Implementazione Patch Clamp e vivo microscopia a fluorescenza per il monitoraggio delle proprietà funzionali di recente isolato PKD Epithelium

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di registrare l'attività del singolo canale e di misurare le variazioni di concentrazione intracellulare di calcio in monostrati cistici appena isolati da modelli di roditori di malattia renale policistica. Ciò si ottiene lavando prima i reni rec PCK attraverso l'aorta addominale al fine di rimuovere il sangue dai tessuti renali. Il secondo passo consiste nell'isolare il monostrato epiteliale delle cisti.

Successivamente, il monostrato isolato può essere utilizzato per le registrazioni convenzionali di patch clamp dei canali ionici nelle membrane apicali delle cellule epiteliali. Il tessuto isolato può essere utilizzato anche per il caricamento con coloranti calcici. Per quantificare le variazioni della concentrazione intracellulare di calcio nelle cellule epiteliali.

Questi parametri misurati nell'ambiente nativo delle cisti possono essere confrontati con i tubuli sani al fine di studiare il processo di agenesia delle cisti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di studiare l'attività del canale del chi e il flusso di calcio nelle cisti renali. Questa analisi fornisce dati fisiologicamente irrilevanti ottenuti da tessuti appena isolati.

Con questo approccio, possiamo monitorare l'attività di un singolo canale negli epiteli appena isolati. È un metodo unico perché può essere utilizzato per caratterizzare con precisione il comportamento dei canali di ferro utilizzando diverse modifiche della tecnica del cerotto. Siamo in grado di testare la risposta del canale a vari farmaci in vasche cistiche e sane.

Il monostrato di cisti appena isolato può essere utilizzato per l'imaging intracellulare del calcio. Questa tecnica consente lo screening farmacologico e gli studi funzionali dell'omeostasi intracellulare del calcio nelle cellule cistiche, cioè di essere mezzi importanti per scoprire nuovi trattamenti per la prevenzione della malattia del rene policistico. La cura del sangue mostrerà l'approccio chirurgico utilizzato per liberare i reni dal sangue.

Verranno mostrate prima le procedure di isolamento del rene e delle cisti. Inizia questa procedura eseguendo una laparotomia e lava i reni con PBS attraverso l'aorta addominale di un ratto anestetizzato. A tale scopo, collegare un catetere tubolare in polietilene a una pompa a siringa riempita di PBS.

Tagliare la pelle e la parete addominale lungo la linea mediana addominale e spostare gli organi addominali con tamponi di cotone per accedere all'aorta discendente con le arterie mesenteriche e celiache ramificate. Successivamente si posiziona la prima legatura attorno alle arterie mesenterica e celiaca e la seconda legatura attorno all'aorta. Sotto il diaframma.

Separare delicatamente l'aorta ADOS con una smussatura, sezionando i tessuti connettivi circostanti all'interno di una pinza. Quindi posizionare la terza legatura a circa tre millimetri sotto l'arteria renale sinistra e la quarta legatura sopra la biforcazione delle arterie iliache. Legare la quarta legatura e fissare una pinza per vasi attorno all'aorta tra l'arteria renale sinistra e la terza legatura.

Praticare un'incisione tra la pinza e la quarta legatura per cateterizzare l'aorta. Quindi utilizzare la terza legatura per fissare saldamente il catetere. Ora, rilascia il morsetto.

Assicurarsi che il polso sanguigno sia visibile nel catetere per garantire una corretta installazione. Quindi inizia la profusione e lega la prima e la seconda legatura. Successivamente, tagliare rapidamente la vena renale sinistra per alleviare la pressione.

Continua a sciacquare per uno o due minuti fino a quando gli organi non sono completamente sbollentati. Blanc. Successivamente, tagliare i vasi sanguigni renali, l'uretra e i tessuti connettivi e adiposi circostanti. Per asportare i reni, fare una breve lacerazione nella capsula renale e sbucciare i reni per incapsularli.

Quindi metti i reni in PBS ghiacciato. Quindi, prepara cinque per cinque millimetri e 25 per 25 millimetri. Coprire le scaglie di vetro rivestite con poli L lisina.

Tagliare i reni con una lama di rasoio lungo il piano frontale in fette spesse uno o due millimetri. Quindi posizionare una delle fette sotto uno stereomicroscopio. Individua le cisti, che appaiono come cavità di forma rotonda usando una pinza a punta fine.

Sezionare lo strato epiteliale interno di una cisti il più sottile possibile per ottenere un'area monostrato. Successivamente, attaccalo a un chip di vetro ricoperto di polilisina ed esponi le cisti con il lato apicale rivolto verso l'alto Per fornire l'accesso alle pipette per eseguire l'elettrofisiologia, riempire la camera del morsetto del cerotto con la soluzione del bagno. Quindi trasferire il chip di vetro di copertura con i tessuti isolati nella camera.

Selezionare una cellula nel monostrato epiteliale e avvicinarsi a una membrana tipica con una pipetta patch. Successivamente, condurre un esperimento di patch clamp convenzionale in modalità cell attachment. In questa procedura, posizionare le cisti isolate e dividere i tubuli aperti in un piatto di tre centimetri e mezzo contenente PSS, aggiungere cinque micromolari di influenza, otto HD e acido onico allo 0,05% per aiutare a disperdere l'aceto in methles.

Quindi proteggere il campione dalla luce e incubare su un agitatore lento a temperatura ambiente per 30-40 minuti. Dopo l'incubazione, lavare il terreno di incubazione con PSS pulito. Quindi posizionare il tessuto sotto un microscopio confocale per eseguire ulteriormente l'imaging a fluorescenza.

Attivare il software di acquisizione confocale. Successivamente accendere il laser ad argon a 488 nanometri di eccitazione e regolare l'emissione a 520 su 25 nanometri. Quindi individua il tessuto in campo chiaro in seguito.

Monitorare la fluorescenza dell'influenza o otto H nel campione di tessuto con una frequenza di 0,25 hertz o superiore. Applicare un TP o altri modulatori farmacologici per indurre un aumento della concentrazione intracellulare di calcio. Qui sono mostrate le tracce attuali rappresentative dell'attività epiteliale del canale del sodio misurata in chiazze attaccate a cellule di cisti appena isolate da ratti PCK di 16 settimane dopo il trattamento con benzoile e acqua potabile per 12 settimane.

Le linee tratteggiate indicano il rispettivo stato corrente, mentre la C e l'op n indicano gli stati chiuso e aperto. Questo grafico riassume l'attività epiteliale del canale del sodio osservata in cui il benzoile, un inibitore selettivo del canale epiteliale del sodio, ha diminuito significativamente l'attività del canale epiteliale del sodio. Questo video mostra il monostrato cistico caricato con influenza oh otto H prima e dopo l'applicazione di 10 micromolari a TP. L'aumento dell'intensità del segnale fluorescente verde può essere visto quando la concentrazione intracellulare di calcio aumenta in risposta a un TP. Questo grafico riassume l'effetto di un TP sui livelli di calcio nella cellula.

L'applicazione di un TP provoca un rapido aumento del livello intracellulare di calcio, che ritorna al livello basale entro due o tre minuti. Questa tecnica offre un'opportunità unica per monitorare i cambiamenti nel flusso di calcio e nell'attività dei canali del ferro nei reni cistici. Oltre a caratterizzare l'attività del canale cellulare del sodio e l'afflusso di calcio nei tassi di PCK, questo approccio può essere utilizzato per analizzare altri canali del ferro in più modelli AR e A-D-P-K-D.