Ingegneria 3D Cellularized collagene Gel per Vascolare Rigenerazione Tissutale

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ingegnerizzare costrutti tubulari per la rigenerazione del tessuto vascolare. Ciò si ottiene combinando prima il collagene di tipo uno e le cellule muscolari lisce in geometria cilindrica con l'uso di una tecnica di stampaggio. Il secondo passo consiste nel far maturare il costrutto in un bioreattore statico appositamente progettato.

Successivamente, i costrutti maturi vengono raccolti con cura e le cellule endoteliali vengono posizionate sul lume del costrutto utilizzando un attore bioreattore a parete rotante. Infine, vengono eseguiti istologia, saggi metabolici e test meccanici per valutare le proprietà di questi costrutti tubulari. L'originalità di questa tecnica è che utilizza un solo passaggio per combinare cellule e collagene per produrre un costrutto di ingegneria tissutale con proprietà meccaniche mirate senza alcun trattamento fisico o chimico aggiuntivo.

Inoltre, la costruzione può essere facilmente manipolata grazie a morsetti appositamente progettati, che ne consentono la manipolazione e le maglie terminali. Questo metodo può fornire una visione dell'interazione tra le cellule e la matrice extracellulare durante la crescita e il rimodellamento per la rigenerazione del tessuto vascolare. Inoltre, può essere applicato per una serie di tessuti mirati, come tendini, innesti cutanei, cerotti cardiaci e sistema nervoso.

Per iniziare, fabbricare e assemblare il bioreattore statico come descritto nel protocollo di testo allegato, sono inclusi i dettagli sul serbatoio e la garza, la fabbricazione dell'impugnatura, il tappo del mandrino e l'assemblaggio dello stampo dell'alloggiamento e le tecniche di sterilizzazione. Successivamente, espandere le cellule muscolari lisce dell'aorta suina in un pallone di coltura tissutale di 175 centimetri quadrati fino a quando non sono confluenti al 90%. Utilizzando tecniche di coltura standard, raccogliere le cellule e quindi risospenderle a 4 milioni di cellule per millilitro in un terreno di coltura completo.

Quindi, combinare una parte di soluzione tampone, due parti di soluzione di collagene sterile a quattro grammi per litro e una parte di sospensione cellulare. In questo ordine, misurare il pH della miscela e assicurarsi che sia compreso tra pH 7,0 e 7,4. Quindi versare delicatamente la miscela di collagene cellulare nel complesso di stampi di alloggiamento assemblato.

Assicurati che non ci siano bolle d'aria nella miscela. Lasciare riposare il gel di collagene a temperatura ambiente per un'ora in un ambiente sterile. Dopo un'ora, rimuovere il tubo di alloggiamento e trasferire con cura il costrutto nel serbatoio contenente 35 millilitri di terreno di coltura preriscaldato.

Incubare il costrutto in posizione verticale per una o due settimane di maturazione statica. Cambiare il terreno di coltura ogni due giorni aspirando il vecchio terreno dalla porta del setto inferiore e riempiendo nuovamente il serbatoio con una quantità equivalente di coltura fresca. Medio. Se lo si desidera, raccogliere un millilitro di terreno di coltura vecchio e fresco a ogni scambio di terreni per l'analisi biochimica ogni ora per le prime 12 ore e successivamente ogni 24 ore.

Rimuovere il costrutto dal terreno di coltura in condizioni sterili e posizionarlo ortogonalmente nel percorso di un interferometro laser a scansione per misurare lo spessore del costrutto dopo una o due settimane di maturazione statica. Trasferire il bioreattore in una cappa di coltura cellulare e rimuovere delicatamente il costrutto dal suo mandrino. Una volta libero, metterlo in una piastra di Petri di 100 millimetri di diametro contenente 40 millilitri di terreno di coltura fresco.

Successivamente, installa un tester micromeccanico dotato di una cella di carico da 5 a 10 Newton e impugnature che si estendono in un bagno di PBS mantenuto a 37 gradi Celsius. Rimuovere il costrutto dalla sua capsula di Petri e collegarlo a dispositivi di presa specializzati per test longitudinali e progettati per connettersi alla parte di garza del costrutto senza schiacciare il gel. Utilizzare del nastro di teflon per evitare lo scivolamento dei dispositivi di presa durante il test.

Quindi montare il costrutto sul tester micromeccanico. Successivamente, eseguire un test di fatica in direzione longitudinale allungando prima il costrutto alla sua lunghezza di riferimento iniziale e tenendolo premuto per 10 minuti. Quindi applicare 30 cicli di deformazione ciclica del 10% a una velocità del 5% al secondo.

Aumentare la deformazione con incrementi del 10% di deformazione ciclica fino a quando il campione non riesce a eseguire i test in direzione circonferenziale. Prima sezione del campione in costruzioni ad anello lunghe 10 millimetri. Quindi montare gli anelli su barre di acciaio inossidabile utilizzate al posto delle impugnature.

Come per i test di direzione longitudinale, per prima cosa, allungare il costrutto alla sua lunghezza di riferimento iniziale e tenerlo lì per 10 minuti. Quindi, applicare 30 cicli di una deformazione ciclica del 10% a una velocità del 5% al secondo. Una volta che il costrutto è maturato ed è stato rimosso dal mandrino, fissare il costrutto che entrambe le estremità sono al serbatoio e posizionarlo nel gruppo del serbatoio.

Come illustrato di seguito. Riempi l'esterno del serbatoio con 30 millilitri di coltura. Medio. Quindi, riempire il 75% del volume luminale del costrutto con una miscela di proteine, quindi chiudere entrambe le estremità del costrutto.

Per evitare qualsiasi perdita della soluzione proteica, posizionare il bioreattore all'interno di un incubatore e ruotare il bioreattore a 4,02 volte 10 rispetto al negativo cinque GForce per un'ora per rivestire la superficie luminale con proteine mentre il lumino viene rivestito. Raccogliere le cellule umane della vena ombelicale e tial coltivate con tecniche standard quando sono al 90% confluenti Resus sospendere le cellule e integrare il terreno di coltura M1 99. Successivamente, osserva la vena ombelicale umana e le cellule uroteliali nel lume del costrutto.

Con una densità di 1000 cellule per centimetro quadrato, chiudere gli arti superiori del costrutto per evitare perdite della soluzione cellulare. Incubare i costrutti ospitati nella coltura del bioreattore a parete rotante per due giorni a una rotazione costante di 4,02 volte 10 rispetto alla forza negativa di 5G. Durante la maturazione statica dei costrutti dei vasi, il diametro esterno delle strutture di risalita cellulare si è rapidamente ridotto.

Come mostrato qui, il diametro dei costrutti si è ridotto del 60% del loro valore iniziale nel primo giorno di coltura statica. Entro il settimo giorno, i costrutti si erano ridotti di quasi l'85%Sia i cicli di deformazione longitudinale che circonferenziale dei costrutti seguivano le proprietà viscoelastiche tipiche dei costrutti a base di collagene. Nel complesso, i costrutti erano più forti in direzione longitudinale rispetto alla direzione circonferenziale allo stesso intervallo di deformazione, la colorazione con tricone di Massen eseguita sui costrutti endoteliali ha mostrato un endotelio altamente omogeneo.

Le cellule muscolari lisce mostravano una morfologia a forma di fuso e apparivano disperse in modo omogeneo attraverso la parete, mentre le cellule endoteliali apparivano ben distribuite sul lato luminale. Dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori in biomeccanica e medicina rigenerativa per esplorare il comportamento meccanico dei tessuti ingegnerizzati e nativi.

Dopo aver visto questo video, dovresti ora avere una buona comprensione di come i costrutti vascolari possono essere rapidamente ingegnerizzati ma e infine diventare abbastanza forti da essere maneggiati e utilizzati per il condizionamento meccanico in un atore dinamico. Speriamo che i nostri sforzi e risultati vi abbiano convinto dell'alto potenziale delle cellule nel modello di matrice extracellulare per lo sviluppo di tessuti biologici funzionali.