNR Neuroscience Institute per l&#39;assistenza. Giovanni Provenzano è sostenuto da una borsa di studio post-dottorato da Fondazione Veronesi (Milano, Italia). Questo lavoro è stato finanziato dal Ministero italiano dell&#39;Università e della Ricerca (PRIN 2008 grant # 200894SYW2_002 e PRIN 2010-2011 concessione # 2010N8PBAA_002 a YB), Università degli Studi di Trento (CIBIO concessione start-up a YB) e Fondazione Telethon (grant # GGP13034 a YB).

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la Direttiva della Comunità Europea 2010/63 / UE e sono stati approvati dal Ministero della Salute italiano. 1. Animal Care, Housing e trattamento <ol><li> Eseguire tutti i protocolli sperimentali utilizzando topi in conformità con le linee guida del rispettivo cura degli animali istituzionale. </li><li> Mantenere gli animali in una 12 ore di luce / buio ciclo con cibo e acqua ad libitum. </li><li> Casa i topi in gruppi di 2-4, in gabbie topo policarbonato di dimensioni standard con segatura e una lettiera con cambio settimanale. </li><li> Utilizzare l&#39;età e topi di sesso-matched, perché la suscettibilità alla malattia può variare con l&#39;età e genere in diversi modelli murini di disturbi dello sviluppo neurologico. </li><li> Scegliere un numero adeguato di animali per raggiungere la significatività statistica (un minimo di 10 topi per genotipo per lo studio comportamentale e 4 topi per genotipo per l&#39;esperimento immunoistochimica). </li></ol> 2. Morris Water Maze (MWM) <ol><li> Utilizzare una circolare Tank (diametro 100 cm, altezza 50 cm). <ol><li> Mettere alcuni suggerimenti visivi sui divisori intorno al serbatoio. </li><li> Posizionare una piattaforma di 10 cm di diametro nel serbatoio in posizione fissa nel centro di uno dei quattro quadranti immaginari. Tenere la piattaforma nascosta nello stesso quadrante per tutte le prove in tutti i corsi di formazione. </li><li> Riempire la piscina con acqua di rubinetto fino a quando la piattaforma è di 1 cm al di sopra della superficie dell&#39;acqua. La temperatura dell&#39;acqua Equilibrare dovrebbe essere vicino ai 22 ° C; questa operazione può richiedere diverse ore. Aggiungere acqua calda per abbreviare il tempo necessario per equilibrare la temperatura dell&#39;acqua. </li><li> Aggiungere circa 1,5-2 L di bianco, vernice atossica per rendere l&#39;acqua opaca. </li></ol></li><li> Traccia Acquisizione Procedura <ol><li> Impostare sistema di tracciamento di MWM con telecamere CCD standard e schede video. Scegli un sistema di video-tracking per monitorare e analizzare diverse variabili, quali la lunghezza del percorso, escala latenza pe, e il tempo trascorso in ogni quadrante. </li><li> Dividete l&#39;arena in quattro quadranti e regolare le impostazioni di rilevamento per assicurare il massimo contrasto tra gli animali e lo sfondo per il monitoraggio in tempo reale. </li><li> Specificare la regione piattaforma. </li><li> Impostare il tempo massimo di processo come 60 sec. </li></ol></li><li> MWM Testing <ol><li> Prima della prova comportamento, consentire topi un periodo di adattamento di 20-25 minuti in una zona dove non possono vedere la piscina o indizi spaziali. </li><li> Treno ogni mouse per 9 giorni (due prove consecutive al giorno, con 20-30 minuti intervallo tra loro). </li><li> Accendere il computer e la macchina fotografica e avviare il software di sistema di video-tracciamento. </li><li> Prendere il mouse per la coda e metterlo in acqua, con la testa rivolta verso il lato della piscina, a partire da una delle quattro posizioni di partenza (nord, sud, est, ovest). Per ogni mouse, la posizione di partenza dovrebbe essere diverso e pseudorandomized in tutti gli studi. </li><li> Lasciate che la nuotata del mouse e cercare il piattafORM per un massimo di 60 secondi. Una volta che l&#39;animale raggiunge la piattaforma, consentono di rimanere sulla piattaforma per 20 sec. </li><li> Se il mouse non è riuscito a individuare la piattaforma entro quel tempo, guidare delicatamente il mouse per la piattaforma, tenendolo per la coda e lasciarlo a rimanere lì per 20 sec. Una volta che l&#39;animale ha completato tutte le due prove, asciugarlo con un panno e rimetterlo in gabbia. </li><li> Ogni giorno del periodo di formazione, ripetere la stessa procedura (punti 2.3.4-2.3.6). </li><li> Eseguire il test della sonda il giorno 9 dopo l&#39;ultima traccia di formazione. </li><li> Rimuovere la piattaforma dalla piscina. </li><li> Lasciate che la nuotata del mouse e cercare la piattaforma per un massimo di 60 secondi. </li><li> Periodicamente, controllare la temperatura dell&#39;acqua in modo che dovrebbe essere la stessa (22 ° C) e pulire la piscina. </li></ol></li></ol> 3. Preparazione delle sezioni di perfuso Animali <ol><li> Sacrifica i topi alla fine di MWM. Quattro topi per genotipo devono essere anestetizzati prima euthanizzione secondo le linee guida locali e internazionali. </li><li> Profumato l&#39;animale transcardially (tagliare destra auriclewith una forbice per consentire lo sfiato e introdurre una cannula farfalla nel ventricolo sinistro di perfusione) con tampone fosfato (PBS) per 4-5 minuti, seguiti da 4% paraformaldeide in PBS per 10-15 min 22. </li><li> Sezionare e post-fix cervelli in paraformaldeide 4% a 4 ° C per almeno 12 ore. </li><li> Mettere il cervello in 50 ml provette in polistirene coniche contenente 15 ml di 0,02% di sodio azide a 0,1 M PBS e conservare a 4 ° C fino al momento per affettare. </li><li> Tagliare e rimuovere il cervelletto prima vibratome taglio. </li><li> Incollare il cervello in posizione verticale con il sito di taglio, utilizzando colla, sulla piastra di supporto del vibratome. </li><li> Tagliare il cervello in 20-40 micron di spessore sezioni coronali, in ordine seriale durante l&#39;ippocampo dorsale, su appositi vibratome. </li><li> Raccogliere vibratome fette con un pennello e trasferirli in un 24 piastra multi-pozzetti contenenti 1 ml di 0,1 M PBS per ogni pozzetto. </li><li> Conservare sezioni per breve termine in PBS o lungo termine a 0,02% di sodio azide in PBS a 4 ° C (tessuto potrebbero essere utilizzati per un massimo di un anno). </li></ol> 4. immunoistochimica <ol><li> Trasferimento 3-5 dorsali sezioni di ippocampo per ogni mouse, in 24 piatto multi-pozzetti contenenti 500 ml di 0,1 M PBS per ogni bene. </li><li> Lavare le sezioni contenute in ogni pozzetto con 500 ml di 0,1 M PBS (5 min, 3 volte con agitando delicatamente). </li><li> Quench attività perossidasica endogena, incubando le sezioni in 1% H 2 O 2 in PBS per 20 minuti con agitazione. </li><li> Lavare le sezioni in 0,1 M PBS con agitazione delicata (3 x 5 min). </li><li> Permeabilizzazione di tessuto: incubare sezioni per 5 min in 0,2% Triton X-100 in PBS. </li><li> Durante le fasi di cui sopra (4.4, 4.5), fare tampone di bloccaggio abbastanza (10% capra siero e 0,1% Triton-X100 in PBS) per l&#39;intero esperimento (number delle sezioni x 100 ml x 3 gradini). </li><li> Nota: Utilizzare siero dalle stesse specie in cui è stata fatta la Ab secondario (coniugato con biotina). </li><li> Impedire legame non specifico dell&#39;anticorpo, incubando le sezioni in tampone di bloccaggio (100 microlitri / sezione) per 1 ora a temperatura ambiente (RT) con agitazione. </li><li> Incubare sezioni nel primario Ab (pERK) diluito in tampone di bloccaggio, notte a 4 ° C, con agitazione. </li><li> Lavare le sezioni in 0,1 M PBS con agitazione delicata (3 x 5 min). </li><li> Incubare con l&#39;anticorpo secondario coniugato con biotina (1: 250) diluito in tampone di bloccaggio (stesso usato nella fase 4.6) per 1 ora a RT con agitazione. </li><li> Preparare reagente ABC allo stesso tempo, perché avidina e biotina richiedono almeno 30 minuti a temperatura ambiente al complesso. </li><li> Preparare il volume richiesto di reagente ABC in base al protocollo costruttori. </li><li> Lavare le sezioni in 0,1 M PBS con agitazione delicata (3 x 5 min). </li><li> Incubate sezioni per 45 minuti a temperatura ambiente con ABC reagente. </li><li> Lavare le sezioni in 0,1 M PBS con agitazione delicata (3 x 5 min). </li><li> Preparare DAB soluzione di lavoro, ogni passo che coinvolge DAB deve essere fatto nella cappa come DAB è cancerogeno e teratogeno. </li><li> Trasferire soluzione DAB per una nuova piastra con una pipetta di plastica trasferimento. </li><li> Posizionare sezioni nel piatto contenente DAB soluzione e piastra lentamente ricciolo di lavoro a mano, per consentire la massima esposizione alle sezioni. </li><li> Monitorare reazione DAB sul microscopio fino segnale adeguato sviluppa (2-5 min). </li><li> Arrestare la reazione all&#39;intensità colore desiderato lavando il tessuto in 0.1 M PBS (3 x 5 min). </li><li> Utilizzare candeggina per disattivare qualsiasi residuo soluzione di substrato DAB nella cappa durante la notte e smaltirlo secondo le linee guida del laboratorio. </li><li> Sezioni Montare su gelatina rivestite diapositive da galleggianti in PBS. Poi asciugare a temperatura ambiente di almeno 3-4 ore. </li><li> Disidratare il sezioni sequenzialmente nel 50%, 70%, 95%e 100% etanolo per 2 minuti ciascuna, e chiaro in 100% xilene per 5 min. </li><li> Coverslip con mezzo di montaggio e lasciare in cappa asciugare per una notte. </li></ol> Conte 5. cellulare <ol><li> Contare le cellule pERK-positivi, da tre a cinque sezioni a livello dell&#39;ippocampo dorsale devono essere analizzati per animale. </li><li> Acquisire più immagini in campo chiaro da ogni sezione a 200 ingrandimenti utilizzando un microscopio adeguato, e poi montarli utilizzando un software di elaborazione delle immagini. </li><li> Eseguire la conta delle cellule sulle immagini a mosaico tiff convertiti utilizzando il software gratuito ImageJ. </li><li> Contare le celle pERK macchiato nello strato di cellule ilo e granuli sopra 2-3 conteggio scatole da 100 × 100 micron ciascuna. </li><li> Densità cellulari saranno espressi come numero di cellule marcate per intervallo di conteggio (100 × 100 micron). </li><li> Eseguire l&#39;analisi statistica per valutare significative differenze tra genotipi. Questo può essere realizzato con t di Studenttest o ANOVA seguita da test post hoc appropriato utilizzando software commerciali. Impostare il livello di significatività statistica p &lt;0.05. </li></ol>

<ol><li>Castren, E., Elgersma, Y., Maffei, L., Hagerman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+neurodevelopmental+disorders+in+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Treatment of neurodevelopmental disorders in adulthood.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14074-14079 (2012).</li>
<li>Ehninger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+learning+deficits+in+a+Tsc2%2B%2F-+mouse+model+of+tuberous+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Reversal of learning deficits in a Tsc2+/- mouse model of tuberous sclerosis.</a> Nature medicine. 14, 843-848 (2008).</li>
<li>West, A. E., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity-regulated+gene+transcription+in+synapse+development+and+cognitive+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+perspectives+in+biology%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity-regulated gene transcription in synapse development and cognitive function.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).</li>
<li>Goorden, S. M., van Woerden, G. M., van der Weerd, L., Cheadle, J. P., Elgersma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognitive+deficits+in+Tsc1%2B%2F-+mice+in+the+absence+of+cerebral+lesions+and+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+neurology%22%5BJournal%5D)">Cognitive deficits in Tsc1+/- mice in the absence of cerebral lesions and seizures.</a> Annals of neurology. 62, 648-655 (2007).</li>
<li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibromin+regulation+of+ERK+signaling+modulates+GABA+release+and+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neurofibromin regulation of ERK signaling modulates GABA release and learning.</a> Cell. 135, 549-560 (2008).</li>
<li>Brielmaier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autism-relevant+social+abnormalities+and+cognitive+deficits+in+engrailed-2+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Autism-relevant social abnormalities and cognitive deficits in engrailed-2 knockout mice.</a> PloS one. 7, e40914(2012).</li>
<li>Provenzano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+dysregulation+of+neurofibromin-dependent+pathways+is+associated+with+impaired+spatial+learning+in+engrailed+2+knock-out+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hippocampal dysregulation of neurofibromin-dependent pathways is associated with impaired spatial learning in engrailed 2 knock-out mice.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 13281-13288 (2014).</li>
<li>Morgan, J. I., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-transcription+coupling+in+neurons%3A+role+of+cellular+immediate-early+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Stimulus-transcription coupling in neurons: role of cellular immediate-early genes.</a> Trends in neurosciences. 12, 459-462 (1989).</li>
<li>Steward, O., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+at+synaptic+sites+on+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis at synaptic sites on dendrites.</a> Annual review of neuroscience. 24, 299-325 (2001).</li>
<li>Gutmann, D. H., Parada, L. F., Silva, A. J., Ratner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibromatosis+type+1%3A+modeling+CNS+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurofibromatosis type 1: modeling CNS dysfunction.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14087-14093 (2012).</li>
<li>Costa, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+for+the+learning+deficits+in+a+mouse+model+of+neurofibromatosis+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism for the learning deficits in a mouse model of neurofibromatosis type 1.</a> Nature. 415, 526-530 (2002).</li>
<li>Silva, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+the+learning+and+memory+deficits+associated+with+neurofibromatosis+type%5BTitle%5D)+AND+%22I.+Nature%22%5BJournal%5D)">A mouse model for the learning and memory deficits associated with neurofibromatosis type.</a> I. Nature. 15, 281-284 (1997).</li>
<li>Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Place+navigation+impaired+in+rats+with+hippocampal+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions.</a> Nature. 297, 681-683 (1982).</li>
<li>Praag, H., Kempermann, G., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Running+increases+cell+proliferation+and+neurogenesis+in+the+adult+mouse+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Running increases cell proliferation and neurogenesis in the adult mouse dentate gyrus.</a> Nature. 2, 266-270 (1999).</li>
<li>Adams, J. P., Sweatt, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+psychology%3A+roles+for+the+ERK+MAP+kinase+cascade+in+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+pharmacology+and+toxicology%22%5BJournal%5D)">Molecular psychology: roles for the ERK MAP kinase cascade in memory.</a> Annual review of pharmacology and toxicology. 42, 135-163 (2002).</li>
<li>Di Cristo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+ERK+activation+for+visual+cortical+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement of ERK activation for visual cortical plasticity.</a> Science. 292, 2337-2340 (2001).</li>
<li>Satoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK2+contributes+to+the+control+of+social+behaviors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ERK2 contributes to the control of social behaviors in mice.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 11953-11967 (2011).</li>
<li>Sgado, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+GABAergic+neurons+in+the+hippocampus+and+cerebral+cortex+of+Engrailed-2+null+mutant+mice%3A+implications+for+autism+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">Loss of GABAergic neurons in the hippocampus and cerebral cortex of Engrailed-2 null mutant mice: implications for autism spectrum disorders.</a> Experimental neurology. 247, 496-505 (2013).</li>
<li>Sgado, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+in+engrailed-2+mutant+mice+reveals+common+molecular+pathways+associated+with+autism+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+autism%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling in engrailed-2 mutant mice reveals common molecular pathways associated with autism spectrum disorders.</a> Molecular autism. 4, 51(2013).</li>
<li>Cheh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((En2+knockout+mice+display+neurobehavioral+and+neurochemical+alterations+relevant+to+autism+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">En2 knockout mice display neurobehavioral and neurochemical alterations relevant to autism spectrum disorder.</a> Brain research. 1116, 166-176 (2006).</li>
<li>Dawson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+broader+phenotype+of+autism%3A+genetic%2C+brain%2C+and+behavioral+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Development+and+psychopathology%22%5BJournal%5D)">Defining the broader phenotype of autism: genetic, brain, and behavioral perspectives.</a> Development and psychopathology. 14, 581-611 (2002).</li>
<li>Gage, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Maei, H. R., Zaslavsky, K., Teixeira, C. M., Frankland, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+Most+Sensitive+Measure+of+Water+Maze+Probe+Test+Performance%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+integrative+neuroscience%22%5BJournal%5D)">What is the Most Sensitive Measure of Water Maze Probe Test Performance.</a> Frontiers in integrative neuroscience. 3, 4(2009).</li>
<li>Guzowski, J. F., Setlow, B., Wagner, E. K., McGaugh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+gene+expression+in+the+rat+hippocampus+after+spatial+learning%3A+a+comparison+of+the+immediate-early+genes+Arc%2C+c-fos+and+zif268%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent gene expression in the rat hippocampus after spatial learning: a comparison of the immediate-early genes Arc, c-fos and zif268.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 5089-5098 (2001).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare

Qui, mettiamo a disposizione un protocollo immunoistochimica pERK per aver rivelato l&#39;attivazione neuronale seguente MWM in En2 - / - mice, un modello murino di disturbi dello sviluppo neurologico. Livelli di pERK Diminuzione sono stati rilevati nel sottocampo CA3 di En2 - / - mutanti rispetto ai WT. A differenza di quanto osservato in CA3 sottocampo, un aumento generale dei neuroni pERK-positivi è stata invece rilevata sia ilo e GCL di En2 - / - mice rispetto al WT. Una possibile sp...

Disturbi dello sviluppo neurologico sono un gruppo di disturbi come la sindrome di Down, la sindrome X fragile (FXS), la sindrome di Rett, neurofibromatosi, sclerosi tuberosa e ASD, in cui lo sviluppo e la maturazione del sistema nervoso centrale (SNC) è disturbato nella fase iniziale un&#39;ampia ed eterogenea il periodo prenatale 1. Queste disfunzioni dello sviluppo cerebrale possono causare profondi effetti per tutta la vita sulla funzione motoria, il linguaggio, l&#39;apprendimento e il processo della memoria. Una pletora di fattori genetici e ambientali sono stati implicati nella patogenesi di disordini dello sviluppo neurologico negli ultimi anni 2,3. Anche se i meccanismi molecolari alla base del fenotipo clinico rimangono sconosciute, i risultati di cui sopra hanno permesso lo sviluppo di diversi modelli murini di questi disturbi. Apprendimento e memoria deficit sono stati identificati in un certo numero di questi modelli di topo, come Tsc1 +/-, TSC2 +/-,Nf1 +/- e En2 - / - mice 2,4-7. Una sfida importante nel campo dei disturbi del neurosviluppo è l&#39;identificazione dei processi cellulari e molecolari alla base della memoria e dell&#39;apprendimento erettile. Vie di segnalazione selezionati attivate durante l&#39;apprendimento o la memoria possono indurre la trascrizione di geni specifici e alla fine porterà a de novo sintesi proteica. Geni immediati-precoce (IEGs) attivazione e proteine-dipendente modifiche sinaptiche stanno rapidamente indotte in neuroni del cervello in risposta all&#39;attività neuronale e formazione comportamentale 8,9. Deficit di vie di segnalazione che coinvolgono neurofibromin sono stati associati con l&#39;apprendimento compromessa in disturbi dello sviluppo neurologico. Neurofibromin è il prodotto del gene NF1, cui mutazione provoca neurofibromatosi tipo 1, una sindrome genetica complessa caratterizzata da tumori del sistema nervoso, ritardi comportamentali e motorie e cognitive disabilità 10. Eterozigoti Mice per Nf1 cancellazione limitata ai neuroni inibitori mostrano deficit nella prima fase di potenziamento a lungo termine (LTP), così come l&#39;apprendimento spaziale compromessa MWM 5,11,12. È interessante notare che la carenza Nf1 in questo modello di topo porta ad una attivazione eccessiva di segnalazione Ras in interneuroni inibitori durante l&#39;apprendimento, con conseguente aumento della fosforilazione ERK ed infine in un miglioramento anormale di rilascio di GABA da questi neuroni 5. Sulla base di questi risultati, la visualizzazione dell&#39;attività neuronale dopo compiti comportamentali rappresenta un modo per ricostruire i circuiti specifici coinvolti in malattie dello sviluppo neurologico. Il protocollo immunoistochimica qui descritta ha lo scopo di valutare e quantificare dell&#39;ippocampo livelli di fosforilazione ERK seguenti MWM in un modello di topo con ASD deficit cognitivi. MWM è ampiamente utilizzato per studiare dipendente apprendimento spaziale dell&#39;ippocampo e la memoria nei roditori 13,14 </sup&gt;. Decidiamo di utilizzare ERK fosforilazione come lettura molecolare di apprendimento ippocampo compito-dipendente, dal momento che ERK ha dimostrato di avere un ruolo essenziale nell&#39;apprendimento e nella memoria la formazione 15. Inoltre, il percorso ERK è necessaria per la plasticità esperienza-dipendente in via di sviluppo corteccia visiva 16. Infine, topi privi di uno dei due isoforme (ERK ERK2) in mostra CNS contrassegnati anomalie nei comportamenti cognitivi, emotivi e sociali 17, che indica che la segnalazione ERK potrebbe giocare un ruolo fondamentale nella patogenesi di disturbi dello sviluppo neurologico, come ASD. Abbiamo usato engrailed 2 knockout (En2 - / -) topo come modello di disturbi dello sviluppo neurologico. En2 - / - topi mostrano le caratteristiche anatomiche e comportamentali &quot;ASD-like&quot;, tra cui la perdita di interneuroni prosencefalo 18, ridotta espressione di geni ASD-correlati 19, diminuzione socialità, e la flessibilità cognitiva 6,7,20. Learni spazialeng e difetti di memoria, come quelli rilevati in MWM, sono particolarmente robusti in En2 - / - mice 6,7 e potrebbero essere rilevanti per i deficit cognitivi osservati nei pazienti ASD 21. Inoltre, abbiamo dimostrato che alterata apprendimento spaziale in MWM è associata con l&#39;espressione neurofibromin ridotti e aumento dei livelli di Perk nel ilo di En2 - / - topi adulti 7. Qui vi presentiamo il protocollo dettagliato per la caratterizzazione immunoistochimica di pERK seguito MWM in questo modello di topo ASD.

<table><tbody><tr><td>EthoVision XT 8</td><td>Noldus Information Technology</td><td></td><td>Questa piattaforma software non è un requisito: ci sono molti altri software comportamentali sul mercato.</td></tr><tr><td>Tempera</td><td>Giotto - Fila Group Company</td><td></td><td>Bianco e liquido, atossico. Utilizzato per preparare l'acqua opaca nel labirinto d'acqua di Morris.</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200</td><td>È possibile utilizzare modelli equivalenti di altre aziende.</td></tr><tr><td>Piastra a 24 pozzetti</td><td>Sigma</td><td>CLS3524</td><td></td></tr><tr><td>100% etanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A406-20</td><td>Utilizzato per produrre gradiente di etanolo per la disidratazione prima del montaggio del vetrino.</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>VWR</td><td>66004-950</td><td>Toxic - da utilizzare sotto il cofano. Cambia lo xilene ogni mese a seconda dell'uso.</td></tr><tr><td>Sodio azide</td><td>Sigma</td><td> S2002</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno</td><td>Sigma</td><td>H1009-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>Abcam</td><td>G9023-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Kit ABC Vectastain&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td>Aggiungere un volume di 5 ml di PBS 2 gocce di reagente A, mescolare e quindi aggiungere 2 gocce di reagente B e mescolare.</td></tr><tr><td>Substrato DAB perossidasi</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>Aggiungere in un volume di 5 ml di ddH2O: 2 gocce di soluzione madre tampone e mescolare; 4 gocce di DAB e mescolare; 2 gocce di H2O2 e mescolare.</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>pERK anticorpo</td><td>Cell Signaling Technologies&nbsp;</td><td>4370</td><td>Diluizione 1:500</td></tr><tr><td>Laboratori</td><td>vettoriali di anticorpi IgG anti-coniglio di capra biotinilata</td><td>BA-1000&nbsp;</td><td>Diluizione 1:250</td></tr><tr><td>Diapositive SuperFrost&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>1879</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>Fisher</td><td>12-548-B</td><td></td></tr><tr><td>DPX</td><td>Sigma</td><td>317616</td><td>Supporto di montaggio per diapositive. È possibile utilizzare un mezzo di montaggio equivalente.</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>&nbsp; Zeiss&nbsp;</td><td>È possibile utilizzare un microscopio equivalente</td> <td>ad Axio Imager.M2</td>.</tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe Systems, San Jose, CA</td><td></td><td>Per assemblare le immagini.</td></tr><tr><td>Il software</td><td>gratuito può essere scaricato all'indirizzo</td><td></td><td></td> http://rsb.info.nih.gov/ij/</tr> <tr><td>SigmaPlot 11.0</td><td>Systat Software Inc. (USA)</td><td></td><td>È possibile utilizzare software equivalenti per l'analisi statistica.</td></tr><tr><td>Prism 6</td><td>GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA)</td><td></td><td>È possibile utilizzare software equivalenti per l'analisi statistica.</td></tr></tbody></table>

visualizzazione immunoistochimica di ippocampale neuron attività dopo spatial apprendimento in un modello murino di disturbi dello sviluppo neurologico

Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Induzione di fosforilata chinasi extracellulare regolate (pERK) è una lettura molecolare affidabile di apprendimento-dipendenti attivazione neuronale. Qui, descriviamo un protocollo immunoistochimica pERK per studiare il profilo di attivazione dei neuroni dell&#39;ippocampo seguito dell&#39;esposizione ad un compito di apprendimento spaziale in un modello murino caratterizzato da deficit cognitivi di origine dello sviluppo neurologico. In particolare, abbiamo utilizzato immunostaining pERK studiare attivazione neuronale seguente Morris water maze (MWM, un compito di apprendimento classica ippocampo-dipendente) in engrailed-2 knockout (En2 - / -) topo, un modello di disturbi dello spettro autistico (ASD). Rispetto al wild-type (WT) controlli, En2 - / - topi hanno mostrato significativi deficit di apprendimento spaziale nel MWM. Dopo MWM, differenze significative nel numero di neuroni pERK-positivi sono stati rilevati in specifiche sottocampi dell&#39;ippocampo di En2 - / - mice, rispetto agli animali WT. Così, il nostro protocollo può robustamente rilevare le differenze dineuroni pERK positivi associati alla compromissione apprendimento ippocampo-dipendente in un modello murino di ASD. Più in generale, il nostro protocollo può essere applicato per studiare il profilo di attivazione dei neuroni dell&#39;ippocampo in entrambi i modelli murini genetici o farmacologici caratterizzati da deficit cognitivi.

Il protocollo qui descritto è stato progettato per visualizzare, mediante immunoistochimica, l&#39;espressione di un marcatore specifico di attività dei neuroni dell&#39;ippocampo dopo MWM in un modello murino di disturbi dello sviluppo neurologico. Tutti i dati sperimentali riportati nel presente documento sono state prese dal nostro lavoro recente 7. Sono stati utilizzati ottenuti da accoppiamenti eterozigoti, fratellini di pari età adulta (peso = 25-35 g 3-5 mesi di età) - maschio e femmina WT e...

Descriviamo un protocollo immunoistochimica per studiare il profilo di attivazione dei neuroni dell&#39;ippocampo seguito dell&#39;esposizione ad un compito di apprendimento spaziale in un modello murino caratterizzato da deficit cognitivi di origine dello sviluppo neurologico. Questo protocollo può essere applicato a entrambi i modelli murini genetici o farmacologici caratterizzati da deficit cognitivi.

Visualizzazione immunoistochimica di ippocampale Neuron attività dopo Spatial apprendimento in un modello murino di disturbi dello sviluppo neurologico

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è rilevare i cambiamenti nella fosforilazione dell'irk ippocampale in seguito all'apprendimento spaziale in topi knock-out per Grailed due, utilizzati come modello di disturbi dello sviluppo neurologico. Questo viene ottenuto innanzitutto testando sia topi di tipo selvatico che topi knock-out per Grail due nel labirinto acquatico di Morris. Come secondo passaggio, i cervelli dei topi vengono rimossi e preparate sezioni di tessuto cerebrale provenienti da topi di tipo selvatico e da topi knock-out mediante taglio con viome.In seguito, sezioni cerebrali di topi di tipo selvaggio e di topi knock-out vengono processate per immunohistochimica e utilizzate per rilevare variazioni nella fosforilazione nell'ippocampo. I risultati mostrano differenze nella fosforilazione della RC ippocampale tra topi di tipo selvaggio e topi knock-out per grail due, in base alla visualizzazione al microscopio ottico della colorazione immunohistochimica. Questo metodo consente di identificare specifici sottogruppi di neuroni ippocampali che vengono attivati in seguito a un compito di apprendimento spaziale dipendente dall'ippocampo, come il labirinto acquatico di

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Forniamo un protocollo per la coltura di neuroni dell'ippocampo altamente purificato da cervelli dei topi prenatale senza l'uso di uno strato di cellule gliali alimentatore.

Isolamento e la coltura di neuroni ippocampali da topi prenatali

Il video illustra un metodo di colorazione in immunofluorescenza utilizzato per esaminare la neurogenesi nell'ippocampo adulto. Inizialmente, una sezione cerebrale di topo viene sottoposta a trattamento con anticorpi primari diretti contro le proteine marcatrici associate alla neurogenesi nelle cellule progenitrici neuronali. Successivamente, viene marcato con anticorpi secondari marcati con fluorofori. La sezione cerebrale viene quindi osservata al microscopio confocale per distinguere vari...

Una tecnica di colorazione in immunofluorescenza per rilevare la neurogenesi dell'ippocampo adulto

Questo video dimostra la colorazione in immunofluorescenza di neuroni ippocampali di ratto coltivati all'interno di un chip microfluidico per analizzare la maturazione e la connettività neuronale.

Immunocolorazione a fluorescenza di neuroni ippocampali di ratto all'interno di un chip microfluidico

Questo video mostra la procedura per colorare le cellule staminali neurali appena proliferate in sezioni di tessuto cerebrale utilizzando l'incorporazione di EdU, seguita dall'immunofluorescenza per visualizzare proteine specifiche, migliorando la comprensione della dinamica cellulare e della proliferazione.

Colorazione in immunofluorescenza per la visualizzazione di cellule staminali neurali proliferate in sezioni cerebrali di topo

Fonte: McLeod, F., et al. Valutazione della densità delle sinapsi nelle fette di cervello di roditori ippocampali. J. Vis. Exp. (2017). Questo video mostra un metodo per visualizzare i marcatori sinaptici in fette di cervello ippocampale utilizzando l'analisi di immunofluorescenza confocale. Le fette sono immunocolorate con anticorpi primari mirati a marcatori presinaptici e postsinaptici, seguiti da anticorpi secondari coniugati con fluorofori. I marcatori marcati vengono quindi visualizzati...

Analisi microscopica delle sinapsi in fette di ippocampo di topo mediante immunofluorescenza

Fonte: Provenzano, G., et al. Visualizzazione immunoistochimica dell'attività dei neuroni ippocampali dopo l'apprendimento spaziale in un modello murino di disturbi dello sviluppo neurologico. J. Vis. Exp. (2015)Questo video dimostra l'imaging immunoistochimico per visualizzare l'attivazione neuronale dell'ippocampo. Le sezioni cerebrali colorate rivelano regioni più scure al microscopio a campo chiaro, indicando neuroni attivati.

Imaging dell'attivazione neuronale dell'ippocampo nelle sezioni del cervello del topo

Fonte: Ulivi, A. F., et. al. Imaging longitudinale a due fotoni dell'ippocampo dorsale CA1 in topi vivi. J. Vis. Exp. (2019) Questo video mostra l'imaging longitudinale a due fotoni di neuroni piramidali marcati in fluorescenza in un topo vivo,  mostrando la preparazione, l'allineamento della cannula e l'imaging di dendriti e spine dendritiche per studiare la struttura neuronale nella regione CA1 dell'ippocampo.

Imaging longitudinale a due fotoni di neuroni marcati in fluorescenza in un ippocampo di topo vivo 

Questo metodo descrive una preparazione cronica che consente l'accesso ottico all'ippocampo di topi viventi. Questa preparazione può essere utilizzata per eseguire l'imaging ottico longitudinale della plasticità strutturale neuronale e della plasticità cellulare evocata dall'attività per un periodo di diverse settimane.

Imaging longitudinale a due fotoni dell'ippocampo dorsale CA1 in topi vivi

Questo articolo dimostra la preparazione di una finestra di imaging su misura integrata con cannula per infusione e il suo impianto sulla regione CA1 dell'ippocampo nei topi.

Procedura craniotomia per la visualizzazione delle attività neuronali nell'ippocampo dei topi che si comportano

Questo articolo descrive un metodo per l'osservazione cronica in vivo della microglia a riposo nell'ippocampo CA1 del topo utilizzando la chirurgia controllata con precisione e la microscopia a due fotoni.

In vivo Imaging cronico a due fotoni della microglia nell'ippocampo del topo

Il trapianto di neuroni GABAergici derivati da cellule staminali pluripotenti umane generati dalla programmazione neuronale potrebbe essere un potenziale approccio terapeutico per i disturbi dello sviluppo neurologico. Questo protocollo descrive la generazione e il trapianto di precursori neuronali GABAergici derivati da cellule staminali umane nel cervello di topi neonatali, consentendo l'indagine a lungo termine dei neuroni innestati e la valutazione del loro potenziale terapeutico.

Trapianto di neuroni GABAergici derivati da cellule staminali umane nell'ippocampo di topo postnatale precoce per mitigare i disturbi dello sviluppo neurologico

Scopri l'immunoistochimica per analizzare l'attivazione neuronale ippocampale dopo l'apprendimento spaziale in modelli murini. Questo metodo consente di identificare pattern di fosforilazione in disturbi dello sviluppo neurologico.

Visualizzazione immunoistochimica di ippocampale Neuron attività dopo Spatial apprendimento in un modello murino di disturbi dello sviluppo neurologico (Video) | JoVE Journal

Visualizzazione immunoistochimica di ippocampale Neuron attività dopo Spatial apprendimento in un modello murino di disturbi dello sviluppo neurologico

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