Name: Plasmidi derivati da DNA Strand Displacement Cancelli per reti di reazione implementazione chimici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Scopri come derivare porte di spostamento del filamento di DNA da plasmidi batterici e testarle mediante misurazioni di cinetica della fluorescenza. Questo metodo avanzato migliora la programmazione molecolare.

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Figure 1, 2, 3, 4, 6, 8 e tabelle 2, 3, 10, 15, 16 vengono modificati dal Ref 29. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation (NSF concedere-CCF 1.117.143 e NSF-CCF 1.162.141 a GS). Y.-JC è stata sostenuta da borse di studio del governo di Taiwan. SDR è stato sostenuto dalla Science Foundation Graduate Research Fellowship Program Nazionale (GRFP).

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<li>Qian, L., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+up+digital+circuit+computation+with+DNA+strand+displacement+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Scaling up digital circuit computation with DNA strand displacement cascades.</a> Science. 332, 1196-1201 (2011).</li>
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<li>Zhang, D. Y., Hariadi, R. F., Choi, H. M., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+DNA+strand-displacement+circuitry+with+DNA+tile+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Integrating DNA strand-displacement circuitry with DNA tile self-assembly.</a> Nat. Commun. 4, (1965).</li>
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<li>Green, S. J., Bath, J., Turberfield, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+chemomechanical+cycles%3A+a+mechanism+for+autonomous+molecular+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Coordinated chemomechanical cycles: a mechanism for autonomous molecular motion.</a> Phys. Rev. Lett. 101, 238101(2008).</li>
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<li>Seelig, G., Yurke, B., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalyzed+relaxation+of+a+metastable+DNA+fuel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Catalyzed relaxation of a metastable DNA fuel.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 12211-12220 (2006).</li>
<li>Zhang, D. Y., Turberfield, A. J., Yurke, B., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+entropy-driven+reactions+and+networks+catalyzed+by+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineering entropy-driven reactions and networks catalyzed by DNA.</a> Science. 318, 1121-1125 (2007).</li>
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<li>Chen, X., Briggs, N., McLain, J. R., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stacking+nonenzymatic+circuits+for+high+signal+gain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Stacking nonenzymatic circuits for high signal gain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 5386-5391 (2013).</li>
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<li>Lakin, M. R., Youssef, S., Cardelli, L., Phillips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abstractions+for+DNA+circuit+design%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Abstractions for DNA circuit design.</a> J. R. Soc. Interface. 9, 470-486 (2012).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Questo documento descrive un metodo per derivare cancelli ndsDNA da DNA plasmidico altamente puro. Inoltre, un protocollo è presentato per caratterizzare prestazioni cancello usando un test cinetica di fluorescenza. Dati sperimentali mostrano che il sistema plasmide derivato supera la sua controparte sintetica anche se il sistema di sintesi viene assemblato con trefoli purificato usando SDS-PAGE (PAGINA). Probabilmente, il miglioramento delle prestazioni di cancelli plasmide derivato è dovuta principalmente alla elevatissima purezza del DNA biologica. DNA sintetico contiene una varietà di errori, in particolare delezioni che provocano oligonucleotidi di lunghezza tali prodotti collaterali n-1, e sono tipicamente non completamente rimosso in PAGE o cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) procedure di purificazione. Sono stati inoltre osservati miglioramenti simili a quelli riportati qui in un precedente studio di un amplificatore tornante catalizzata che usati DNA di origine biologica 21. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Tuttavia, anche l&#39;utilizzo di porte plasmide derivato non può eliminare completamente gli errori nell&#39;esecuzione porta, per cui ci sono almeno due motivi: il primo over-digestione o la mancanza di precisione di taglio può portare a cancelli con troppe scheggiature o nick nelle posizioni sbagliate. In entrambi i casi, i gate sono più probabilità di partecipare a reazioni indesiderate. Tali problemi possono essere alleviati ottimizzando la quantità di enzima utilizzato (vedere Figura 4). In secondo luogo, in questi esperimenti, la maggior parte degli ingressi e trefoli ausiliari erano DNA sintetico e quindi contenevano delezioni e mutazioni. In linea di principio, tutti gli input a singolo filamento e fili supplementari potrebbero essere ottenuti anche dal DNA fagemide attraverso un enzima digestione intaccare del genoma virale M13 pre-codificato 26. Forse le prestazioni del circuito può essere ulteriormente migliorata utilizzando ssDNA derivata dal genoma batterico. Mentre è stato trovato l&#39;uso di porte plasmidi derivati ​​per migliorare le prestazioni del circuito, un&#39;analisidei costi e tempi di lavorazione rivelato che mentre la produzione di porte plasmide derivato è leggermente più economico (Tabella 15), richiede 2-3 volte più lungo tempo di lavorazione rispetto al montaggio e purificazione di porte da oligonucleotidi sintetizzati in commercio (Tabella 16). I costi primari di porte plasmide derivato sono sintesi genica e l&#39;impiego di enzimi di restrizione. Per 300 pmoli di cancelli (sufficienti per 15 reazioni 30 nm), il costo stimato per Iscriviti al cancello è di circa $ 170 e $ 200 per Forcella cancelli, la differenza di costo è dovuta all&#39;utilizzo di diversi enzimi intaccare. Al contrario, la sintesi chimica dei trefoli per gli stessi costi di gate intorno $ 260 compresa una commissione purificazione PAGE. Il costo orario principale per cancelli plasmide derivato è nella procedura di clonazione, che, come la sintesi del DNA, può essere affidata a una società di sintesi gene. Tuttavia, una volta assemblati, cancelli plasmide derivato hanno il vantaggio che i plasmidi ospitanti possono facilmente essere replicate unnd possono essere memorizzati in forma di scorte glicerolo batteriche. Ciò consente di riutilizzare le porte più volte. Guardando al futuro, il miglioramento delle prestazioni dei cancelli plasmide-derivato potrebbe consentire una gamma molto più ampia di dinamica dei comportamenti che sono stati sperimentalmente dimostrato finora con CRNS DNA. Ad esempio, di recente 47,48 lavoro teorico ha suggerito che i modelli spaziali autorganizzati alla macro-scala possono essere realizzate con DNA CRNS attraverso un meccanismo di diffusione di reazione. Il metodo qui presentato fornisce un percorso praticabile per costruire i componenti molecolari sottostanti per tali materiali DNA auto-patterning. Anche se impegnativo, lo sviluppo di morfologie macro-scala in modo programmabile avrebbe implicazioni significative in settori che vanno dalla ricerca biomateriali alla medicina rigenerativa.

La prevedibilità di Watson-Crick base di abbinamento è permesso nanotecnologia del DNA dinamico di emergere come un modo programmabile per la progettazione di dispositivi molecolari con proprietà dinamiche 1,2. In particolare, lo spostamento filamento di DNA - una reazione di ibridazione competitiva programmabile - ha dimostrato di essere un potente meccanismo di ingegneria dei sistemi dinamici di DNA. In una reazione spostamento filamento di DNA, un oligonucleotide arrivo sposta una ciocca precedentemente legato &quot;uscita&quot; da un partner di legame complementare. Molteplici tali reazioni possono essere concatenati in cascate di reazione multi-step con un alto grado di controllo sull&#39;ordine e la tempistica della reazione individuale passi 3. DNA cascate spostamento filone sono stati utilizzati per creare circuiti digitali e analogici molecolari 4-7, 8-10 nanostrutture commutabili, motori molecolari autonome 11-15, e non covalenti amplificatori catalitiche 13,16-21. Inoltre, DDispositivi NA utilizzando reazioni di spostamento dei filamenti possono essere simulati e progettati per diverse applicazioni utilizzando il software di progettazione assistita da computer 22-24. Attualmente, il DNA sintetizzato chimicamente serve come il materiale principale per le nanotecnologie del DNA. Tuttavia, gli errori nel processo di sintesi del DNA, e le conseguenti oligonucleotidi imperfetti, si ritiene che limitare le prestazioni dei dispositivi di Dynamic DNA, provocando reazioni collaterali errati. Ad esempio, reazioni &quot;fuga&quot; possono causare il rilascio di un oligonucleotide uscita anche in assenza di un trigger reazione. Tali effetti sono più evidenti in cascate di reazione autocatalitiche dove anche una minima quantità di perdita iniziale eventualmente sfociare nella piena attivazione della cascata 19,20. Viceversa, reazioni spesso non riescono a raggiungere il livello atteso di attivazione perché alcuni componenti non attivano anche in presenza dell&#39;ingresso previsto 7,25. Per rendere le prestazioni di DNA-basednanodispositivi paragonabili alle loro controparti a base di proteine ​​biologiche, tali modalità di errore devono essere drasticamente ridotto. Plasmidi batterici o altro DNA biologico potrebbe servire come fonte relativamente a buon mercato di DNA altamente puro per applicazioni nanotecnologiche. Grandi quantità di DNA possono essere generati dalla replica nei batteri e le capacità di correzione di bozze intrinseche dei sistemi viventi garantiscono la purezza del DNA risultante. In effetti, diversi lavori recenti hanno riconosciuto la potenziale utilità del DNA biologico per applicazioni nanotecnologiche 21,26-28. Tuttavia, la natura completamente a doppio filamento di DNA plasmide ha finora vietato l&#39;uso come materiale per la realizzazione di dispositivi di DNA dinamici, normalmente rappresentato più oligonucleotidi e contengono entrambi i domini doppio filamento e singolo filamento. In un recente lavoro 29 questo problema è stato affrontato e una nuova architettura porta DNA che consiste principalmente di intaccate DNA a doppia elica (ndsDNA) era introdurred. È importante sottolineare che i sistemi di porte ndsDNA possono essere progettati che realizzano le dinamiche specificato da una rete formale reazione chimica (CRN) 29. cancelli ndsDNA potrebbero quindi essere utilizzati, in linea di principio, di creare sistemi dinamici che presentano oscillazioni e il caos, bistabilità e la memoria, la logica booleana o comportamenti algoritmici 30-38. Ad esempio, Rif. ​​29 hanno dimostrato una CRN tre reazione che ha fornito un&#39;implementazione molecolare di un protocollo &quot;consenso&quot;, un tipo di algoritmo di calcolo distribuito 29,39,40. Questo primo lavoro ha dimostrato un nuovo uso per il formalismo CRN come un &quot;linguaggio di programmazione&quot; per la rapida sintesi di sistemi molecolari funzionali (Figura 1A). Qui, è previsto un protocollo dettagliato per ricavare porte ndsDNA dal plasmide DNA. Il primo è una revisione del processo di progettazione sequenza. Segue una spiegazione di oligonucleotidi sintetici contenenti comele sequenze del cancello vengono clonati in plasmidi e la sequenza verificate e amplificati tramite coltura batterica. Successivamente, è mostrato come ndsDNA porte possono essere derivati ​​da plasmidi di trattamento enzimatico (vedere Figura 2). Infine, un metodo per testare il comportamento cancello utilizzando saggi cinetici fluorescenza è delineato. Meccanismo di reazione Come esempio, il protocollo si concentra sulla reazione chimica catalitica A + B-&gt; B + C. Le specie A, B, e C (&quot;segnali&quot;, Figura 1B) tutti corrispondono ad una diversa molecola di DNA a singolo filamento. Le sequenze di queste molecole sono completamente indipendenti ed i fili non reagiscono uno con l&#39;altro direttamente. Le sequenze di tutti i segnali hanno due differenti domini funzionali, cioè sottosequenze che agiscono insieme a reazioni di spostamento strand: 1) un punto d&#39;appoggio a dominio breve (etichette ta, tb, tc) che viene utilizzato per l&#39;avvio di filo spostamento reaction, e 2) una lunga dominio (etichette a, b, c), che determina l&#39;identità del segnale. Le interazioni tra fili del segnale sono mediati da intaccate DNA (ndsDNA) complessi a doppia elica del cancello (chiamati Join AB e forcella aC) e ausiliari di specie a singolo filamento (&lt;tr r&gt;, &lt;b tr&gt;, &lt;c tb&gt; e &lt;i tc &gt;). La reazione A + B- formale&gt; B + C viene eseguito attraverso una serie di stadi di reazione di spostamento del filo, in cui ogni stadio di reazione espone un punto d&#39;appoggio per una successiva reazione (Figura 1B). In questo esempio, i segnali A e B sono inizialmente libere in soluzione mentre il segnale C è legato al cancello forcella. Al termine della reazione B e C sono in soluzione. Più in generale, i segnali che sono associati a un cancello sono inattive mentre i segnali che sono liberi in soluzione sono attivi, cioè, essi possono partecipare a una reazione di spostamento del filo comeun ingresso. Il decorso della reazione viene seguito mediante una strategia reporter fluorescente (Figura 1C). Nel precedente lavoro 29, è stato dimostrato che questo meccanismo di reazione realizza non solo la stechiometria corretta ma anche la cinetica della reazione di destinazione.

<table><tbody><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix con buffer HF</td><td>NEB</td><td>M0531S</td><td></td></tr><tr><td>PvuII-HF</td><td>NEB</td><td>R3151L</td><td></td></tr><tr><td>PstI-HF</td><td>NEB</td><td>R3140S</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>Terrific Brodo, modificato</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T0918-250G</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Kit di preparazione maxi Hispeed</td><td>QIAGEN</td><td>12662</td><td></td></tr><tr><td>Nb.BsrDI</td><td>NEB</td><td>R0648L</td><td></td></tr><tr><td>Nt.BstNBI</td><td>NEB</td><td>R0607L</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blocchi genomici a doppio filamento</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horiba Jobin-Yvon Spex Fluorimetro Fluorolog-3</td>Celle di quarzo sintetico <td>Horiba/Jobin Yvon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Starna</td><td>23-5.45-S0G-5</td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione del gel QIAGEN</td><td>QIAGEN</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>Dorsali plasmidiche</td><td>BioBrick</td><td>E0240-pSB1A2</td><td>Plasmide ad alto numero di copie con resistenza all'ampicillina. La sequenza può essere trovata da http://parts.igem.org</td></tr></tbody></table>

plasmidi derivati ​​da dna strand displacement cancelli per reti di reazione implementazione chimici

Plasmid-derived DNA Strand Displacement Gates for Implementing Chemical Reaction Networks

La nanotecnologia del DNA richiede grandi quantità di DNA altamente puro come materiale ingegneristico. Il DNA plasmidico potrebbe soddisfare questa esigenza poiché viene replicato con alta fedeltà, è facilmente amplificato attraverso la coltura batterica e può essere conservato a tempo indeterminato sotto forma di scorte di glicerolo batterico. Tuttavia, la natura a doppio filamento del DNA plasmidico ha finora ostacolato il suo uso efficiente per la costruzione di nanostrutture o dispositivi di DNA che tipicamente contengono domini a singolo filamento o ramificati. In un recente lavoro, è stato scoperto che i cancelli di spostamento del filamento di DNA a doppio filamento (ndsDNA) potrebbero provenire dal DNA plasmidico. Quello che segue è un protocollo che descrive in dettaglio come questi cancelli di ndsDNA possono essere codificati in modo efficiente nei plasmidi e possono essere derivati dai plasmidi attraverso un piccolo numero di passaggi di elaborazione enzimatica. Viene inoltre fornito un protocollo per testare i gate ndsDNA utilizzando misure di cinetica di fluorescenza. I gate NdsDNA possono essere utilizzati per implementare reti di reazioni chimiche arbitrarie (CRN) e quindi fornire un percorso verso l'uso del formalismo CRN come linguaggio di programmazione molecolare prescrittivo. Per dimostrare questa tecnologia, viene costruita una cascata di reazioni a più stadi con cinetica catalitica. Inoltre, è dimostrato che i componenti derivati da plasmidi hanno prestazioni migliori rispetto a componenti identici assemblati da DNA sintetico.

Questo protocollo descrive un metodo per derivare le porte di spostamento del filamento di DNA dai plasmidi e testarli utilizzando misure di cinetica di fluorescenza. I gate possono essere composti in modo modulare in sistemi multi-componente per approssimare il comportamento delle reti formali di reazione chimica (CRN), dimostrando un nuovo uso dei CRN come linguaggio di programmazione molecolare.

Plasmidi derivati ​​da DNA Strand Displacement Cancelli per reti di reazione implementazione chimici

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di derivare le porte di spostamento del filamento di DNA dai plasmidi batterici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza il plasmide batterico come fonte altamente pura per generare robusti gate di DNA. A dimostrare questa procedura saranno i miei colleghi Sam Dip e io per iniziare la produzione di massa e quindi isolare i cancelli di DNA contenenti utilizzando kit di isolamento del DNA come descritto nel protocollo di testo allegato e in conformità con le istruzioni del produttore seguendo ellucian.Misurare la concentrazione di DNA plasmidico utilizzando tecniche standard. Quindi digerire il DNA aggiungendo quattro unità dell'enzima di restrizione PV U2 HF per ogni milligrammo di plasmide. Quindi, aggiungere due volumi equivalenti di etanolo assoluto ghiacciato al campione.Incubare la miscela a meno 80 gradi Celsius per almeno un'ora per far precipitare il DNA. Quindi pellettare il DNA precipitato centrifugando il campione a una velocità compresa tra 10.000 e 14.000 volte G e zero gradi Celsius per 30 minuti. Rimuovere lo SNAT e aggiungere al campione 1000 microlitri di etanolo al 95% a temperatura ambiente.Quindi capovolgere il campione da 10 a 15 volte, centrifugare il campione a una temperatura compresa tra 10.000 e 14.000 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Al termine, rimuovere il surnatante e asciugare il DNA all'aria su un banco per 10-20 minuti. Quando si rimuove il surnatante dal DNA precipitato, fare attenzione a non disturbare il pellet o la resa sarà significativamente ridotta.Una volta asciutto, risospendere il pellet di DNA in un massimo di 200 microlitri di acqua priva di nucleasi e vorticare per mescolare. L'aggiunta di più di 200 microlitri di acqua generalmente rende il campione da diluire per l'uso. Negli esperimenti di cinetica, misurare il DNA risospeso utilizzando uno spettrofotometro seguendo le istruzioni del produttore.Quindi aggiungere quattro unità dell'enzima di nicking M-B-B-S-R-D una per un microgrammo di plasmide e aggiungere il corrispondente tampone enzimatico. Incubare il campione a 65 gradi Celsius per un'ora per digerire i cancelli articolari. Successivamente, digerire le forchette aggiungendo otto unità dell'enzima di nicking NT BST mb una per un microgrammo di plasmide e il corrispondente tampone enzimatico.Incubare il campione a 55 gradi Celsius per un'ora. Per preparare i reporter fluorescenti prima Resus, sospendere e quantificare i campioni come descritto nel protocollo di testo allegato. Quindi mescolare 10 microlitri del filamento inferiore dei reporter con 13 microlitri del filamento del quencher superiore in tampone EDTA tris acetato con 12,5 millimolari di magnesio.Per garantire che tutta la flora, quattro filamenti etichettati siano estinti, è necessario aggiungere un eccesso del 30% del filamento etichettato per estinguere. Successivamente, analizzare il complesso C reporter utilizzando un termociclatore. Raffreddare il campione da 95 gradi Celsius a 20 gradi Celsius a una velocità di un grado Celsius al minuto.Al termine, conservare il campione a quattro gradi Celsius dopo la calibrazione. Iniziare le misurazioni della fluorescenza impostando prima il regolatore di temperatura a 25 gradi Celsius mentre la temperatura si stabilizza. Impostare i parametri corretti per le misure cinetiche nel software di acquisizione dati.Dopo aver aperto il software per il fluorimetro spettrale, impostare la larghezza di scorrimento a 2,73 nanometri sia per l'eccitazione che per l'emissione monocromatica. Quindi impostare il tempo di integrazione su 10 secondi per ogni 62° punto temporale e impostare il tempo di misurazione totale su 24 ore. Infine, impostare le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione in modo che corrispondano alla flora forestale utilizzata nell'esperimento.Successivamente, aggiungere 410,2 microlitri di acqua priva di nucleasi e 52,8 microlitri di 10 tampone EDTA in acetato extra contenente 125 millimolari di magnesio a una cella di quarzo sintetico. Aggiungere anche due microlitri di filamenti di poli T da 300 millimolari, quindi agitare la cella di quarzo sintetico per 10-15 secondi. Segue a nove microlitri dei filamenti reporter a 10 micromolari e sei microlitri di ciascun filamento ausiliario a 10 micromolari.Quindi, a 45 microlitri di entrambe le saracinesca articolare e a forcella, in un micromolare e mescolare delicatamente la soluzione pipettandola su e giù almeno 20 volte. Infine, a nove microlitri di sodio al 10% fare solfato duttale per raggiungere una concentrazione finale dello 0,15% SDS, mescolare delicatamente la reazione pipettando su e giù almeno 20 volte, posizionare immediatamente le celle di quarzo sintetiche nella camera del fluter degli spettri e avviare la misurazione cinetica. Dopo cinque minuti di misurazione, aggiungere tre microlitri dei filamenti di ingresso.Aggiungere 10 micromolari alla cella di quarzo sintetica. Mentre il programma di acquisizione dati è in pausa, miscelare delicatamente la reazione pipettandola su e giù almeno 20 volte, quindi chiudere il coperchio della luce e continuare a registrare la cinetica di reazione fino a quando non raggiunge la stabilità. I dati cinetici di stato per i gate derivati dal plasma e i gate sintetizzati sono mostrati qui negli esperimenti.La concentrazione del filamento di segnale A è fissa mentre la quantità del segnale catalitico B è variata. Il segnale C viene utilizzato per leggere l'andamento della reazione senza interruzioni. Il turnover del ciclo catalitico è definito come la quantità di segnale C prodotta per ciascun catalizzatore B in un dato momento.Per un sistema catalitico ideale, questo numero di turnover dovrebbe aumentare linearmente con il tempo ed essere indipendente dalla quantità di catalizzatore, purché il substrato non sia limitante. Qui si osserva che il sistema sintetizzato devia dall'aumento lineare ideale del turnover molto prima di quanto non faccia il sistema derivato dal plasma, indicando il sequestro del catalizzatore attraverso una reazione collaterale indesiderata. Qui vengono confrontate le perdite del circuito sia delle porte derivate dal plasma che di quelle sintetizzate, e si osserva che il rapporto del segnale di perdita utilizzando le porte derivate dal plasma è circa l'8% inferiore rispetto a quello che utilizza le porte sintetizzate dopo 10 ore di reazione.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare robusti gate di DNA da plasmidi batterici e testare i gate utilizzando misure di cinetica di fluorescenza.

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