Layer-by-layer collagene Deposizione nel Microfluidic Dispositivi per microtessuto Stabilizzazione
29 settembre 2015
La creazione di microtessuti funzionali all'interno di dispositivi microfluidici richiede la stabilizzazione dei fenotipi cellulari adattando le tecniche tradizionali di coltura cellulare alle limitate dimensioni spaziali dei microdispositivi. La modifica del collagene consente la deposizione strato per strato di assemblaggi di collagene ultrasottili in grado di stabilizzare le cellule primarie, come gli epatociti, come modelli di tessuto microfluidico.
L'obiettivo generale di questa procedura è depositare un sottile strato di collageno sulle cellule all'interno di un dispositivo microfluidico. Questo risultato si ottiene innanzitutto modificando il collagene nativo acidificato mediante metilazione, per generare molecole di collagene con carica netta positiva. Il secondo passaggio consiste nella modifica del collagene nativo acidificato mediante ation, al fine di creare molecole di collagene con carica netta negativa.
Successivamente, i dispositivi microfluidici vengono preparati e seminati con epatociti, che vengono lasciati aderire e diffondersi per tutta la notte. L'ultimo passaggio consiste nel depositare l'assemblaggio di collagene esponendo alternativamente le cellule a soluzioni di collagene cariche positivamente e negativamente, al fine di creare 10 bicouche di collagene sopra lo strato cellulare. Infine, la microscopia in fase e in immunofluorescenza, insieme ai saggi di albumina e urea, vengono utilizzate per dimostrare lo sviluppo e il mantenimento della polarità cellulare e della funzione secretoria.
I principali vantaggi di questa tecnica sono che permettono la coltura di epatociti in dispositivi microfluidici utilizzando metodi simili a quelli impiegati nelle colture su piastre da oltre 20 anni. Non richiede progettazioni complesse dei dispositivi e la matrice depositata è molto sottile, dell'ordine di 100 nanometri. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo durante una sessione di brainstorming su come tradurre le tecniche di coltura cellulare della classe Capy dalle piastre ai dispositivi microfluidici.
Il metodo sandwich al collagene funziona in sistemi microscopici con superficie aperta, ma gli idrogeli utilizzati sono incompatibili con dispositivi microfluidici chiusi dotati di canali con altezza limitata. Diluire 100 milligrammi di una soluzione acida di collagene nativo fino a una concentrazione di 0,5 milligrammi per millilitro con acqua sterile fredda di ghiaccio e porre la soluzione sul ghiaccio per prevenire l'aggregazione. Successivamente, regolare il pH della soluzione di collagene tra 9 e 10 aggiungendo alcune gocce di idrossido di sodio 1 N e mescolare delicatamente la soluzione a temperatura ambiente per 30 minuti.
Quando il collagene precipita, la soluzione inizierà a diventare torbida; centrifugare la soluzione di collagene precipitato a 3000 ×g per 25 minuti. Successivamente, dovrebbe essere visibile un precipitato chiaro di aspetto gelatinoso sul fondo delle provette; aspirare il soprannatante ed quindi risospendere il collagene precipitato in 200 millilitri di metanolo con acido cloridrico 0,1 N. Lasciare avvenire la reazione di metilazione sotto agitazione a temperatura ambiente per quattro giorni. Dopo la metilazione, centrifugare la soluzione a 3000 ×g per 25 minuti per raccogliere il collagene metilato in pellet, quindi aspirare e smaltire il soprannatante di metanolo acidificato. Successivamente, sciogliere il collagene metilato in 25 millilitri di PBS sterile e filtrare la soluzione attraverso un setaccio cellulare da 60 micron.
Regolare il pH della soluzione a 7,3-7,4 utilizzando incrementi di 20 microlitri di idrossido di sodio 1N. Valutare la concentrazione della soluzione di collagene mediante un kit commerciale per collagene da ratto ELIZA o un kit per saggio dell'idrossiprolina. Successivamente, diluire la soluzione a tre milligrammi per millilitro con PBS sterile.
Sterilizzare la soluzione di collagene metilato trasferendola in un flacone di vetro con tappo a vite. Aggiungere con attenzione tre millilitri di cloroformio sul fondo del flacone e lasciare in posa tutta la notte a quattro gradi Celsius. La mattina seguente.
In modo asettico, rimuovere lo strato superiore di collagene metilato. Conservare il collagene a quattro gradi Celsius e utilizzarlo entro un mese. Diluire altri 100 milligrammi di soluzione acida nativa di collagene fino a una concentrazione di 0,5 milligrammi per millilitro con acqua sterile fredda di ghiaccio e porre la soluzione sul ghiaccio per prevenire la denaturazione; come mostrato in precedenza, aggiustare il pH della soluzione di collagene con idrossido di sodio e agitare la soluzione a temperatura ambiente per far precipitare il collagene.
Successivamente, sciogliere 40 milligrammi di anidride esaciclica in 10 millilitri di acetone. Aggiungere lentamente questa miscela alla soluzione di collagene in incrementi di 0,5 millilitri, mescolando e monitorando continuamente il pH della soluzione. Mantenere il pH superiore a 9,0 aggiungendo una o due gocce di idrossido di sodio 1 N quando il pH si avvicina a 9,0, continuando a mescolare a temperatura ambiente per 120 minuti.
Dopo aver aggiunto tutte e sei le soluzioni di cianuro e idruro, osservare che la miscela diventa limpida man mano che il collagene succinato si dissolve; continuare a verificare periodicamente il pH per assicurarsi che rimanga superiore a 9,0. Quando tutto il collagene succinato si è disciolto, regolare il pH della soluzione a 4,0 aggiungendo incrementi di 20 microlitri di acido cloridrico 1 N. Osservare che la soluzione torna a diventare torbida man mano che il collagene succinato precipita.
Successivamente, centrifugare la soluzione a 3000 ×g per 25 minuti. Per raccogliere il pellet di collagene succinilato e smaltire il surnatante acidificato, sciogliere il collagene succinilato con pipettaggi ripetuti in 25 millilitri di PBS sterile, ottenendo una concentrazione finale di circa 3 milligrammi per millilitro. Quindi, filtrare la soluzione attraverso un filtro cellulare da 60 micron e successivamente regolare il pH della soluzione tra 7,3 e 7,4.
Utilizzando incrementi di 20 microlitri di idrossido di sodio normale, valutare la concentrazione della soluzione mediante un kit ELISA commerciale per collagene di ratto o un kit per saggio dell'idrossiprolina. Successivamente, diluire la soluzione fino a tre milligrammi per millilitro. Sterilizzare questa soluzione di collagene utilizzando PBS sterile, nello stesso modo utilizzato per la soluzione di collagene metilato.
Cominciare fabbricando un dispositivo microfluidico utilizzando una tecnica standard che presenti camere per coltura cellulare con canali alti 100 micrometri, larghi da 0,4 a 1,5 millimetri e lunghi da uno a 10 millimetri per la crescita cellulare. Utilizzare un pulitore al plasma per ossidare le superfici del dispositivo e di un vetrino. Quindi premere i due insieme per formare un legame.
Dopo aver sterilizzato il dispositivo esponendolo alla luce UV per almeno 30 minuti, riempire la camera con 15 microgrammi per millilitro di fibronectina in PBS sterile e incubare a 37 gradi Celsius per 45 minuti. Successivamente, vedere il dispositivo con le cellule come descritto nel protocollo testuale allegato.
In una cappa a flusso laminare per colture cellulari, preparare volumi sufficienti di soluzioni di collagene metilato e desmetilato per 10 applicazioni di ciascuna soluzione per dispositivo, oltre a qualche millilitro aggiuntivo di mezzo. Mantenere le soluzioni in ghiaccio. Alternare il lavaggio dei dispositivi con 20 microlitri di soluzione di collagene metilato e poi con soluzione di collagene desmetilato.
Attendere un minuto tra ogni applicazione. Sciacquare il dispositivo un totale di 10 volte per ogni soluzione. Lavorare rapidamente per ridurre al minimo il tempo in cui le cellule sono prive di mezzo durante la formazione degli strati di collagene; è possibile osservare il collagene accumularsi lentamente all'ingresso e all'uscita del dispositivo microfluidico.
Se la resistenza al flusso del liquido aumenta, risciacquare il dispositivo una o due volte con del mezzo e quindi continuare la stratificazione. Dopo aver applicato tutti gli strati, risciacquare il dispositivo due volte con mezzo fresco e riposizionarlo nell'incubatrice. La metilazione e l'acetilazione modificano le caratteristiche di carica delle molecole di collagene.
La funzionalizzazione elimina i gruppi carichi positivamente e li sostituisce con gruppi carichi negativamente, mentre la metilazione rimuove i gruppi carichi negativamente, generando molecole con carica netta positiva, consentendo così un deposito strato dopo strato delle due varianti di collagene su superfici cariche come le cellule. Epatociti primari seminati su vetro rivestito di fibronettina all'interno di un dispositivo microfluidico possono essere ricoperti con questo metodo strato dopo strato. L'assemblaggio della matrice di collagene, con il deposito di 10 bilayer sulle cellule, crea uno spessore dello strato di collagene di circa 140 nanometri negli epatociti privi di un rivestimento superiore di collagene strato dopo strato.
Le matrici perdono il loro fenotipo differenziato, si contraggono e si staccano dalla superficie dei dispositivi microfluidici nel tempo. Al contrario, gli epatociti ricoperti da un assemblaggio di collagene ultra sottile mantengono la loro morfologia differenziata, una vitalità superiore al 90% e una polarizzazione per oltre 14 giorni. Oltre alla vitalità cellulare, alla morfologia e alla polarizzazione, la tecnica del collagene strato dopo strato recupera e stabilizza anche la funzione degli epatociti primari, come indicato qui. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come metilare e succinilare il collagene per creare soluzioni di collagene con carica netta positiva e negativa e di come utilizzarle nella deposizione strato dopo strato per creare assemblaggi di collagene sottili sulla superficie delle cellule nei dispositivi microfluidici.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo studio si concentra sul deposito di un sottile strato di collagene su cellule all'interno di un dispositivo microfluidico per stabilizzare i fenotipi cellulari. Il metodo prevede la modifica del collagene per creare molecole cariche positivamente e negativamente, che vengono depositate in modo alternato per formare una struttura multistrato.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microfluidica
- Coltura cellulare
- Ingegneria tissutale
Sfondo
- I microtessuti sono essenziali per imitare le funzioni degli organi.
- La stabilizzazione dei fenotipi cellulari è fondamentale nelle applicazioni microfluidiche.
- Il collagene è un componente chiave nell'ingegneria tissutale.
- Le tecniche di deposizione strato dopo strato migliorano la funzionalità cellulare.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per il deposito dell'assemblaggio del collagene in dispositivi microfluidici.
- Stabilizzare cellule primarie come gli epatociti per la modellizzazione dei tessuti.
- Valutare la polarità cellulare e le funzioni secretorie dopo il deposito.
Metodi Utilizzati
- Modificazione del collagene nativo mediante metilazione e azione.
- Preparazione di dispositivi microfluidici e semina con epatociti.
- Deposizione stratificata del collagene esponendo alternativamente le cellule a soluzioni cariche.
- Utilizzo di microscopia a contrasto di fase e immunofluorescenza, insieme a saggi di albumina e urea.
Risultati principali
- Deposizione riuscita di 10 bicapati di collagene su epatociti.
- Dimostrato il mantenimento della polarità cellulare.
- Confermata la funzione secretoria degli epatociti mediante saggi.
- Visualizzata l'integrità strutturale mediante tecniche microscopiche.
Conclusioni
- Il metodo stabilizza efficacemente i fenotipi cellulari nei microdispositivi.
- Il deposito stratificato di collagene migliora la funzionalità del modello tissutale.
- Questo approccio può essere applicato ad altri tipi cellulari per diverse applicazioni.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Stabilizzare la morfologia e la funzione degli epatociti primari in dispositivi microfluidici rimane una sfida fondamentale per la modellizzazione del tessuto epatico e gli studi sul metabolismo dei farmaci. Questa tecnica di deposizione del collagene strato dopo strato consente la coltura a lungo termine di microtessuti creando matrici ultraterne e biocompatibili che riproducono aspetti chiave della matrice extracellulare nativa. Sostenendo fenotipi differenziati per oltre 14 giorni, il metodo migliora l'affidabilità predittiva dei saggi preclinici basati sugli epatociti, riducendo la variabilità biologica che potrebbe compromettere l'identificazione dei composti promettenti e i risultati dei test di sicurezza.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'analisi di vie specifiche degli epatociti mantenendo una morfologia polarizzata e una funzione secretoria essenziali per la validazione degli obiettivi nei modelli di malattie epatiche.
- Valore operativo: Riduce la deriva fenotipica durante la coltura, aumentando la riproducibilità dei parametri funzionali utilizzati per ridurre i rischi associati a ipotesi meccanicistiche.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce piattaforme microfluidiche standardizzate rivestite con collagene che supportano saggi quantitativi di albumina e urea per lo screening coerente di composti.
- Valore operativo: Compatibile con i flussi di lavoro esistenti per la fabbricazione di dispositivi microfluidici, consentendo un'integrazione scalabile in sistemi automatizzati di screening senza la necessità di una complessa riprogettazione del dispositivo.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Mantiene la differenziazione e la funzionalità degli epatociti per due settimane, sostenendo la continuità preclinica dalle fasi di scoperta a quelle di tossicologia.
- Valore operativo: Estende la finestra temporale utile per la valutazione longitudinale dei biomarcatori di danno epatico indotto da farmaci (DILI) nei modelli di tessuto microfluidici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso della scoperta poiché consente colture stabili di epatociti che supportano lo sviluppo di saggi nelle fasi iniziali e la validazione preclinica di terapie mirate al fegato.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi preservando la polarità e la funzionalità degli epatociti, elementi fondamentali per valutare l'interazione con il bersaglio nelle vie metaboliche.
- Screening: Fornisce letture quantitative e riproducibili mediante la secrezione di albumina e urea, facilitando la valutazione affidabile di composti in formati di microtessuti.
- Analisi: Genera parametri funzionali che consentono il confronto incrociato dello stato di salute e dell'attività metabolica degli epatociti in diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega la fase di scoperta a quella preclinica stabilizzando i fenotipi necessari per la modellizzazione di rilevanza patologica.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta una tecnica adattabile di modifica superficiale applicabile su diverse piattaforme microfluidiche e tipi cellulari.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva grazie al mantenimento del fenotipo e della funzione degli epatociti differenziati per periodi di coltura prolungati.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità mediante strati ultrasottili di collagene depositati con precisione, che riducono al minimo la variabilità tra lotti.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo riducendo i falsi negativi derivanti da cellule dedifferenziate nei test di tossicità epatica.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione dei candidati aggiustata per il rischio, basata su letture funzionali stabili e a lungo termine ottenute da modelli epatici microfluidici.
Considerazioni sull'implementazione
- È richiesta competenza nella chimica del collagene e nella preparazione di dispositivi microfluidici per i passaggi di metilazione e succinazione.
- È necessario avere accesso a infrastrutture per la centrifugazione, il controllo del pH e la filtrazione sterile per effettuare la modifica del collagene.
- La standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro dipende da tempi di stratificazione e manipolazione delle soluzioni costanti, al fine di garantire un deposito uniforme del film sottile.
- L'adattamento ad altri tipi cellulari richiede la validazione della compatibilità del collagene e dell'impatto sulla stabilità del fenotipo.
- I limiti pratici includono l'incompatibilità dei gel idratati con dispositivi microfluidici chiusi dotati di altezze di canale limitate, come indicato nella fonte.
