Name: Layer-by-layer collagene Deposizione nel Microfluidic Dispositivi per microtessuto Stabilizzazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Scopri la deposizione layer-by-layer di collagene in dispositivi microfluidici per stabilizzare fenotipi cellulari. Questa tecnica alterna molecole di collagene caricate positivamente e negativamente per creare strati sottili su epatociti primari.

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Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del National Institutes of Health, tra cui una sovvenzione del consorzio di sistemi microfisiologici dal National Center for Advancing Translational Sciences (UH2TR000503), una borsa di studio post-dottorato Ruth L. Kirschstein National Research Service Award (F32DK098905 per WJM) e un premio pathway to independence (DK095984 per AB) dal National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases.

1. Preparazione della soluzione nativa Solubile Collagene <ol><li> Preparare o acquistare 200 mg di acidificato, solubile, collagene di tipo I da code di ratto a 1-3 mg / ml utilizzando i protocolli di isolamento standard, come riportato da Piez et al. 15 </li><li> Scalare la quantità di materiale di partenza in base al volume finale desiderato soluzioni collagene modificati. Circa fare 25-30 ml di metilato e 25-30 ml di soluzione di collagene succinilate, ciascuno a 3 mg / ml, da 200 mg di collagene nativo solubile. </li></ol> 2. Collagene metilazione <ol><li> Diluire 100 mg del, acidificata (pH 2-3) soluzione di collagene nativo ad una concentrazione di 0,5 mg / ml con ghiaccio acqua sterile fredda e mantenere la soluzione in ghiaccio per evitare la gelificazione. </li><li> Regolare il pH della soluzione di collagene di 9-10 con poche gocce di NaOH 1 N e agitare a temperatura ambiente per 30 min. Osservare il precipitato collagene, causando la soluzione per diventare torbida. </li&gt; <li> Spin giù la soluzione di collagene precipitato a 3.000 g per 25 min. Un chiaro, precipitato gelatinoso dovrebbe essere visibile nel fondo delle provette. Aspirare e smaltire il liquido surnatante. </li><li> Risospendere il precipitato collagene in 200 ml di metanolo con HCl 0,1 N e lasciare che la reazione di metilazione di verifica con agitazione a temperatura ambiente per 4 giorni. Il collagene non si dissolvono, ma dovrebbe rompersi in pezzi molto piccoli visibili che renderanno la soluzione torbida. </li><li> Dopo la metilazione, centrifugare la soluzione a 3.000 × g per 25 minuti per far sedimentare il collagene denaturato. Aspirare e smaltire il surnatante metanolo acidificato. </li><li> Sciogliere il collagene metilata in 25 ml di PBS sterile, dando una concentrazione di circa 3 mg / ml, con pipettaggio ripetute, e filtrare la soluzione attraverso un colino cella di 60 micron. Regolare il pH della soluzione a 7,3-7,4 usando 20 ml incrementi di 1 N NaOH. </li><li> Valutare la concentration della soluzione con un commerciale collagene topo kit ELISA o kit di analisi idrossiprolina. Diluire la soluzione di 3 mg / ml con PBS sterile. </li><li> Sterilizzare la soluzione di collagene denaturato trasferendolo ad una bottiglia di vetro con tappo a vite, stratificazione accuratamente 3 ml di cloroformio sul fondo della bottiglia, consentono la bottiglia per impostare O / N a 4 ° C, e poi asetticamente rimuovere e conservare la strato superiore, che è il collagene denaturato. </li><li> Conservare la soluzione a 4 ° C per l&#39;uso entro 1 mese. </li></ol> 3. Il collagene succinilazione <ol><li> Diluire l&#39;altra 100 mg del, acidificata (pH 2-3) soluzione di collagene nativo ad una concentrazione di 0,5 mg / ml con ghiaccio acqua sterile fredda e mantenere la soluzione in ghiaccio per evitare la gelificazione. </li><li> Regolare il pH della soluzione di collagene di 9-10 con poche gocce di NaOH 1 N e agitare a temperatura ambiente per 30 min. Il collagene non precipitare, provocando la soluzione per diventare torbida. </li><li> Sciogliere 40 mg di succinico anidride (0,4 mg per mg di collagene) in 10 ml di acetone (1/20 il volume della soluzione di collagene). Lentamente (in circa 0,5 ml incrementi) aggiungere il composto alla soluzione di collagene sotto agitazione mentre continuo monitoraggio del pH. Mantenere il pH superiori a 9,0 aggiungendo 1 o 2 gocce di NaOH 1 N come il pH si avvicina 9,0. </li><li> Continua agitazione a temperatura ambiente per 120 minuti dopo l&#39;aggiunta di tutti i anidride succinica in acetone. Osservare la soluzione a diventare chiaro come il collagene succinilata dissolve. Controllare periodicamente il pH per garantire che rimanga sopra 9,0. </li><li> Regolare il pH della soluzione a 4,0 con 20 microlitri di 1 incrementi N HCl. Osservare la soluzione torbida di nuovo, come il collagene succinilata precipita. </li><li> Dopo la succinilazione, centrifugare la soluzione a 3.000 × g per 25 minuti per far sedimentare il collagene succinilata. Aspirare e smaltire il surnatante acidificato con reagito anidride succinica. </li><li> Sciogliere il collagene succinilatain 25 ml di PBS sterile, dando una concentrazione di circa 3 mg / ml, con pipettaggio ripetute, e filtrare la soluzione attraverso un colino cella di 60 micron. Regolare il pH della soluzione a 7,3-7,4 usando 20 ml incrementi di 1 N NaOH. </li><li> Valutare la concentrazione della soluzione con un commerciale topo collagene kit ELISA o kit di analisi idrossiprolina. Diluire la soluzione di 3 mg / ml con PBS sterile. </li><li> Sterilizzare la soluzione di collagene succinilata trasferendolo ad una bottiglia di vetro con tappo a vite, stratificazione accuratamente 3 ml di cloroformio sul fondo della bottiglia, consentono la bottiglia per impostare O / N a 4 ° C, e poi asetticamente rimuovere e conservare la strato superiore, che è il collagene succinilata. </li><li> Conservare la soluzione a 4 ° C per l&#39;uso entro 1 mese. </li></ol> 4. Verifica del collagene Modifiche <ol><li> Preparare 1 ml campioni da ciascuna delle soluzioni collagene nativo, metilato, e succinilate e diluire ad una concentration di 0,1 mg / ml con acqua pura sterile per ioni idrogeno titolazione. Diluire ulteriormente il buffer almeno 1.000 volte con la dialisi contro acqua attraverso un taglio di 10 kDa membraneusing 3 soluzione cambia per almeno 4 ore ciascuna. </li><li> Aggiustare il pH delle soluzioni a 7.3 con piccole quantità di NaOH e HCl. Utilizzando pH 7,3 come riferimento arbitraria, eseguire ione idrogeno titolazione su ciascuno dei campioni come descritto da Tanford 16 per creare curve di titolazione per le soluzioni collagene nativo, metilato, e succinilata. </li><li> Tracciare la variazione di pH per volume di acido aggiunto rispetto al numero di ioni per molecola H + bound. La gamma &quot;amino&quot; alto pH dovrebbe mostrare un cambiamento nel collagene succinilata verso il punto neutro (perdita di gruppi amminici), e il basso pH range &quot;carbossile&quot; dovrebbe mostrare uno spostamento verso sinistra del collagene denaturato (perdita di gruppi carbossilici ) e uno spostamento verso destra della collagene succinilata (un guadagno in gruppo carbossilicos), rispetto al collagene nativo. </li><li> Valutare l&#39;efficacia della reazione succinilazione determinando la% di gruppi amminici in collagene nativo sostituito da succinilazione utilizzando acido 2,4,6-trinitrobenzensulfonico (TNBA) metodo colorimetrico, seguendo protocolli standard 17,18. </li></ol> 5. Realizzazione di dispositivi Microfluidic e il seeding cellulare <ol><li> Realizzare dispositivi microfluidici utilizzando metodi standard di 9. Utilizzare replica stampaggio di PDMS da SU-8 master sul silicio definita utilizzando fotolitografia per creare microfluidica camere di coltura cellulare con 100 micron di altezza, 0,4-1,5 mm e 1-10 mm di lunghezza canali per la crescita delle cellule. </li><li> Utilizzare un detergente plasma per ossidare le superfici del dispositivo e un vetrino, quindi premere insieme al legame. Dopo la sterilizzazione del dispositivo per esposizione a luce UV per almeno 30 minuti, riempire la camera con 50 ug / ml di fibronectina in PBS sterile e incubare a 37 ° C per 45 min. </li&gt; <li> Inizializzare il dispositivo con le cellule, come ratto primaria o epatociti umani, che richiedono un gel di collagene per la stabilizzazione del fenotipo o stato di differenziazione. Usiamo 20 l di appena isolate di ratto primario epatociti 7,19 o disponibili in commercio crioconservati epatociti umani primari seminati a 14 × 10 6 cellule / ml al dispositivo. </li><li> Permettono alle cellule di allegare per 4-6 ore, e poi lavare le cellule non attaccati e sostituiscono i terreni in piastra con i media di crescita. Incubare O / N a garantire cella piena diffusione e creare un monostrato confluente di cellule. </li></ol> 6. strato per strato deposizione di collagene <ol><li> In una cappa coltura tissutale flusso laminare, preparare volumi sufficienti di soluzioni collagene denaturato e succinilate per 10 applicazioni di ciascuna soluzione per dispositivo, nonché alcuni ml di media. Mantenere le soluzioni su ghiaccio. Usiamo 20 l (10-15 volte il volume totale del dispositivo) di collagene per strato per dispositivo. </li><li> Esseresgranatura con la soluzione di metilato (policationico), si alternano gli scarichi dei dispositivi con 20 ml di metilato e poi succinilata soluzioni di collagene, in attesa 1 minuto tra ogni applicazione. Lavare il dispositivo per un totale di 10 volte al di soluzione, che dovrebbe durare circa 20 minuti. Lavorare velocemente per minimizzare la quantità di tempo le cellule sono prive di mezzi. </li><li> Osservare collagene lentamente accumularsi in ingresso / uscita in funzione della sua dimensione. Se la resistenza al flusso fluido aumenta, a filo il dispositivo una o due volte con i media, e poi continuare stratificazione. </li><li> Dopo aver applicato tutti gli strati, sciacquare il dispositivo due volte con mezzi freschi e ritornare alla incubatore. A seconda del tipo di cellula, i cambiamenti morfologici extracellulare dalla matrice, ad esempio maggiore polarizzazione in epatociti, dovrebbero essere visibili entro poche ore. </li><li> Preparare dispositivi rappresentativi per microscopia elettronica a trasmissione utilizzando metodi standard 9 per verificare la presenza di una matrice di collagenemontaggio sulla parte superiore delle cellule in coltura. </li></ol> 7. Stabilizzazione del fenotipo delle cellule e funzione <ol><li> Immagine la morfologia cellulare, la vitalità, e la polarità utilizzando metodi standard per il tipo di cella. Per epatociti, raccogliere le immagini più di 14 giorni utilizzando la microscopia di fase, LIVE / colorazione MORTO per la vitalità, e CMFDA tintura per la polarizzazione apicale per dimostrare gli effetti della deposizione di collagene. </li><li> Per morfologia cellulare, lavare il dispositivo attraverso l&#39;ingresso da pipetta con 20 ml di PBS per sciacquare, iniettare 20 ml di PBS, e l&#39;immagine del dispositivo tramite microscopio a contrasto di fase. </li><li> Per LIVE / colorazione MORTO, lavare il dispositivo attraverso l&#39;ingresso da pipetta con 20 ml di PBS per lavare, iniettare 20 ml di soluzione colorante LIVE / MORTO con DAPI preparati secondo le istruzioni del produttore, incubare per 30 minuti a 37 ° C, lavare il Dispositivo di nuovo con 20 ml di PBS, e l&#39;immagine del dispositivo tramite microscopia a fluorescenza. </li><li> Per bile canalicolorazione culi, lavare il dispositivo attraverso l&#39;ingresso da pipetta con 20 ml di PBS per sciacquare, iniettare 20 ml di 2 soluzione colorante mM CMFDA con DAPI preparati secondo le istruzioni del produttore, incubare per 30 minuti a 37 ° C, lavare il dispositivo di nuovo con 20 ml di PBS, e l&#39;immagine del dispositivo usando la microscopia a fluorescenza. </li><li> Raccogliere i media spesi e misurare prodotti metabolici cellulari in appositi punti di tempo per tutta la durata della cultura per determinare la funzione delle cellule. Per epatociti, misurare la quantità di albumina e urea nei media spesi. </li><li> Effettuare analisi funzionali endpoint sulle cellule stesse, come la valutazione dei livelli degli enzimi di attività, colorazione degli anticorpi, o analisi di RNA. Per epatociti, indurre e misurare le attività enzimatici del citocromo P450 o di fase II coniugazione enzima glutatione S-transferasi. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ultrasottili assiemi collagene puro possono essere depositati su cellule caricate o superfici dei materiali utilizzando deposizione layer-by-layer di collageni modificati. I risultati di questo studio dimostrano che la metilazione e succinilazione di collagene nativo creare soluzioni collagene policationici e polianionici (Figura 1) che può essere utilizzato con la tecnica layer-by-layer depositare assiemi matrice di collagene ultrasottili sulle cellule (Figura 2) o altro addebitate sup...

Sebbene la microfluidica consenta un controllo squisito del microambiente cellulare, la coltura di cellule, in particolare cellule primarie, all'interno di dispositivi microfluidici può essere impegnativa. Molte tecniche tradizionali di coltura cellulare sono state sviluppate per sostenere e stabilizzare la funzione cellulare quando vengono coltivate in piastre di coltura tissutale, ma tradurre tali tecniche in dispositivi microfluidici è spesso difficile. 
Una di queste tecniche è la coltura di cellule sopra o inserite tra gel di collagene come modello dell'ambiente cellulare 3D fisiologico. 1 Il collagene di tipo I è una delle proteine più utilizzate per le applicazioni di biomateriali grazie alla sua ubiquità nella matrice extracellulare, all'abbondanza naturale, ai robusti siti di adesione cellulare e alla biocompatibilità. 2 Molte cellule beneficiano della coltura 3D con collagene, tra cui le cellule tumorali3,45, le cellule endoteliali microvascolari6 e gli epatociti7. Mentre l'uso di gel di collagene è facile in formati aperti, come le piastre di coltura tissutale, le dimensioni limitate del canale e la natura chiusa dei dispositivi microfluidici rendono l'uso di liquidi che gelificano senza bloccare l'intero canale.
Per superare questo problema, abbiamo combinato la tecnica di deposizione strato per strato8 con modifiche chimiche di soluzioni di collagene nativo per creare assemblaggi di collagene ultrasottili sopra le cellule coltivate in dispositivi microfluidici. Questi strati possono stabilizzare la morfologia e la funzione cellulare in modo simile ai gel di collagene e possono essere depositati sulle cellule in dispositivi microfluidici senza ostruire i canali con matrice polimerizzata. L'obiettivo di questo metodo è modificare il collagene nativo per creare soluzioni di collagene policationico e polianionico e stabilizzare le cellule in coltura microfluidica depositando sottili assemblaggi di matrice di collagene sulle cellule. Questa tecnica è stata utilizzata per stabilizzare la morfologia e la funzione degli epatociti primari in dispositivi microfluidici. 9
Sebbene la deposizione strato per strato sia stata precedentemente riportata con polielettroliti naturali e sintetici10 per coprire gli epatociti nella coltura su piastra11,12 e come strato di semina per gli epatociti nei dispositivi microfluidici13,14, questo metodo descrive la deposizione di uno strato di collagene puro sopra gli epatociti, imitando le tecniche di coltura del collagene 3D. In questo protocollo, utilizziamo gli epatociti come cellule di esempio che possono essere mantenute utilizzando strati di collagene 3D. I molti altri tipi di cellule che beneficiano della coltura 3D nel collagene possono allo stesso modo beneficiare della coltura dopo la deposizione strato per strato di un assemblaggio di matrice di collagene ultrasottile.

<table><tbody><tr><td>collagene di tipo I, coda di ratto</td><td>Life Technologies</td><td>A1048301</td><td>opzione per collagene concentrato di coda di ratto</td></tr><tr><td>collagene di tipo I, coda di ratto</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td>opzione per collagene concentrato di coda di ratto</td></tr><tr><td>collagene di tipo I, coda di ratto</td><td>EMD Millipore</td><td>08-115</td><td>opzione per collagene concentrato di coda di ratto</td></tr><tr><td>collagene di tipo I, coda di ratto</td><td>R%D Systems</td><td>3440-100-01</td><td>opzione per anidride</td></tr><tr><td>succinica</td> concentrata di collagene di coda di ratto <td>Sigma-Aldrich</td><td>239690-50G</td><td>reagente di succinilazione</td></tr><tr><td>metanolo anidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322415-100ML</td><td>reagente di metilazione</td></tr><tr><td>idrossido di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td>Reagente di precipitazione del pH</td></tr><tr>acido<td>cloridrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331-500ML</td><td>Reagente per precipitazione del pH</td></tr><tr><td>collagene di ratto di tipo I ELISA</td><td>Chondrex</td><td>6013</td><td>opzione per rilevare il contenuto di collagene</td></tr><tr><td>kit di dosaggio dell'idrossiprolina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK008-1KT</td><td>opzione per il rilevamento del contenuto di collagene</td></tr><tr><td>kit di dosaggio dell'idrossiprolina</td><td>Quickzyme Biosciences</td><td>QZBtotcol1</td><td>opzione per il rilevamento del contenuto di collagene</td></tr></tbody></table>

layer-by-layer collagene deposizione nel microfluidic dispositivi per microtessuto stabilizzazione

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Sebbene la microfluidica fornisca un controllo squisito del microambiente cellulare, la coltura di cellule all'interno di dispositivi microfluidici può essere challenging. 3D la coltura di cellule in gel di collagene di tipo I aiuta a stabilizzare la morfologia e la funzione cellulare, necessaria per la creazione di modelli di tessuto microfluidico nei microdispositivi. La traduzione delle tradizionali tecniche di coltura 3D per piastre di coltura tissutale in dispositivi microfluidici è spesso difficile a causa delle dimensioni limitate dei canali. In questo metodo, descriviamo una tecnica per modificare il collagene nativo di tipo I per generare soluzioni di collagene policationico e polianionico che possono essere utilizzate con la deposizione strato per strato per creare assemblaggi di collagene ultrasottili sopra le cellule coltivate in dispositivi microfluidici. Questi sottili strati di collagene stabilizzano la morfologia e la funzione cellulare, come dimostrato utilizzando gli epatociti primari come cellula di esempio, consentendo la coltura a lungo termine di microtessuti in dispositivi microfluidici.

Collagene nativo può essere modificato con metilazione e succinilazione per creare soluzioni di collagene policationici e polianionici per l&#39;uso in strato per strato di deposizione. Succinilazione modifica i gruppi ε-amino di collagene nativo con gruppi succinil e metilazione modifica i gruppi carbossilici di collagene nativo con un gruppo metilico (Figura 1A). Queste modifiche alle catene laterali di aminoacidi della proteina collagene alterano le curve di titolazione del pH per le soluzioni. Succi...

La creazione di microtessuti funzionali all'interno di dispositivi microfluidici richiede la stabilizzazione dei fenotipi cellulari adattando le tecniche tradizionali di coltura cellulare alle limitate dimensioni spaziali dei microdispositivi. La modifica del collagene consente la deposizione strato per strato di assemblaggi di collagene ultrasottili in grado di stabilizzare le cellule primarie, come gli epatociti, come modelli di tessuto microfluidico.

Layer-by-layer collagene Deposizione nel Microfluidic Dispositivi per microtessuto Stabilizzazione

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

L'obiettivo generale di questa procedura è depositare un sottile strato di collageno sulle cellule all'interno di un dispositivo microfluidico. Questo risultato si ottiene innanzitutto modificando il collagene nativo acidificato mediante metilazione, per generare molecole di collagene con carica netta positiva. Il secondo passaggio consiste nella modifica del collagene nativo acidificato mediante ation, al fine di creare molecole di collagene con carica netta negativa.Successivamente, i dispositivi microfluidici vengono preparati e seminati con epatociti, che vengono lasciati aderire e diffondersi per tutta la notte. L'ultimo passaggio consiste nel depositare l'assemblaggio di collagene esponendo alternativamente le cellule a soluzioni di collagene cariche positivamente e negativamente, al fine di creare 10 bicouche di collagene sopra lo strato cellulare. Infine, la microscopia in fase e in immunofluorescenza, insieme ai saggi di albumina e urea, vengono utilizzate per dimostrare lo sviluppo e il mantenimento della polarità cellulare e della funzione secretoria.I principali vantaggi di questa tecnica sono che permettono la coltura di epatociti in dispositivi microfluidici utilizzando metodi simili a quelli impiegati nelle colture su piastre da oltre 20 anni. Non richiede progettazioni complesse dei dispositivi e la matrice depositata è molto sottile, dell'ordine di 100 nanometri. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo durante una sessione di brainstorming su come tradurre le tecniche di coltura cellulare della classe Capy dalle piastre ai dispositivi microfluidici.Il metodo sandwich al collagene funziona in sistemi microscopici con superficie aperta, ma gli idrogeli utilizzati sono incompatibili con dispositivi microfluidici chiusi dotati di canali con altezza limitata. Diluire 100 milligrammi di una soluzione acida di collagene nativo fino a una concentrazione di 0,5 milligrammi per millilitro con acqua sterile fredda di ghiaccio e porre la soluzione sul ghiaccio per prevenire l'aggregazione. Successivamente, regolare il pH della soluzione di collagene tra 9 e 10 aggiungendo alcune gocce di idrossido di sodio 1 N e mescolare delicatamente la soluzione a temperatura ambiente per 30 minuti.Quando il collagene precipita, la soluzione inizierà a diventare torbida; centrifugare la soluzione di collagene precipitato a 3000 ×g per 25 minuti. Successivamente, dovrebbe essere visibile un precipitato chiaro di aspetto gelatinoso sul fondo delle provette; aspirare il soprannatante ed quindi risospendere il collagene precipitato in 200 millilitri di metanolo con acido cloridrico 0,1 N. Lasciare avvenire la reazione di metilazione sotto agitazione a temperatura ambiente per quattro giorni. Dopo la metilazione, centrifugare la soluzione a 3000 ×g per 25 minuti per raccogliere il collagene metilato in pellet, quindi aspirare e smaltire il soprannatante di metanolo acidificato. Successivamente, sciogliere il collagene metilato in 25 millilitri di PBS sterile e filtrare la soluzione attraverso un setaccio cellulare da 60 micron.Regolare il pH della soluzione a 7,3-7,4 utilizzando incrementi di 20 microlitri di idrossido di sodio 1N. Valutare la concentrazione della soluzione di collagene mediante un kit commerciale per collagene da ratto ELIZA o un kit per saggio dell'idrossiprolina. Successivamente, diluire la soluzione a tre milligrammi per millilitro con PBS sterile.Sterilizzare la soluzione di collagene metilato trasferendola in un flacone di vetro con tappo a vite. Aggiungere con attenzione tre millilitri di cloroformio sul fondo del flacone e lasciare in posa tutta la notte a quattro gradi Celsius. La mattina seguente.In modo asettico, rimuovere lo strato superiore di collagene metilato. Conservare il collagene a quattro gradi Celsius e utilizzarlo entro un mese. Diluire altri 100 milligrammi di soluzione acida nativa di collagene fino a una concentrazione di 0,5 milligrammi per millilitro con acqua sterile fredda di ghiaccio e porre la soluzione sul ghiaccio per prevenire la denaturazione; come mostrato in precedenza, aggiustare il pH della soluzione di collagene con idrossido di sodio e agitare la soluzione a temperatura ambiente per far precipitare il collagene.Successivamente, sciogliere 40 milligrammi di anidride esaciclica in 10 millilitri di acetone. Aggiungere lentamente questa miscela alla soluzione di collagene in incrementi di 0,5 millilitri, mescolando e monitorando continuamente il pH della soluzione. Mantenere il pH superiore a 9,0 aggiungendo una o due gocce di idrossido di sodio 1 N quando il pH si avvicina a 9,0, continuando a mescolare a temperatura ambiente per 120 minuti.Dopo aver aggiunto tutte e sei le soluzioni di cianuro e idruro, osservare che la miscela diventa limpida man mano che il collagene succinato si dissolve; continuare a verificare periodicamente il pH per assicurarsi che rimanga superiore a 9,0. Quando tutto il collagene succinato si è disciolto, regolare il pH della soluzione a 4,0 aggiungendo incrementi di 20 microlitri di acido cloridrico 1 N. Osservare che la soluzione torna a diventare torbida man mano che il collagene succinato precipita.Successivamente, centrifugare la soluzione a 3000 ×g per 25 minuti. Per raccogliere il pellet di collagene succinilato e smaltire il surnatante acidificato, sciogliere il collagene succinilato con pipettaggi ripetuti in 25 millilitri di PBS sterile, ottenendo una concentrazione finale di circa 3 milligrammi per millilitro. Quindi, filtrare la soluzione attraverso un filtro cellulare da 60 micron e successivamente regolare il pH della soluzione tra 7,3 e 7,4.Utilizzando incrementi di 20 microlitri di idrossido di sodio normale, valutare la concentrazione della soluzione mediante un kit ELISA commerciale per collagene di ratto o un kit per saggio dell'idrossiprolina. Successivamente, diluire la soluzione fino a tre milligrammi per millilitro. Sterilizzare questa soluzione di collagene utilizzando PBS sterile, nello stesso modo utilizzato per la soluzione di collagene metilato.Cominciare fabbricando un dispositivo microfluidico utilizzando una tecnica standard che presenti camere per coltura cellulare con canali alti 100 micrometri, larghi da 0,4 a 1,5 millimetri e lunghi da uno a 10 millimetri per la crescita cellulare. Utilizzare un pulitore al plasma per ossidare le superfici del dispositivo e di un vetrino. Quindi premere i due insieme per formare un legame.Dopo aver sterilizzato il dispositivo esponendolo alla luce UV per almeno 30 minuti, riempire la camera con 15 microgrammi per millilitro di fibronectina in PBS sterile e incubare a 37 gradi Celsius per 45 minuti. Successivamente, vedere il dispositivo con le cellule come descritto nel protocollo testuale allegato.In una cappa a flusso laminare per colture cellulari, preparare volumi sufficienti di soluzioni di collagene metilato e desmetilato per 10 applicazioni di ciascuna soluzione per dispositivo, oltre a qualche millilitro aggiuntivo di mezzo. Mantenere le soluzioni in ghiaccio. Alternare il lavaggio dei dispositivi con 20 microlitri di soluzione di collagene metilato e poi con soluzione di collagene desmetilato.Attendere un minuto tra ogni applicazione. Sciacquare il dispositivo un totale di 10 volte per ogni soluzione. Lavorare rapidamente per ridurre al minimo il tempo in cui le cellule sono prive di mezzo durante la formazione degli strati di collagene; è possibile osservare il collagene accumularsi lentamente all'ingresso e all'uscita del dispositivo microfluidico.Se la resistenza al flusso del liquido aumenta, risciacquare il dispositivo una o due volte con del mezzo e quindi continuare la stratificazione. Dopo aver applicato tutti gli strati, risciacquare il dispositivo due volte con mezzo fresco e riposizionarlo nell'incubatrice. La metilazione e l'acetilazione modificano le caratteristiche di carica delle molecole di collagene.La funzionalizzazione elimina i gruppi carichi positivamente e li sostituisce con gruppi carichi negativamente, mentre la metilazione rimuove i gruppi carichi negativamente, generando molecole con carica netta positiva, consentendo così un deposito strato dopo strato delle due varianti di collagene su superfici cariche come le cellule. Epatociti primari seminati su vetro rivestito di fibronettina all'interno di un dispositivo microfluidico possono essere ricoperti con questo metodo strato dopo strato. L'assemblaggio della matrice di collagene, con il deposito di 10 bilayer sulle cellule, crea uno spessore dello strato di collagene di circa 140 nanometri negli epatociti privi di un rivestimento superiore di collagene strato dopo strato.Le matrici perdono il loro fenotipo differenziato, si contraggono e si staccano dalla superficie dei dispositivi microfluidici nel tempo. Al contrario, gli epatociti ricoperti da un assemblaggio di collagene ultra sottile mantengono la loro morfologia differenziata, una vitalità superiore al 90% e una polarizzazione per oltre 14 giorni. Oltre alla vitalità cellulare, alla morfologia e alla polarizzazione, la tecnica del collagene strato dopo strato recupera e stabilizza anche la funzione degli epatociti primari, come indicato qui. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come metilare e succinilare il collagene per creare soluzioni di collagene con carica netta positiva e negativa e di come utilizzarle nella deposizione strato dopo strato per creare assemblaggi di collagene sottili sulla superficie delle cellule nei dispositivi microfluidici.

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