Implementazione Patch Clamp e vivo microscopia a fluorescenza per il monitoraggio delle proprietà funzionali di recente isolato PKD Epithelium

L'obiettivo generale di questa procedura è registrare l'attività di singoli canali e misurare le variazioni della concentrazione intracellulare di calcio in monolayer cistici appena isolati da modelli murini di malattia renale policistica. Questo viene ottenuto innanzitutto lavando i reni PCK rec tramite l'aorta addominale per rimuovere il sangue dai tessuti renali. Il secondo passaggio consiste nell'isolare il monolayer epiteliale delle cisti.

Successivamente, il monostrato isolato può essere utilizzato per registrazioni convenzionali con tecnica del patch clamp dei canali ionici nelle membrane apicali delle cellule epiteliali. Il tessuto isolato può inoltre essere utilizzato per il caricamento con coloranti per il calcio, al fine di quantificare le variazioni della concentrazione intracellulare di calcio nelle cellule epiteliali.

Questi parametri misurati nell'ambiente nativo dei cisti possono essere confrontati con quelli dei tubuli sani al fine di studiare il processo di agenesi cistica. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente lo studio dell'attività dei canali chi e del flusso di calcio nei cisti renali. Questa analisi fornisce dati fisiologicamente rilevanti ottenuti da tessuti freschi isolati.

Con questo approccio, possiamo monitorare l'attività di singoli canali negli epiteli appena isolati. Si tratta di un metodo unico perché può essere utilizzato per caratterizzare con precisione il comportamento dei canali del ferro mediante diverse modifiche della tecnica del patch. Siamo in grado di testare la risposta del canale a vari farmaci nei tubuli cistici e in quelli sani.

Il monolayer di cisti appena isolato può essere utilizzato per l'immagine del calcio intracellulare. Questa tecnica consente lo screening farmacologico e studi funzionali dell'omeostasi del calcio intracellulare nelle cellule cistiche, che rappresentano mezzi importanti per scoprire nuovi trattamenti per la prevenzione della malattia renale policistica. La procedura di lavaggio del sangue mostrerà l'approccio chirurgico utilizzato per rimuovere il sangue dai reni.

Per prima cosa verranno mostrate le procedure di isolamento del rene e dei cisti. Iniziare questa procedura eseguendo una laparotomia e lavando i reni con PBS attraverso l'aorta addominale di un ratto anestetizzato. A tale scopo, collegare un catetere in tubo di polietilene a una pompa per siringa riempita con PBS.

Tagliare la pelle e la parete addominale lungo la linea mediana addominale e spostare gli organi addominali con bastoncini di cotone per accedere all'aorta discendente con le arterie mesenteriche e celiache ramificate. Successivamente, posizionare il primo legaccio intorno alle arterie mesenteriche e celiache e il secondo legaccio intorno all'aorta, sotto il diaframma.

Separare delicatamente l'aorta ADOS mediante dissezione ottusa, recidendo i tessuti connettivi circostanti con pinze. Quindi posizionare il terzo legaccio circa tre millimetri al di sotto dell'arteria renale sinistra e il quarto legaccio al di sopra della biforcazione delle arterie iliache. Annodare il quarto legaccio e applicare una pinza vascolare sull'aorta tra l'arteria renale sinistra e il terzo legaccio.

Eseguire un'incisione tra la pinza e la quarta legatura per cateterizzare l'aorta. Quindi utilizzare la terza legatura per fissare saldamente il catetere. A questo punto, rimuovere la pinza.

Assicurarsi che il polso sanguigno sia visibile nel catetere per verificare un'installazione corretta. Quindi iniziare la perfusione e stringere la prima e la seconda legatura. Successivamente, tagliare rapidamente la vena renale sinistra per alleviare la pressione.

Continuare a lavare per uno o due minuti fino a quando gli organi non risultino completamente sbiancati. Successivamente, recidere i vasi sanguigni renali, l'uretra e i tessuti connettivi e adiposi circostanti. Per asportare i reni, praticare una piccola incisione nella capsula renale ed estrarre i reni rimuovendo la capsula.

Quindi posizionare i reni in PBS freddo di ghiaccio. Successivamente, preparare chip di vetro coprioggetti di cinque millimetri per cinque millimetri e di 25 millimetri per 25 millimetri rivestiti con poli-L-lisina.

Tagliare i reni con una lametta lungo il piano frontale in fette spesse da uno a due millimetri. Quindi posizionare una delle fette sotto un microscopio stereoscopico. Individuare i cisti, che appaiono come cavità di forma rotonda, utilizzando pinzette a punta fine.

Dissezionare lo strato epiteliale interno di un cisto il più sottile possibile per ottenere un'area monolayer. Successivamente, attaccarlo a un chip di vetro ricoperto di polilisina ed esporre il lato apicale dei cisti verso l'alto. Per consentire l'accesso delle pipette per l'elettrofisiologia, riempire la camera per patch clamp con soluzione da bagno. Trasferire quindi il chip di vetro coperto con i tessuti isolati nella camera.

Selezionare una cellula nel monostrato epiteliale e avvicinare una tipica membrana con una pipetta per il patch. Successivamente, eseguire un esperimento convenzionale di patch clamp in modalità cell attached. In questa procedura, posizionare i cisti isolati e i tubuli divisi in una piastra di tre centimetri e mezzo contenente PSS, aggiungere flu a cinque micromolar, otto HD e acido 0,05%onico per favorire la dispersione degli acetil metil esteri.

Quindi proteggere il campione dalla luce e incubare su un agitatore lento a temperatura ambiente per 30-40 minuti. Dopo l'incubazione, rimuovere il mezzo di incubazione con PSS pulito. Successivamente, posizionare il tessuto sotto un microscopio confocale per eseguire ulteriori analisi di imaging a fluorescenza.

Accendere il software di acquisizione confocale. Successivamente, accendere il laser ad argon a 488 nanometri di eccitazione e regolare l'emissione a 520 su 25 nanometri. Quindi localizzare il tessuto in campo chiaro in un secondo momento.

Monitorare la fluorescenza di flu oh otto H nel campione di tessuto con una frequenza di 0,25 hertz o superiore. Applicare TP o altri modulatori farmacologici per indurre un aumento della concentrazione di calcio intracellulare. Qui vengono mostrati i tracciati di corrente rappresentativi dell'attività del canale del sodio epiteliale misurata in patch cellula-attaccata di cisti frescamente isolate da ratti PCK di 16 settimane dopo il trattamento con benzoyl e acqua potabile per 12 settimane.

Le linee tratteggiate indicano rispettivamente lo stato attuale, con C e op n che denotano gli stati chiuso e aperto. Questo grafico riassume l'attività osservata del canale del sodio epiteliale, nella quale il benzoyl, un inibitore selettivo del canale del sodio epiteliale, ha ridotto significativamente l'attività del canale del sodio epiteliale. Questo video mostra il monocstrato cistico carico con flu oh otto H prima e dopo l'applicazione di 10 micromolare di a TP. L'aumento dell'intensità del segnale fluorescente verde è visibile quando la concentrazione intracellulare di calcio aumenta in risposta all'a TP. Questo grafico riassume l'effetto dell'a TP sui livelli di calcio nella cellula.

Un monolayer di ratti PCK sottoposto all'applicazione di un TP mostra un rapido aumento del livello di calcio intracellulare, che ritorna al livello basale entro due o tre minuti. Questa tecnica offre un'opportunità unica per monitorare i cambiamenti nel flusso di calcio e nell'attività dei canali del ferro nei reni cistici. Oltre alla caratterizzazione dell'attività del canale del sodio cellulare e dell'ingresso di calcio nei ratti PCK, questo approccio può essere utilizzato per analizzare altri canali del ferro in diversi modelli di A-R e A-D-P-K-D.