Layer-by-layer collagene Deposizione nel Microfluidic Dispositivi per microtessuto Stabilizzazione

L'obiettivo generale di questa procedura è depositare un sottile assemblaggio di collagene sulle cellule in un dispositivo microfluidico. Ciò si ottiene modificando prima il collagene nativo acidificato attraverso la metilazione per creare molecole di collagene cariche positivamente nette. Il secondo passo consiste nel modificare il collagene nativo acidificato attraverso l'azione per creare molecole di collagene caricate negativamente nette.

Successivamente, i dispositivi microfluidici vengono preparati e seminati con epatociti, che possono attaccarsi e diffondersi durante la notte. Il passaggio finale consiste nel depositare l'assemblaggio di collagene esponendo alternativamente le cellule alle soluzioni di collagene caricate positivamente e negativamente per creare 10 doppi strati di collagene sopra lo strato cellulare. Infine, la microscopia di fase e immunofluorescenza e i saggi di albumina e urea vengono utilizzati per mostrare lo sviluppo e il mantenimento della polarità cellulare e della funzione secretoria.

I principali vantaggi di questa tecnica sono che consente la coltura di epatociti in microdispositivi utilizzando tecniche simili a quelle applicate nelle colture su piastra da oltre 20 anni. Non richiede progettazioni complesse di dispositivi e la matrice depositata è molto sottile, dell'ordine di 100 nanometri. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta durante un brainstorming su come tradurre le tecniche di coltura cellulare Capy di classe da piastre a dispositivi microfluidici.

I metodi del sandwich di collagene funzionano in sistemi microscopici aperti, ma gli idrogel utilizzati sono incompatibili con micro dispositivi chiusi con altezze di canale limitate. Diluire 100 milligrammi di una soluzione di collagene acidificato nativo a una concentrazione di 0,5 milligrammi per millilitro con ghiaccio, acqua fredda e sterile e mettere la soluzione sul ghiaccio per evitare l'alazione. Quindi, regolare il pH della soluzione di collagene tra nove e 10 con alcune gocce di un normale idrossido di sodio e mescolare delicatamente la soluzione a temperatura ambiente per 30 minuti.

Man mano che il collagene precipita, la soluzione inizierà a diventare torbida, centrifugare la soluzione di collagene precipitato che 3000 volte G per 25 minuti. Successivamente, un precipitato gelatinoso trasparente dovrebbe essere visibile sul fondo delle provette, aspirare lo snat, e quindi risospendere il collagene precipitato in 200 millilitri di metanolo con 0,1 acido cloridrico normale consentire la reazione di metilazione mentre si mescola a temperatura ambiente per quattro giorni dopo la centrifuga di metilazione, la soluzione a 3000 volte G per 25 minuti per pellettare il collagene metilato, Quindi aspirare e smaltire il metanolo supinato acidificato. Successivamente, sciogliere il collagene metilato in 25 millilitri di PBS sterile e filtrare la soluzione attraverso un colino cellulare da 60 micron.

Regolare il pH della soluzione da 7,3 a 7,4 utilizzando incrementi di 20 microlitri di un normale idrossido di sodio. Valutare la concentrazione della soluzione di collagene utilizzando un kit ELIZA di collagene per ratti o un kit per il dosaggio dell'idrossiprolina. Quindi diluire la soluzione a tre milligrammi per millilitro con PBS sterile.

Sterilizzare la soluzione di collagene metilato trasferendola in una bottiglia di vetro con tappo a vite. Stratificare con cura tre millilitri di cloroformio sul fondo della bottiglia e lasciare che la bottiglia si solidifichi per una notte a quattro gradi Celsius. La mattina dopo.

Asetticamente, rimuovere lo strato superiore di collagene metilato. Conserva il collagene metilato a quattro gradi Celsius e usalo entro un mese. Diluire altri 100 milligrammi di soluzione di collagene acidificato nativo a una concentrazione di 0,5 milligrammi per millilitro con ghiaccio, acqua fredda e sterile e posizionare la soluzione sul ghiaccio per prevenire la dazione come mostrato in precedenza, regolare il pH della soluzione di collagene con idrossido di sodio e mescolare la soluzione a temperatura ambiente per far precipitare il collagene.

Successivamente, sciogliere 40 milligrammi di anidride cinica in 10 millilitri di acetone. Aggiungere lentamente questa miscela con incrementi di 0,5 millilitri alla soluzione di collagene, mescolando e monitorando continuamente il pH della soluzione. Mantenere il pH al di sopra di 9,0 aggiungendo una o due gocce di un normale idrossido di sodio quando il pH si avvicina a 9,0, agitando continuamente a temperatura ambiente per 120 minuti.

Dopo aver aggiunto tutte le sei soluzioni ciniche e idruri, osservare la miscela diventare chiara man mano che il collagene succinato si dissolve, continuare a controllare periodicamente il pH per assicurarsi che rimanga superiore a 9,0. Quando tutto il collagene succinato si è dissolto, regolare il pH della soluzione a 4,0 utilizzando incrementi di 20 microlitri di un normale acido cloridrico. Osservare la soluzione, diventare di nuovo torbida mentre il collagene succinato precipita.

Quindi centrifugare la soluzione a 3000 volte G per 25 minuti. Per pellettare il collagene succinato, seppellire e smaltire la stecca acidificata con anidride snic non reattiva, sciogliere il collagene succinato con pipettaggio ripetuto in 25 millilitri di PBS sterile, ottenendo una concentrazione finale di circa tre milligrammi per millilitro. Quindi filtrare la soluzione attraverso un colino cellulare da 60 micron, quindi regolare il pH della soluzione tra 7,3 e 7,4.

Utilizzando incrementi di 20 microlitri di un normale idrossido di sodio, valutare la concentrazione della soluzione utilizzando un kit ELIZA di collagene per ratto commerciale o un kit per il dosaggio dell'idrossiprolina. Quindi diluire la soluzione a tre milligrammi per millilitro. Utilizzando PBS sterile, sterilizzare questa soluzione di collagene allo stesso modo della soluzione di collagene metilato.

Inizia fabbricando un dispositivo microfluidico utilizzando una tecnica standard che dispone di camere di coltura cellulare con canali di altezza da 100 micron, larghi da 0,4 a 1,5 millimetri e lunghi da uno a 10 millimetri per la crescita cellulare. Utilizzare un detergente al plasma per ossidare le superfici del dispositivo e un vetrino. Quindi premere i due insieme per formare un legame.

Dopo aver sterilizzato il dispositivo mediante esposizione alla luce UV per almeno 30 minuti. Riempire la camera con 15 microgrammi per millilitro, fibronectina in PBS sterile e incubare a 37 gradi Celsius per 45 minuti. Quindi, vedere il dispositivo con le celle come descritto nel protocollo di testo allegato.

In una cappa di coltura tissutale a flusso laminare, preparare volumi sufficienti di soluzioni di collagene metilato e acato per 10 applicazioni di ciascuna soluzione per dispositivo, oltre a pochi millilitri estremi di terreno. Mantieni le soluzioni in ghiaccio. Lavare alternativamente i dispositivi con 20 microlitri di soluzioni di collagene metilato e poi ato.

Attesa di un minuto tra ogni applicazione. Sciacquare il dispositivo un totale di 10 volte per soluzione. Lavora rapidamente per ridurre al minimo la quantità di tempo in cui le cellule rimangono senza terreno mentre crescono gli strati di collagene, è possibile osservare il collagene accumularsi lentamente all'ingresso e all'uscita del dispositivo microfluidico.

Se la resistenza al flusso del fluido aumenta, sciacquare il dispositivo una o due volte con il fluido e quindi continuare a stratificare. Dopo aver applicato tutti gli strati, sciacquare il dispositivo due volte con un terreno fresco e rimetterlo nell'incubatrice. La metilazione e l'azione alterano le caratteristiche di carica delle molecole di collagene.

La metilazione rimuove i gruppi caricati positivamente e li sostituisce con gruppi caricati negativamente, mentre la metilazione rimuove i gruppi caricati negativamente, creando molecole nette caricate positivamente, consentendo la deposizione strato per strato delle due varianti di collagene sopra le superfici cariche come le cellule. Gli epatociti primari seminati su vetro rivestito di fibronectina all'interno di un dispositivo microfluidico possono essere rivestiti con questo strato per strato. L'assemblaggio della matrice di collagene, la deposizione di 10 doppi strati sulle cellule crea uno spessore dello strato di collagene di circa 140 nanometri di epatociti senza un collagene superiore strato per strato.

Le matrici perdono il loro contratto fenotipico differenziato e si sollevano dalla superficie dei dispositivi microfluidici nel tempo. Al contrario, gli epatociti ricoperti da un assemblaggio di collagene ultra sottile mantengono la loro morfologia differenziata, una vitalità superiore al 90% e una polarizzazione nell'arco di 14 giorni. Oltre alla morfologia e alla polarizzazione della vitalità cellulare, la tecnica del collagene strato per strato recupera e stabilizza anche la funzione degli epatociti primari come indicato qui, Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come metilare e succinare il collagene per creare soluzioni di collagene caricate positivamente e negativamente e come usarle nella deposizione strato per strato per creare sottili assemblaggi di collagene sopra le cellule in dispositivi microfluidici.