Name: Ingegneria 3D Cellularized collagene Gel per Vascolare Rigenerazione Tissutale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Scopri la fabbricazione rapida di tessuti vascolari cellularizzati combinando collagene, cellule muscolari lisce ed endoteliali in un bioreattore statico. Questo metodo offre proprietà meccaniche mirate per la rigenerazione tissutale.

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Questa ricerca è stata finanziata dalla Scienze Naturali e ingegneria Research Council del Canada, Canadian Institute for Health Research e il Québec Research Center CHU de.

1. Realizzazione e montaggio del Static bioreattore <ol><li> Realizzazione della Riserva <ol><li> Preparare 50 ml provette da centrifuga da serbatoio per mezzo di coltura del bioreattore. </li><li> Fare due porte perforando due 5 mm Diametri fori a 20 mm dal fondo e la parte superiore del serbatoio, rispettivamente. Quindi inserire due raccordi luer in 5 millimetri tubi lunghezza di silicone. Press-Fit questi raccordi luer attraverso i fori, e sigillare tutte le connessioni con la colla silicone medicale. </li><li> Inserire un filtro nell&#39;attacco superiore del serbatoio (Figura 1A) 0,22 micron. </li><li> Inserire un setto luer nell&#39;attacco inferiore del serbatoio (Figura 1A). </li></ol></li><li> Assemblea Mandrino-cap <ol><li> Praticare un foro di diametro di 4,5 mm a centro del tappo ventilato del tubo serbatoio senza danneggiare la membrana del filtro che copre i fori di aerazione. </li><li> Preparare una ancoretta (diametro = 4.5 mm, lunghezza = 100 mm) Come un mandrino per il costrutto. </li><li> Preparare due tappi conici in silicone (lunghezza = 10 mm, con diametro medio foro = 4.5 mm). </li><li> Assemblare il mandrino ed il tappo (complesso mandrino-cap) come descritto nella Figura 1B. <ol><li> Press-montare il mandrino nel foro. Inserire i 2 tappi sul mandrino in modo che il tappo è montato tra loro. Regolare la posizione del mandrino in modo che la sua lunghezza utile è di 78 mm. </li><li> Applicare un primer e poi colla silicone di grado medico alle superfici che saranno in contatto prima di unirsi al tappo e tappi conici in silicone insieme. Rimuovere la colla in eccesso sul tappo. </li></ol></li><li> Lasciare asciugare a temperatura ambiente per 1-3 giorni. </li></ol></li><li> Realizzazione della garza-grip <ol><li> Preparare 3 tubi silicone (tubo 1: diametro interno = 6,4 millimetri, lunghezza = 5 millimetri; tubo 2: diametro = 6,4 millimetri, lunghezza 10 mm, e tubo 3: diametro = 3,1 millimetri, lunghezza = 12 mm). </li><li> Assemblare i garza-grip come descrittod nella Figura 1C. <ol><li> Taglio tubo 1 longitudinalmente, e aprirlo su tubo 2. Bastone insieme con la colla siliconica. </li><li> Tagliare garza sterile chirurgica al 5 cm x 7 cm foglio, e poi rotolare ermeticamente la garza sul tubo 3 lungo il lato più lungo della garza. Inserire il tubo complesso 1-tubo 2 sopra la garza. </li><li> Aggiungere colla siliconica attaccare insieme la garza, il complesso tubo 1-tubo 2 e il tubo 3. Tagliare la garza ad una lunghezza di 8 mm. </li></ol></li></ol></li><li> Assemblaggio e sterilizzazione <ol><li> Montare il complesso mandrino-cap e la garza-grip come descritto nella Figura 2. <ol><li> Rivestire il mandrino con grasso grado medico (Figura 2A). Posizionare la garza-grip sul mandrino (Figura 2B). Distanza le impugnature al valore fisso di 35 mm l&#39;uno dall&#39;altro. </li><li> Preparare uno stampo tubolare rimuovendo la parte inferiore di una siringa da 10 ml usando una sega circolare (finale Lunghezza = 8 mm) ( <strong&gt; Figura 2B). </li></ol></li><li> Inserire lo stampo sul gruppo mandrino-cap garza impugnature attrezzato (complesso residenziale-stampo), lo snap-montaggio lo stampo sul tappo in silicone (Figura 2C). </li><li> Autoclave il serbatoio e il complesso residenziale-muffa. Nota: Fare attenzione a tenere il tappo in silicone saldamente quando si inserisce lo stampo per evitare il suo distacco. </li></ol></li></ol> 2. Ingegneria muscolatura liscia cellule costrutti basati su gel di collagene e Static Maturazione <ol><li> Ingegneria costrutti <ol><li> Expand suina aortica cellule muscolari lisce (pSMCs) in 175 cm 2 fiasche di coltura riempito con 20 ml di mezzo di coltura completo composto da Dulbecco Modified Eagle Medium supplementato con 10% (v / v) di siero di suini (PS), 10% (v / v ) di siero fetale bovino (FBS), 1% (v / v) di penicillina-streptomicina (pen-strep). </li><li> A ≈90% confluenza, staccare pSMCs (passaggio 2-4) rimuovendo il terreno di coltura dellapallone di pSMCs, aggiungendo 5 ml di soluzione di tripsina (1x in soluzione salina tamponata con fosfato, PBS), e incubando per 10 min (T = 37 ° C, 5% CO 2, 100% di umidità). </li><li> Risospendere le pSMCs ad una concentrazione di 4 x 10 6 cellule / ml in mezzo di coltura completo. </li><li> Preparare la soluzione di collagene come descritto in precedenza 10. <ol><li> Estrarre e raccogliere fasci di collagene da tendini coda di topo in una soluzione PBS. </li><li> Trasferire le fibre di collagene successivamente in acetone (5 min), isopropanolo al 70% (v / v) (5 min) e acido acetico (0,02 N, 48 hr, 4 ° C) soluzioni. </li><li> Miscela la soluzione viscosa e congelare a -20 ° C per 3 giorni. </li><li> Lyophilize la soluzione congelata per ottenere spugne di collagene. </li><li> Solubilizzare le spugne di collagene in soluzione di acido acetico (0,02 N) ad una concentrazione di 4 g / L e centrifugare a 29.581 g vigore per 45 min. </li><li> Sterilizzare la soluzione di collagene attraverso il processo di dialisi contro successive solutions di acido acetico (0,02 N, 1 ora), cloroformio 1% (v / v, 1 ora) e acido acetico (0,02 N, soluzione sterile cambiata ogni 2 giorni per 1 settimana). </li><li> Raccogliere la soluzione di collagene sterile (4 g / L) in una cappa sterile coltura cellulare. </li></ol></li><li> Preparare gel di collagene cellularized come mostrato in figura 3. <ol><li> Preparare 50 ml di soluzione tampone sterile miscelando 35 ml di DMEM (5x), 4 ml di HEPES (1 N), 3 ml di NaOH (1 N) in 8 ml di acqua deionizzata sterile. </li><li> Preparare cellule e la miscela di gel di collagene in un contenitore posto in ghiaccio mescolando 50% (v / v) di soluzione di collagene sterile (4 g / L di acido acetico 0,02 N) con il 25% (v / v) di soluzione tampone e il 25% (v / v) della sospensione di pSMCs in mezzo di coltura completo. </li></ol></li><li> Misurare il pH della miscela e accertarsi che sia compreso tra 7,0 e 7,4. </li><li> Versate delicatamente 9 ml di miscela di cellule-e-collagene nel complesso di cui sopra abitazioni / muffa (passo 1.4.3, figura 3A-B </strong&gt;). </li><li> Lasciare gel a temperatura ambiente per 1 ora sotto il cofano coltura cellulare (Figura 3B). </li></ol></li><li> Maturazione in Static bioreattore <ol><li> Rimuovere lo stampo (Figura 3C) e trasferire accuratamente il costrutto nel serbatoio, contenente 35 ml di terreno di coltura (Figura 3D). </li><li> Incubare il costrutto (T = 37 ° C, 5% CO 2, 100% di umidità) in posizione verticale per 1 o 2 settimane di maturazione statica. </li><li> Installare una telecamera web (sigillato per garantire l&#39;isolamento) all&#39;interno dell&#39;incubatrice davanti costrutto. </li><li> Modificare il terreno di coltura ogni 2 giorni aspirando il vecchio mezzo dalla porta luer setto e ri-riempire il serbatoio con una quantità equivalente di terreno di coltura fresco. </li></ol></li><li> Misurazione dello spessore e metabolica attività di SMC-collagene Gel a base di costrutti Durante Cultura Static <ol><li> Posizionare l&#39;interferometro laser a scansione nella cultu cellulareri cappuccio e capovolgere dalla verticale alla posizione orizzontale con una livella. </li><li> Trasferire il bioreattore nella cappa coltura cellulare e rimuovere il costrutto dal serbatoio. </li><li> Trasferire il costrutto (ancora montato sul mandrino) nel percorso del raggio laser, e posizionarlo strettamente ortogonalmente rispetto all&#39;asse del fascio (come mostrato nella Figura 4). </li><li> Leggere il valore visualizzato sullo schermo del laser interferometro scansione, corrispondente al diametro esterno del costrutto. </li><li> Calcolare lo spessore della parete del costrutto base al suo diametro esterno ed interno (cioè il diametro del mandrino). Nota: ripetere i passi 2.3.1 a 2.3.5 ogni ora per la prima 12 ore e poi ogni 24 ore. </li><li> Usare 1 ml del vecchio terreno di coltura (campionata quando si cambia il terreno di coltura, passo 2.2.4) per misurare le concentrazioni di lattato e glucosio con l&#39;analizzatore di gas nel sangue. </li><li> Usare 1 ml diterreno di coltura fresco come un livello base per le misure delle concentrazioni di glucosio e lattato 14. Nota: ripetere i passi 2.3.6 e 2.3.7 ogni 2 giorni dopo terreno di coltura che cambia. </li></ol></li><li> Costruire raccolta per ulteriori Ccharacterizations meccanica e biologica <ol><li> Dopo 1 o 2 settimane di stagionatura statica, trasferire il bioreattore statica nel cofano coltura cellulare. </li><li> Trasferire delicatamente il costrutto maturo dal suo mandrino (supplementare Video 1) ad una piastra di Petri da 100 mm contenenti 40 ml di terreno di coltura fresco (Figura 5 e Figura 7A). </li></ol></li></ol> 3. Caratterizzazione meccanica dei costrutti del longitudinali e circolari arrivarci <ol><li> Installare il set-up sperimentale costituito dal tester micromeccanica dotato di una cella di 5 o 10 N carico ed un bagno contenente PBS a 37 ° C per mantenere i campioni at condizioni pseudo-fisiologico (Figura 6). </li><li> Bilanciare la cella di carico e dell&#39;estensimetro. Nota: Balancing è una funzione integrata nel tester micromeccanica consiste nel ripristinare il valore di estensione visualizzato e il valore di carico visualizzato mentre nessun campione è montato sulla macchina. Questa funzione permette di definire il riferimento per entrambe le misure. </li><li> Montaggio dei costrutti tubolari sul dispositivo meccanico: direzione longitudinale. Nota: eseguire prove di fatica longitudinali direttamente sull&#39;intero costrutti tubolari. Uso interno incorporato dispositivi di presa per collegare le prese garza dei costrutti alla cella di carico e alla base della vasca PBS. <ol><li> Montare il tubolare costruire sui dispositivi di presa (Figura 7B), seguendo la procedura di raccolta (punto 2.4). </li><li> Avvolgere i dispositivi di presa e le impugnature garza insieme con nastro di teflon per evitare lo slittamento delle impugnature garza durante la prova.Montare il campione attraverso il tester micromeccanica (Figura 7C). </li></ol></li><li> Montaggio dei costrutti ad anello sul dispositivo meccanico: direzione circonferenziale. Nota: eseguire prove di fatica circonferenziali su provini a forma di anello sezionati dai costrutti tubolari. Utilizzare due barre di acciaio inossidabile come grip per fissare i campioni. <ol><li> Montare il tubolare costruire su un tubo di plastica come supporto contrassegnato con 5 lacune mm (Figura 7B), a seguito della raccolta (punto 2.4). </li><li> Tagliare 10 millimetri anelli dal costrutto tubolare. </li><li> Misurare la lunghezza del campione utilizzando un calibro a corsoio per le ulteriori analisi. </li><li> Montare il campione a forma di anello sulle barre di acciaio inossidabile del tester micromeccanica (Figura 7C). Assicurarsi di posizionare il campione al centro delle barre. Nota: Il tubo di plastica nel passo 3.4.1 e un sistema di taglio, come mostrato nella Figura 7B </strong&gt; vengono utilizzati per evitare danni al costrutto durante il taglio. </li></ol></li><li> Prova di fatica sul costrutti in senso longitudinale o circonferenziale. <ol><li> Allungare il costrutto alla sua lunghezza calibro iniziale. </li><li> Mantenere il costrutto in questa posizione per 10 min in un ambiente pseudo-fisiologico. </li><li> Applicare il 10% di deformazione ciclica della lunghezza del calibro iniziale (30 cicli) per la costruzione di 5% / sec velocità di deformazione. </li><li> Ripetere il punto 3.5.3 a passi incrementali di 10% di deformazione ciclica fino alla rottura del campione. Nota: L&#39;uso dell&#39;ambiente pseudo-fisiologico richiede tenendo conto della galleggiabilità e l&#39;inerzia del sistema di presa che influenzano la misura del carico applicato. </li><li> Registrare il fondo come segue: <ol><li> Spostare il telaio di carico per il tratto utile iniziale. </li><li> Ripetere la procedura 3.5.3 e 3.5.4 senza montato qualsiasi campione, e mantenendo i dispositivi di presa collegati alla cella di carico (solo 1 ciclo è requirosso). </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Luminal endotelizzazione di costrutti Nota: Dopo aver seguito il protocollo di raccolta (punto 2.4), i costrutti resistono gestione per essere montato nel bioreattore rotante a parete per l&#39;ulteriore endotelizzazione. <ol><li> Rotazione a parete Bioreattore design <ol><li> Praticare un foro di diametro di 4,5 mm a centro del tappo ventilato del tubo serbatoio senza danneggiare la membrana del filtro che copre i fori di aerazione. </li><li> Press-montare un mandrino (diametro = 4.5 mm, lunghezza = 40 mm) nel foro e fissare il mandrino come descritto al punto 1.1.2. </li><li> Preparare due supporto in silicone a forma di C per il diametro esterno costrutto = 14 millimetri; diametro interno = 8 mm). </li><li> Posizionare un motore in rotazione in una estremità del bioreattore rotante parete e un cuscinetto sull&#39;altra estremità (Figura 8B). </li></ol></li><li> Lumen endotelizzazione <ol><li> Espandere umbilic umanoal vena cellule endoteliali (HUVEC) in 25 cm 2 fiasche di coltura con 5 ml di mezzo di coltura M199 supplementato con 10% (v / v) PS, 10% (v / v) FBS, 1% (v / v) pen-strep in piastra di Petri all&#39;interno di un incubatore (T = 37 ° C, 5% CO 2, 100% di umidità) fino al 90% di confluenza. </li><li> Preparare 1,5 ml della soluzione di rivestimento proteine ​​al costrutto richiesto per l&#39;adesione cellulare ottimale diluendo la miscela di concentrato di proteine ​​a 10,5 ng / ml in endoteliale mezzo privo di siero coltura cellulare. </li><li> Misurare la lunghezza del costrutto utilizzando un calibro a corsoio. </li><li> Calcolare il volume luminale V e l&#39;area luminale A del costrutto come: V = D in 2 L / 4 e A = D a L, rispettivamente (dove D è il diametro interno corrispondente al diametro del mandrino, e L è la lunghezza del costrutto). </li><li> Posizionare il costrutto al centro del serbatoio seguendo la procedura di raccolta (sezione 2.4).Utilizzare il supporto in silicone a forma di C per fissare il costrutto a entrambe le estremità per il serbatoio (Figura 8A). </li><li> Riempire il serbatoio con 35 ml di terreno di coltura. </li><li> Riempire il 75% del volume calcolato luminale del costrutto (V) con la soluzione di rivestimento proteico preparato al punto 4.2.2. Chiudere entrambe le estremità del costrutto di evitare qualsiasi fuoriuscita della soluzione di rivestimento proteico (Figura 8A). </li><li> Montare il sistema di bioreattore rotante a parete all&#39;interno della cappa di coltura cellulare. </li><li> Posizionare il bioreattore a 37 ° C incubatore e avviare la rotazione del bioreattore a 4,02 x 10 -5 g forza per 1 ora per permettere il rivestimento luminale come mostrato in Figura 8B. </li><li> Aprire l&#39;estremità superiore del costrutto e aspirare la soluzione di rivestimento di proteine ​​dal lume. </li><li> Staccare HUVEC (passaggio 2-3) rimuovendo il terreno di coltura dal pallone di HUVEC e aggiungendo 3 ml della soluzione di tripsina (1x in PBS). IOncubate per 5 min (T = 37 ° C, 5% CO 2, 100% di umidità). </li><li> Risospendere le HUVEC ad una concentrazione di 4 x 10 6 cellule / ml in mezzo di coltura M199 integrato. </li><li> All&#39;interno del cofano coltura cellulare, sementi HUVEC nel lume del costrutto con una densità di 1.000 cellule / cm 2 15. Chiudere le estremità superiori del costrutto di evitare qualsiasi dispersione di soluzione HUVEC. </li><li> Incubare i costrutti (T = 37 ° C, 5% CO 2, 100% di umidità) ospitato nel bioreattore rotante parete (Figura 8B) e cultura per 2 giorni ad una rotazione costante di 4,02 x 10 -5 g forza. </li><li> Raccolto il costrutto dopo 2 giorni di coltura in condizioni sterili e prepararlo per l&#39;ulteriore caratterizzazione biologica come descritto nella sezione 2.4. </li></ol></li></ol>

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<li>Meghezi, S., Couet, F., Chevallier, P., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+pseudophysiological+environment+on+the+elastic+and+viscoelastic+properties+of+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effects of a pseudophysiological environment on the elastic and viscoelastic properties of collagen gels.</a> International journal of biomaterials. 2012, 319290(2012).</li>
</ol>

Nessun finanziamento è stato ricevuto da organizzazioni o agenzie con potenziale conflitto di interessi.

Tra la comunità di ingegneri dei tessuti vascolari, enormi sforzi sono stati fatti per riprodurre lo strato tunica media responsabili per la stabilità meccanica dei vasi sanguigni 16. Dal momento che il lavoro pionieristico di Weinberg e Bell 17, il collagene è stato ampiamente utilizzato come impalcatura per l&#39;ingegneria tissutale vascolare a causa della sua biocompatibilità, le proprietà non immunogeniche e disponibilità. Tuttavia, l&#39;uso di collagene rappresenta una sfida per i ricercatori, in quanto questo materiale non è facile da maneggiare, a causa della intrinseca mancanza di rigidità meccanica. Manipolazioni durante la preparazione patibolo possono danneggiare i ponteggi, li compromettendo per un ulteriore uso. La tecnica descritta in questo lavoro permette di: i) ingegnere gel di collagene cellularized in una geometria a forma tubolare; ii) per ingegnerizzare tessuti biologici abbastanza forte per essere gestita dopo un breve periodo di maturazione statica (1 o 2 settimane); iii) comesess proprietà meccaniche e viscoelastiche tali tessuti biologici a forma tubolare in 2 direzioni. Le cellule in gel svolgono un ruolo chiave nel rimodellamento della matrice di collagene. Durante il periodo di maturazione, SMCs contrattili portato alla compattazione dei gel che producono un costrutto con maggiore stabilità meccanica valutabili nelle direzioni longitudinali e circolari. In seguito, HUVECs testa di serie nel lato luminale dei costrutti generato un endotelio omogeneo e vitale, dimostrando così l&#39;idoneità dei gel di collagene per le applicazioni di ingegneria dei tessuti vascolari. Il bioreattore presentata in questo lavoro è stato progettato specificamente per fornire un ambiente ottimale per la crescita cellulare durante la maturazione statica. Inoltre, i dispositivi sviluppati per la caratterizzazione delle proprietà meccaniche e viscoelastiche dei costrutti sono stati progettati con lo scopo di ridurre i danni potenziali inerenti alla manipolazione ditali materiali delicati. Quindi, il bioreattore statica era dotato di un filtro di 0,22 micron e una membrana filtrante sul tappo (passaggio 1.1.2, figura 1A e B) che ha permesso lo scambio di gas tra terreno di coltura all&#39;interno del serbatoio e l&#39;incubatore, mantenendo un ambiente coltura sterile. Il setto luer sul fondo è stato utilizzato come porta per mezzo di coltura campionamento e cambiando durante la coltura statica. Alcuni passaggi critici devono essere considerati durante costrutto fabbricazione e caratterizzazioni. Tutte le manipolazioni (effettuate nella fase 2.1.1 e nelle fasi successive) che potrebbero alterare la sterilità del sistema sono state eseguite in una cappa biologica sterile. Cellule e gel di collagene preparazione della miscela è stata gestita in ghiaccio, al fine di ritardare il processo di gelificazione (passi 2.1.4 a 2.1.7). Al passo 2.1.7, eventuali bolle d&#39;aria intrappolate nella miscela prima della gelificazione sono potenziali zone di concentrazione delle tensioni che possono compromettere le sredditività dei costrutti. Pertanto, la rimozione di tali bolle d&#39;aria richiede un po &#39;tremante il montaggio o usando il vuoto medico per 3 minuti per degasaggio in condizioni sterili. Infine, le impugnature sono stati specificamente progettati per mantenere l&#39;asse del mandrino centrale nello stampo tubolare durante gelificazione e per consentire delicata manipolazione dei costrutti durante la raccolta (rimozione del mandrino, sezione 2.4), per endotelizzazione, e per facilitare il montaggio su il sistema meccanico (test longitudinali). Il presente protocollo propone un approccio originale di facile procedimento alternativo di rinforzo di gel di collagene costrutti basato sul naturale potenziale contrattile intrinseca SMCs. Tecniche comuni di matrici di collagene rinforzo implicano l&#39;uso di agenti fisici e chimici reticolanti che possono avere effetti deleteri sulle interazioni cellule-matrice 18 - 20. La tecnica di fabbricazione presentato inquesto lavoro permette di dirigere questo processo di rimodellamento cellule-driven per dare un costrutto tissutale con mirati proprietà meccaniche senza alcun trattamento fisico o chimico. Caratterizzazione delle proprietà meccaniche e viscoelastiche del gel di collagene idratati è una grande sfida. In questa prospettiva, il presente protocollo descrive un metodo originale semplice ed efficiente per valutare le proprietà meccaniche dei tessuti molli tubolari. Questa caratterizzazione può essere eseguita non solo in direzione circonferenziale, ma anche in senso longitudinale, direttamente su tutta la struttura tubolare. Durante caratterizzazione meccanica, temperatura, ambiente acquoso, pH e forza ionica sono alcuni dei fattori ambientali che sono noti per influenzare drasticamente il comportamento meccanico di tessuti biologici 21. Pertanto, il presente lavoro suggerisce un set-up e protocollo originale per la caratterizzazione meccanica dei tessuti biologici in un altamenteriproducibile pseudo-fisiologica ambiente (soluzione salina a 37 ° C e pH 7,4). Per quanto a nostra conoscenza, questo tipo di caratterizzazione non è mai stata riportata altrove. In conclusione, la tecnica proposta in questo lavoro dimostra l&#39;elevato potenziale di miscelazione diretta di cellule con collagene per applicazioni di ingegneria tissutale vascolari. Questo metodo insieme al processo di caratterizzazione e endothelialization meccanica costituiscono alti protocolli polivalenti. Quindi, attraverso piccole modificazioni del set-up e protocolli mantenendo la stessa logica, requisiti principali per l&#39;ingegneria dei tessuti vascolari equivalenti possono essere affrontati quali trattamento rapido e semplice, compresi endotelizzazione, e la possibilità di essere trasposta ad una vasta gamma di molle tessuti con diverse lunghezze e diametri. Inoltre, diversi tipi di cellule aderenti, proteine ​​ECM e geometrie stampati possono essere indagati per una serie di appli mirations, come i tendini ingegneria, innesti cutanei, patch cardiaci, nervi, tra gli altri. Sebbene le proprietà meccaniche dei costrutti sono incoraggianti, sono ancora inferiori a quelli dei tessuti nativi. In questo contesto, crediamo fortemente che un brevissimo periodo di maturazione statico è un passo cruciale verso la stimolazione dinamica in un bioreattore, determinando in tal modo una maggiore integrità strutturale e la stabilità meccanica. Tuttavia, la possibilità di produrre rapidamente cellularized costrutti a base di collagene tissutale adatto per meccanica ed istologica analisi rende il bioreattore statica qui descritto uno strumento utile e promettente per fornire una conoscenza l&#39;interazione tra cellule e ECM durante la crescita e il rimodellamento, o anche per essere utilizzato come modello per terapie e sistemi di drug delivery.

Ingegneria dei tessuti vascolari prevede diverse strategie mirate alla realizzazione di vasi ingegnerizzati, tra cui gli innesti a base di ponteggi sintetiche, vasi sanguigni tissutale basati strato di cellule (TEBVs) e matrice extracellulare (ECM) componenti basati TEBVs. Tra questi approcci, polimeri sintetici presentano buone proprietà meccaniche, ma condividono un inconveniente comune in quanto mancano bioattività 1. Il metodo basato su strato cellulare permette la produzione di sostituti vascolari artificiali, con elevate caratteristiche meccaniche, ma il tempo richiesto per produrre tali innesti è circa 28 settimane 2. Biopolimeri naturali della ECM, come il collagene, elastina, la fibrina 3 o una combinazione di questi, restano i materiali standard d&#39;oro per ponteggi di ingegneria tissutale. Questo è principalmente per la ragione che questi materiali possiedono generalmente buona biocompatibilità pur essendo in grado di indurre risposte cellulari funzionali 4-5. Tra questi biopolimeros, collagene di tipo I è uno dei più abbondanti e predominante proteina portante della ECM in molti tessuti come la pelle, vasi sanguigni e tendini. Un&#39;ampia attività è stata condotta sulle proprietà meccaniche del collagene 6 - 8, ma ci sono stati pochi studi sul rimodellamento cellulare del gel di collagene durante la maturazione statica. Rimodellamento cellulare si riferisce alle modifiche strutturali della matrice di collagene indotta da cellule che potrebbero alterare la stabilità della rete di fibrille di collagene 9. Come un ponteggio naturale, relativamente grandi quantità di collagene di tipo I possono essere isolate, sterilizzati e conservati da diverse fonti, come ratto-coda tendini 10. La comprensione interazioni cellulari con collagene e relativi comportamenti complessivi meccaniche degli scaffold di collagene cellularized (costrutti) è un passo essenziale per la costruzione di tessuti. TEBVs base di collagene possono essere elaborati miscelando direttamente le cellule con collagenedurante la preparazione del gel e ulteriormente modellato in forme particolari quali tubolare e planare 11. Cellule vascolari all&#39;interno dei gel proliferano e tipo rimodellare collagene 12. Così, questo metodo ignora la necessità di macroporosità specifica che rappresenta uno dei problemi significativi nello sviluppo di scaffold per applicazioni di ingegneria tissutale. Tuttavia, i principali svantaggi di gel di collagene sono le loro scarse proprietà meccaniche rispetto ai materiali sintetici 13. In questo studio, un tessuto vitale con distribuzione omogenea di cellule è stato progettato per miscelazione diretta di collagene con cellule in un unico passaggio. &quot;bioreattori statici&quot; sono stati utilizzati per le 1 o 2 settimane di maturazione statica dei gel di collagene cellularized (senza applicati vincoli meccanici dinamiche esterne). Durante la coltura, rimodellamento della matrice di collagene è verificato, fornendo così rinforzo strutturale per i costrutti. Inoltre, questi costrutti furono ready da trasferire ad un bioreattore rotante parete e un endotelio omogeneo è stato raggiunto. Inoltre, in questo lavoro viene proposto anche uno specifico protocollo di test meccanico per fornire un approccio adeguato nel caratterizzare le proprietà meccaniche dei tessuti molli tubolari. In sintesi, questo lavoro presenta un metodo per la rapida realizzazione e maturazione dei tessuti vascolari che sono abbastanza forti da trattare non solo per caratterizzazioni biologiche e meccaniche, ma anche per un ulteriore condizionamento meccanico in un bioreattore dinamico, che è considerato un cruciale in vitro intervenire la rigenerazione dei tessuti.

<table><tbody><tr><td>CellTreat Provette per bioreazione da 50 ml</td><td>CELLTREAT Scientific Products</td><td>229-475</td><td>Provetta per centrifuga</td></tr><tr><td>Luer maschio con anello di bloccaggio x portagomma da 1/8". PP. 25/conf.</td><td>Cole Parmer</td><td>RK-45503-04</td><td>Raccordi Luer per "porta di scambio gassoso"</td></tr><tr><td>Adattatore per portagomma femmina luer x 1/8". PP. 25/conf.</td><td>Cole Parmer</td><td>RK-45500-04</td><td>Raccordi Luer per la "porta di campionamento medio"</td></tr><tr><td>Tubo in silicone Masterflex platinicato L/S 17. 25 ft.</td><td>Cole Parmer</td><td>RK-96410-17</td><td>Tubo 1 e 2 per le pinze di garza</td></tr><tr><td>Tubo in silicone polimerizzato al platino Masterflex L/S 16. 25 piedi.</td><td>Cole Parmer</td><td>RK-96410-16</td><td>Tubo 3 per le pinze di garza</td></tr><tr><td>Silastic Medical silicone adesivo, tipo A</td><td>Dow Corning-Silicone</td><td></td> <td>colla per la fabbricazione del bioreattore statico</td></tr><tr><td>Polyvent 4 Filtri di sfiato del recipiente</td><td>Whatman</td><td>6713-0425</td><td>Filtro per "porta di scambio gassoso"</td></tr><tr><td>Rod. PP. agitazione. 8' »</td><td>Scienceware</td><td>377660008</td><td>Mandrino</td></tr><tr><td>Tappo in gomma siliconica 00 PK12</td><td>VWR</td><td>59590-084</td><td>Tappo per l'inserimento del mandrino nel tappo ventilato della provetta da centrifuga</td></tr><tr><td>Krytox PFPE/PTFE Grassi</td><td>Dupont</td><td>GPL 202</td><td>Grasso per uso medico per la copertura del mandrino</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,5%)</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Xiameter RTV-4130-J base e agente indurente</td><td>Dow</td> <td>Corning-Supporto</td> <td>siliconico a forma di C per endotelizzazione</td></tr><tr><td>Dulbecco' s modificato Eagle medium, DMEM, alto glucosio, piruvato</td><td>Gibco (Life Technology)</td><td>11995-065</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Acetone puro (99%)</td><td>Laboratoire Mat Inc.</td><td>AP0102</td><td>Prodotto chimico per l'estrazione del collagene</td></tr><tr><td>Alcool isopropilico (grado HPLC, 99,9%)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC610080040</td><td>Chimico per l'estrazione del collagene</td></tr><tr><td>0,02 N acido acetico (acido acetico glaciale, grado HPLC, 99%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FL070494</td><td>Chimico per l'estrazione del collagene</td></tr><tr><td>Soluzione di cloroformio (99%)&nbsp;</td><td>Laboratoire Mat Inc.</td><td>CR 0179</td><td>Prodotto chimico per l'estrazione del collagene</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich 163716</td><td></td><td>Prodotto chimico per la preparazione del costrutto</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Laboratoire Mat Inc.</td><td>SR-0169</td><td>Chimico per la preparazione del costrutto</td></tr><tr><td>LaserMike 136</td><td>LaserMike</td><td>Serie 183B</td><td>Interferometro laser a scansione</td></tr><tr><td>ElectroPulse MicroTester</td><td>Instron</td> <td>Corporation-Tester</td> <td>micromeccanico</td></tr><tr><td>HyClone Media M199/EBSS, 500&nbsp; ml</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30253.01</td><td>Componente del terreno di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino HI - 500&nbsp; ml</td><td>Gibco</td><td>SH 30396.03</td><td>Componente del terreno di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Siero suino (PS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9783</td><td>Componente del terreno di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Componente del terreno di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP661-50</td><td>Soluzione salina</td></tr><tr><td>Pallone per coltura tissutale T17CN Vent Cap Red</td><td>Sarstedt Inc.</td><td>83.1812.002</td><td>Colture cellulari</td></tr><tr><td>ColorpHast- Strisce indicatrici di pH (pH = 6,5-10,0)</td><td>EMD</td><td>9583</td><td>Misure di pH</td></tr><tr><td>Matrigel Membrana basale Matrice Fattore di crescita ridotto, fiala da 5 ml</td><td>BD Biosciences - Discovery Labware</td><td>356230</td><td>Miscela di proteine concentrate per il processo di endotelizzazione</td></tr><tr><td>LifeCam VX-3000</td><td></td> <td>Microsoft-Misurazione</td> <td>dello spessore</td></tr><tr><td>Analizzatore biochimico, DxC600</td><td>Beckman Coulter Unicell</td><td></td> <td>Synchron-Misurazioni delle concentrazioni di glucosio e lattato</td></tr><tr><td>Fibre di</td><td>collagene Code di ratto-Il</td><td></td> <td>collagene è stato estratto in laboratorio</td></tr><tr><td>Cellule muscolari lisce suine (pSMC)</td><td>Aorte suine-pSMC</td><td></td> <td>sono state isolate in laboratorio</td></tr><tr><td>Cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVECs)</td><td>Vene ombelicali umane</td><td>- </td><td>Gli HUVEC sono stati isolati in laboratorio</td></tr></tbody></table>

ingegneria 3d cellularized collagene gel per vascolare rigenerazione tissutale

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

I materiali sintetici sono noti per avviare complicazioni cliniche come l&#39;infiammazione, la stenosi, e le infezioni quando impiantati come sostituti vascolari. Il collagene è stato ampiamente utilizzato per una vasta gamma di applicazioni biomediche e viene considerata una valida alternativa ai materiali sintetici per la sua biocompatibilità intrinseca (cioè, bassa antigenicità, infiammazione, e risposte citotossiche). Tuttavia, le limitate proprietà meccaniche e la relativa mano bassa-capacità di gel di collagene hanno ostacolato il loro uso come materiali scaffold per l&#39;ingegneria tissutale vascolare. Pertanto, la logica alla base di questo lavoro è stata la prima a progettare gel di collagene cellularized in una geometria a forma tubolare e in secondo luogo favorirne cellule muscolari lisce riorganizzazione guidato di matrice di collagene per ottenere tessuti abbastanza rigide da trattare. La strategia qui descritta si basa sul montaggio diretto di collagene e cellule muscolari lisce (costruire) in un cyli 3Dgeometria ndrical con l&#39;uso di una tecnica di stampaggio. Questo processo richiede un periodo di maturazione, durante il quale i costrutti sono coltivate in un bioreattore in condizioni statiche (senza applicati vincoli meccanici dinamiche esterne) per 1 o 2 settimane. Il &quot;bioreattore statico&quot; fornisce un ambiente sterile monitorati e controllati (pH, temperatura, scambio di gas, rifornimento dei nutrienti e rimozione dei rifiuti) per i costrutti. Durante il periodo di coltura, misure di spessore sono stati eseguiti per valutare l&#39;cellule-driven rimodellamento della matrice di collagene, e consumo di glucosio e tassi di produzione di lattato sono stati misurati per monitorare le cellule attività metabolica. Infine, le proprietà meccaniche e viscoelastiche sono stati valutati per i risultanti costrutti tubolari. A tal fine, i protocolli specifici e un know-how concentrato (manipolazione, di presa, lavorando in ambiente idratato, e così via) sono stati sviluppati per caratterizzare i tessuti ingegnerizzati.

Questo lavoro descrive la fabbricazione di costrutti a base di collagene tubolari ingegnerizzati contenenti cellule vascolari. Già dopo 1 ora di inizio di gelificazione, miscela cellule e collagene era direttamente assemblato in una geometria tubolare 3D, con il diametro esterno uguale al diametro dello stampo corrispondente (circa 14 mm). Lungo la maturazione statico, misurazioni hanno evidenziato la rapida riduzione del diametro esterno delle strutture cellularized tubolari, come mostrato in Tabella 1. Il diametro dei gel di collagene cellularized rimpiccioliti di circa il 60% del suo valore iniziale dopo 1 giorno di coltura statica, e di quasi il 85% entro 7 giorni (Supplemental Video 2). SMC all&#39;interno dei costrutti sono responsabili della contrazione osservata e il rinforzo meccanico correlati, in quanto questo fenomeno non si verifica in scaffold di collagene non cellularized. Da notare che è stata applicata nessuna sfumatura di qualsiasi tipo (termici, biochimici, meccanici, o altro). Le cellule-driven compattazione portato in un materiale con una maggiore densità di collagene che può essere maneggiato e sottomesso alle sollecitazioni meccaniche (Video aggiuntive 3 e 4). Per correlare il rimodellamento cellule-driven alle proprietà meccaniche e viscoelastiche generali, prove di fatica sono state eseguite su costrutti (video integrativi 5 e 6). Questi test consisteva nel ciclismo costrutti (30 volte) a diversi ceppi costanti (10%, 20% e 30% della lunghezza del calibro iniziale) e registrare lo stress come la risposta dei costrutti della sollecitazione meccanica nel tempo. I risultati rappresentativi per un costrutto sono mostrati in figura 9. Il costrutto resistito maggiori sollecitazioni nella direzione longitudinale (75 kPa) rispetto alla direzione circonferenziale (16 kPa) quando sono sottoposti alla stessa gamma ceppo (30% di deformazione). Nel frattempo, ad ogni ciclo, il valore di picco di stress raggiunto per la tadeformazione massima rgeted diminuito nel corso del tempo. Questo comportamento è tipico delle alte proprietà viscoelastiche presentati da questi costrutti base di collagene. L&#39;attività biologica dei costrutti cellularized stata valutata durante la maturazione statica. Quindi, l&#39;attività metabolica delle SMC è stata valutata misurando il consumo di glucosio e la produzione di lattato durante la coltura statica. Il terreno di coltura è stata campionata ogni 2 giorni e glucosio e concentrazioni di lattato sono state misurate usando un analizzatore di gas ematici. La costante incremento del consumo di glucosio e la produzione di lattato combinati per l&#39;importante contrazione dei costrutti, attestano l&#39;attività SMCs lungo coltura statica (Figura 10). La maggiore stabilità meccanica dovuta al rimodellamento cell-driven consentito la manipolazione dei costrutti e il successivo processo di endotelizzazione. Colorazione tricromica di Masson eseguita sui costrutti endotelizzazionemostrato un endotelio altamente omogenea. SMCs esibito una morfologia fusiforme-like e sembrava omogeneamente disperso attraverso la parete, mentre HUVEC apparso ben distribuito nel lato luminale (Figura 11). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1:. Componenti del bioreattore statico Il bioreattore statica consisteva in un tubo da 50 ml modificata centrifuga (A) e un tappo mandrino attrezzato (B). Il tubo servito come mezzo serbatoio, ed era dotato di una porta per un filtro di 0,22 micron, per lo scambio di gas, e un setto, per il campionamento medio e cambiando. Un mandrino presente nel tappo ventilato permesso la realizzazione di costrutti in forma tubolare. La garza-impugnature (C) sono stati progettati e costruiti per supportare la gelificazione dei costrutti sul mandrino. Inoltre, questiimpugnature permesso ai costrutti da trattare dopo la maturazione statica e da fissare al apparato meccanico. Il diametro esterno del mandrino di 4,7 mm. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2: Assemblaggio del bioreattore statica fasi del bioreattore Assemblaggio prima della sterilizzazione.. La garza-impugnature sono stati montati sul mandrino (A) ad una distanza fissa. Uno stampo è stato inserito (B) e saldamente fissato al tappo in silicone (C). Il diametro esterno del mandrino di 4,7 mm. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig3highres.jpg" width="700" /> Figura 3:. Fabrication dei costrutti in condizioni sterili La miscela cellule e collagene è stato versato nel complesso di alloggiamento stampo<html> (A), e lasciare il gel per 1 ora a temperatura ambiente (B). Successivamente, lo stampo è stato rimosso (C), il bioreattore statico è stato assemblato (D) e trasferito in un serbatoio per la maturazione statica del costrutto in incubatrice (T = 37 ° C, 5% CO 2, 100% di umidità). Il diametro esterno del mandrino di 4,7 mm. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig4highres.jpg" width="700" /> Figura 4:. Misurazione dello spessore / diametro esterno dei costrutti Un interferometro a scansione laser è stato utilizzato per eseguire la misura dei diametri esterni dei costrutti. Il costrutto è stato inserito nel percorso del raggio laser e genera un&#39;ombra. La larghezza dell&#39;ombra, corrispondente al diametro esterno del costrutto, è stata poi misurata e visualizzata sullo schermo. e_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5:. Aspetto morfologico del costrutto raccolta (A) Subito dopo gelificazione e (B) dopo che le cellule-driven rimodellamento durante la maturazione statica per 2 settimane. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6: Experimental set-up per caratterizzazioni meccaniche Consisteva tester micromeccanica dotato di una cella di 5 o 10 N carico ed un bagno contenente PBS a 37 ° C per mantenere i campioni in condizioni pseudo-fisiologico.. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig7highres.jpg" width="700" /> Figura 7: Preparazione del campione f<html> o caratterizzazioni meccaniche. raccolta del campione (A) e preparazione (B) per prove di fatica eseguite in senso longitudinale e le direzioni circonferenziali (C). Il diametro esterno del mandrino di 4,7 mm. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig8highres.jpg" width="600" /> Figura 8: Rotazione parete bioreattore (A) I costrutti tubolari sono montati al centro del serbatoio con l&#39;aiuto di supporto in silicone a forma di c.. Entrambe le estremità del costrutto sono stati chiusi per evitare qualsiasi dispersione di soluzione HUVEC. (B) I costrutti sono stati coltivati ​​in incubatrice (T = 37 ° C, 5% CO 2, 100% di umidità) in rotazione a 4,02 x 10 -5 g forza per 2 giorni. 2 / 52812fig9highres.jpg &quot;width =&quot; 700 &quot;/&gt; Figura 9:.. Caratterizzazioni meccaniche Risultati delle prove di fatica effettuati su costrutti a longitudinale (A) e (B) circonferenziali direzioni dopo rimodellamento delle cellule-driven <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/52812fig9highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig10highres.jpg" width="600" /> Figura 10:. Attività metabolica SMCs nei gel di collagene misurazioni del tasso di consumo di glucosio e tasso di produzione di lattato sono stati eseguiti con l&#39;analizzatore di gas del sangue ogni 2 giorni, dopo il mezzo di coltura cambio. Mezzo di coltura fresco è stato usato come un livello base per le misurazioni del glucosio e concentrazioni di lattato. Figura 11: Lumen endothelialization immagini istologiche dei radiali sezioni di costrutti tubolari.. Di Masson Tricoma colorazione dei costrutti tubolari coltivate staticamente per 1 settimana (A) e 2 settimane (B). H &amp; E colorazione di un costrutto tubolare (C). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Tempo </td><td> Spessore (mm) </td><td> Compattazione (%) </td></tr><tr><td> 0 h </td><td> 4.83 ± 0.02 </td><td> 0 ± 0 </td></tr><tr><td> 2 ore </td><td> 4.26 ± 0.02 </td><td> 12 ± 0 </td></tr><tr><td> 4 ore </td><td> 4.21 ± 0.03 </td><td> 13 ± 1 </td></tr><tr><td> 6 ore </td><td> 4.06 ± 0.10 </td><td> 16 ± 2 </td></tr><tr><td> 12 hr </td><td> 3.16 ± 0.07 </td><td> 35 ± 1 </td></tr><tr><td> 1 giorno </td><td> 2.08 ± 0.11 </td><td> 57 ± 2 </td></tr><tr><td> 1 settimana </td><td> 0.68 ± 0.07 </td><td> 86 ± 1 </td></tr><tr><td> 2 settimane </td><td> 0.36 ± 0.00 </td><td> 93 ± 0 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Rapid compattazione del diametro costrutto durante la maturazione statica spessore della parete dei costrutti e il tasso di compattazione in funzione del tempo di coltura statica.. Compattazione è stata misurata determinando il diametro esterno dei costrutti tubolari con un interferometro laser a scansione (Serie 183B, LaserMike 136). Dopo 24 ore, i costrutti compattati al 57% ± 2% delle loro dimensioni stampati. I dati sono espressi come media ± deviazione standard (n = 3). La presenza e l&#39;attività delle cellule viventi muscolari lisce era l&#39;unico responsabile di tale rilievo. Supplemental Video 1:. La raccolta dei gel non ristrutturato tubolare collagene <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video1.mov" target="_blank">Clicca qui per vedere il video.</a> Supplemento Video 2:. Le cellule-driven compattazione di gel tubolari collagene <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video2.m4v" target="_blank">Clicca qui per vedere il video.</a> Supplemento Video 3:. La manipolazione dei gel non ristrutturato tubolare collagene <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video3.mov" target="_blank">Clicca qui per vedere il video.</a> Supplemento Video 4:. Manipolazione delle cellule rinnovate gel tubolare di collagene <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video4.mov" target="_blank">Cliccate qui per vedere th</a>è il video. Supplemento Video 5:. Prova di fatica longitudinale (al 30%) su cellule ristrutturato gel tubolare di collagene <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video5.mov" target="_blank">Cliccate qui per vedere il video.</a> Supplemento Video. 6: prova di fatica circonferenziale (al 30%) su cellule ristrutturato gel tubolare di collagene <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video6.mov" target="_blank">Cliccate qui per vedere il video.</a>

In questo lavoro, presentiamo una tecnica per la rapida fabbricazione di tessuti vascolari viventi mediante coltura diretta di collagene, cellule muscolari lisce e cellule endoteliali. Inoltre, viene descritto un nuovo protocollo per la caratterizzazione meccanica di tessuti vascolari ingegnerizzati.

Ingegneria 3D Cellularized collagene Gel per Vascolare Rigenerazione Tissutale

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è progettare costrutti tubolari per la rigenerazione del tessuto vascolare. Questo risultato si ottiene innanzitutto combinando il collagene di tipo I e le cellule muscolari lisce in una geometria cilindrica mediante l'utilizzo di una tecnica di stampaggio. Il secondo passaggio consiste nell'indurre la maturazione del costrutto in un bioreattore statico appositamente progettato.Successivamente, le strutture mature vengono accuratamente raccolte e le cellule endoteliali sono posizionate sulla superficie luminale della struttura utilizzando un bioreattore a parete rotante. Infine, vengono eseguite analisi istologiche, saggi metabolici e test meccanici per valutare le proprietà di queste strutture tubolari. L'originalità di questa tecnica consiste nell'utilizzare un unico passaggio per combinare cellule e collagene, ottenendo una struttura ingegnerizzata con proprietà meccaniche mirate, senza alcun trattamento fisico o chimico aggiuntivo.Inoltre, il costrutto può essere facilmente manipolato grazie a impugnature appositamente progettate, che ne permettono la manipolazione e i collegamenti terminali. Questo metodo può fornire informazioni sulle interazioni tra cellule e matrice extracellulare durante la crescita e il rimodellamento nei processi rigenerativi del tessuto vascolare. In aggiunta, può essere applicato a diversi tessuti bersaglio, come tendini, innesti cutanei, patch cardiache e sistema nervoso.Per iniziare, fabbricare e assemblare il bioreattore statico come descritto nel protocollo testuale allegato, che include dettagli su serbatoio e garza, fabbricazione della pinza, tappo del mandrino e assemblaggio dello stampo della carcassa, nonché tecniche di sterilizzazione. Successivamente, espandere cellule muscolari lisce aortiche di suino in un’ampolla per colture cellulari da 175 centimetri quadrati fino al raggiungimento di una confluenza del 90%. Utilizzando tecniche standard di coltura, raccogliere le cellule e quindi sospenderle a una concentrazione di 4 milioni di cellule per millilitro in mezzo di coltura completo.Successivamente, mescolare una parte di soluzione tampone, due parti di soluzione sterile di collagene a quattro grammi per litro e una parte di sospensione cellulare. In questo ordine, misurare il pH della miscela e assicurarsi che sia compreso tra pH 7,0 e 7,4. Quindi versare delicatamente la miscela di cellule e collagene nel complesso dello stampo di alloggiamento assemblato.Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nella miscela. Lasciare il gel di collagene a temperatura ambiente per un'ora in un ambiente sterile. Dopo un'ora, rimuovere il tubo di contenimento e trasferire con attenzione la costruzione nel serbatoio contenente 35 millilitri di mezzo di coltura preriscaldato.Incubare il costrutto in posizione verticale per una o due settimane di maturazione statica. Cambiare il mezzo di coltura ogni due giorni aspirando il vecchio mezzo dal porto del setto inferiore e riempiendo nuovamente il serbatoio con un volume equivalente di mezzo di coltura fresco. Se desiderato, raccogliere un millilitro sia del mezzo di coltura vecchio che di quello fresco a ogni cambio del mezzo, per l'analisi biochimica ogni ora per le prime 12 ore e ogni 24 ore successivamente.Rimuovere il costrutto dal mezzo di coltura in condizioni sterili e posizionarlo ortogonalmente lungo il percorso di un interferometro laser a scansione per misurare lo spessore del costrutto dopo una a due settimane di maturazione statica. Trasferire il bioreattore in una cappa da coltura cellulare e rimuovere delicatamente il costrutto dal suo mandrino. Una volta libero, posizionarlo in una piastra di Petri di diametro 100 millimetri contenente 40 millilitri di mezzo di coltura fresco.Successivamente, configurare un tester micro-meccanico dotato di una cella di carico da cinque a 10 Newton e di morsetti che si estendono in un bagno di PBS mantenuto a 37 gradi Celsius. Rimuovere il costrutto dalla sua piastra di Petri e collegarlo a dispositivi di fissaggio specializzati per test longitudinali, progettati per connettersi alla porzione di garza del costrutto senza schiacciare il gel. Utilizzare nastro in teflon per prevenire qualsiasi scivolamento dei dispositivi di fissaggio durante il test.Quindi montare la costruzione sul tester micro-meccanico. Successivamente, eseguire un test di fatica nella direzione longitudinale allungando innanzitutto la costruzione fino alla sua lunghezza iniziale di riferimento e mantenendola in tale posizione per 10 minuti. Poi applicare 30 cicli di una deformazione ciclica del 10% a una velocità del 5% al secondo.Aumentare la deformazione in passaggi incrementali del 10% di deformazione ciclica fino al momento in cui il campione non riesce a superare i test nella direzione circonferenziale. In primo luogo, sezionare il campione in anelli lunghi 10 millimetri. Successivamente, montare gli anelli su aste di acciaio inossidabile utilizzate al posto delle pinze.Come nei test in direzione longitudinale, allungare innanzitutto il costrutto fino alla sua lunghezza iniziale di riferimento e mantenerlo in tale posizione per 10 minuti. Successivamente, applicare 30 cicli di una deformazione ciclica del 10% a una velocità del 5% al secondo. Una volta che il costrutto ha maturato e sia stato rimosso dal mandrino, fissare il costrutto alle due estremità al serbatoio e posizionarlo all'interno dell'insieme del serbatoio.Come mostrato qui. Riempire l'esterno del serbatoio con 30 millilitri di mezzo di coltura. Successivamente, riempire il 75% del volume luminale della costruzione con una miscela di proteine, quindi chiudere entrambe le estremità della costruzione.Per evitare qualsiasi perdita della soluzione proteica, posizionare il bioreattore all'interno di un incubatore e ruotare il bioreattore a 4,02 × 10⁻⁵ GForce per un'ora per rivestire la superficie luminale con proteine mentre il lume viene rivestito. Raccogliere la vena ombelicale umana e le cellule tiali coltivate con tecniche standard quando raggiungono una confluenza del 90%. Sospendere le cellule in mezzo di coltura M199 integrato. Successivamente, seminare le cellule della vena ombelicale umana e le cellule uroteliali all'interno del lume della costruzione.Con una densità di 1000 cellule per centimetro quadrato, chiudere le estremità superiori del costrutto per evitare qualsiasi fuoriuscita della soluzione cellulare. Incubare i costrutti ospitati nel bioreattore a parete rotante per due giorni a una rotazione costante di 4,02 × 10⁻⁵ forze G. Durante la maturazione statica dei costrutti vascolari, il diametro esterno delle strutture cellulari aumentate si ridusse rapidamente.Come mostrato qui, il diametro delle costruzioni è diminuito del 60% rispetto al valore iniziale nel primo giorno di coltura statica. Entro il settimo giorno, le costruzioni avevano ridotto quasi dell'85%. Sia i cicli di deformazione longitudinale che circonferenziale delle costruzioni hanno seguito proprietà viscoelastiche tipiche di costruzioni a base di collagene. Nel complesso, le costruzioni erano più resistenti nella direzione longitudinale rispetto a quella circonferenziale allo stesso intervallo di deformazione. La colorazione di Masson tricromatica eseguita sulle costruzioni endoteliali ha mostrato un endotelio altamente omogeneo.Le cellule muscolari lisce presentavano una morfologia a forma di fuso ed apparivano omogeneamente disperse nella parete, mentre le cellule endoteliali apparivano ben espanse sul lato luminale. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biomeccanica e della medicina rigenerativa per esplorare il comportamento meccanico di tessuti ingegnerizzati e tessuti nativi.Dopo aver visto questo video, ora dovreste avere una buona comprensione di come le strutture vascolari possano essere ingegnerizzate rapidamente e diventare infine abbastanza resistenti da poter essere manipolate e utilizzate per il condizionamento meccanico in un bioreattore dinamico. Speriamo che i nostri sforzi e risultati vi abbiano convinto del grande potenziale delle cellule all'interno del modello di matrice extracellulare per lo sviluppo di tessuti biologici funzionali.

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Creazione di micro-tessuti con gel di collagene cilindriche, chiamati moduli, che contengono cellule embedded e la cui superficie è rivestita con le cellule endoteliali.

Fabbricazione di micro-tessuti utilizzando i moduli di Collagene Gel cellule contenenti

Questo articolo descrive un metodo versatile per creare cellule derivate da anelli di tessuto cellulare self-assembly. Cellule muscolari lisce seminate in forma di anello aggregato agarosio pozzi e contratto a formare solide tridimensionali (3D) nei tessuti entro 7 giorni. Millimetrica scala anelli di tessuto sono favorevoli ai test meccanici e servono come mattoni per l'assemblaggio dei tessuti.

Diretto Cellular Self-Assembly di fabbricare Cell-Derived Anelli tessuto per l&#39;analisi biomeccanica e di ingegneria dei tessuti

Questo protocollo si concentra sulla utilizzando la capacità intrinseca delle cellule staminali a prendere spunto dalla loro matrice extracellulare che circonda ed essere indotte a differenziarsi in fenotipi multipli. Questo manoscritto metodi estende la nostra descrizione e caratterizzazione di un modello utilizzando un idrogel doppo strato, costituito da PEG-fibrina e collagene, contemporaneamente alla co-differenziare derivate da tessuto adiposo cellule...

Progettazione di un Hydrogel doppo strato di controllo differenziazione ASC

Per la creazione di strutture altamente organizzate di tessuti complessi, è necessario assemblare più materiali e tipi di cellule in un composito integrato.  Questo design combinatorio incorpora fogli cellulari stratificati specifici per organo con due materiali distinti di derivazione biologica contenenti una forte base di matrice fibrosa e cellule endoteliali per migliorare la formazione di nuovi vasi.

Ingegneria dei tessuti: Costruzione di un multicellulare 3D Ponteggio per la consegna di Layered fogli Cellulari

È stata sviluppata un'innovativa tecnica di biofabbricazione per ingegnerizzare costrutti tridimensionali che assomigliano alle caratteristiche architettoniche, ai componenti e alle proprietà meccaniche dei tessuti in vivo. Questa tecnica presenta un materiale sacrificale di nuova concezione, la gomma BSA, che trasferisce caratteristiche spaziali dettagliate, riproducendo le architetture in vivo di un'ampia varietà di tessuti.

Tridimensionale Tecnologia biomimetica: Novel Biorubber Consente di creare Definito micro e macro scala Architetture in collagene idrogel

Il collagene è una componente fondamentale della ECM, e fornisce spunti essenziali per molti processi cellulari che vanno dalla migrazione verso la differenziazione e la proliferazione. Qui fornito è un protocollo per l'incorporamento celle all'interno di idrogel di collagene 3D, e una tecnica più avanzata per la generazione di matrici di collagene randomizzati o allineati con microcanali PDMS.

Preparazione del 3D collagene Gel e microcanali per lo studio delle interazioni 3D<em&gt; In Vivo</em

Questo protocollo descrive una piattaforma per la realizzazione di anelli di tessuto auto-assemblati usando una muffa di plastica su misura 3D-stampato di dimensioni variabili. PDMS negativi sono curati nello stampo 3D-stampato; quindi dell'agarosi sono nel cast i negativi PDMS polimerizzati. Le cellule sono seminate nei pozzetti risultante dell'agarosi dove si aggregano in anelli di tessuto.

Fabbricazione di pozzi di agarosio personalizzato per la semina delle cellule e tessuto anello auto-assemblaggio utilizzando stampi 3D-stampato

Vi proponiamo un protocollo di espansione delle cellule su microcarriers macroporosa e loro uso come sistema di consegna in un bioreattore di perfusione per inizializzare una matrice di tessuto decellularizzati. Abbiamo anche diverse tecniche per determinare la proliferazione delle cellule e l'attuabilità delle cellule coltivate su microcarriers. Inoltre, dimostriamo la funzionalità delle cellule dopo le culture di bioreattore.

Ricombinante collagene Peptide Microcarriers per l'espansione delle cellule e loro potenziale utilizzo come sistema di consegna di cella in un bioreattore modello

Presentato qui è un set-up biostampa tridimensionale semplice da usare, nucleo/guscio, tridimensionale per la fabbricazione in un solo passaggio di scaffold cavi, adatto per l'ingegneria tissutale di strutture vascolari e altre strutture tubolari.

Scaffold di stampa Core/shell per l'ingegneria dei tessuti di strutture tubolari

I lembi ingegnerizzati richiedono una rete vascolare funzionale incorporata. In questo protocollo, presentiamo un metodo per fabbricare un lembo di tessuto stampato in 3D contenente una rete vascolare gerarchica e le sue anastomosi microchirurgiche dirette all'arteria femorale di ratto.

Fabbricazione di lembi vascolari ingegnerizzati utilizzando tecnologie di stampa 3D

Questo protocollo dimostra l'uso di un canale microfluidico con geometria variabile lungo la direzione del flusso del fluido per generare tensione estensionale (stretching) per allineare le fibre in un idrogel di collagene 3D (&lt;250 μm di spessore). L'allineamento risultante si estende su diversi millimetri ed è influenzato dalla velocità di deformazione estensionale.

Idrogel di collagene 3D di microingegneria con allineamento delle fibre a lungo raggio

Scopri la fabbricazione rapida di tessuti vascolari cellularizzati combinando collagene, cellule muscolari lisce ed endoteliali in un bioreattore statico. Questo metodo offre proprietà meccaniche mirate per la rigenerazione tissutale.

Ingegneria 3D Cellularized collagene Gel per Vascolare Rigenerazione Tissutale

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