Plasmidi derivati ​​da DNA Strand Displacement Cancelli per reti di reazione implementazione chimici

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di derivare le porte di spostamento del filamento di DNA dai plasmidi batterici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza il plasmide batterico come fonte altamente pura per generare robusti gate di DNA. A dimostrare questa procedura saranno i miei colleghi Sam Dip e io per iniziare la produzione di massa e quindi isolare i cancelli di DNA contenenti utilizzando kit di isolamento del DNA come descritto nel protocollo di testo allegato e in conformità con le istruzioni del produttore seguendo ellucian.

Misurare la concentrazione di DNA plasmidico utilizzando tecniche standard. Quindi digerire il DNA aggiungendo quattro unità dell'enzima di restrizione PV U2 HF per ogni milligrammo di plasmide. Quindi, aggiungere due volumi equivalenti di etanolo assoluto ghiacciato al campione.

Incubare la miscela a meno 80 gradi Celsius per almeno un'ora per far precipitare il DNA. Quindi pellettare il DNA precipitato centrifugando il campione a una velocità compresa tra 10.000 e 14.000 volte G e zero gradi Celsius per 30 minuti. Rimuovere lo SNAT e aggiungere al campione 1000 microlitri di etanolo al 95% a temperatura ambiente.

Quindi capovolgere il campione da 10 a 15 volte, centrifugare il campione a una temperatura compresa tra 10.000 e 14.000 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Al termine, rimuovere il surnatante e asciugare il DNA all'aria su un banco per 10-20 minuti. Quando si rimuove il surnatante dal DNA precipitato, fare attenzione a non disturbare il pellet o la resa sarà significativamente ridotta.

Una volta asciutto, risospendere il pellet di DNA in un massimo di 200 microlitri di acqua priva di nucleasi e vorticare per mescolare. L'aggiunta di più di 200 microlitri di acqua generalmente rende il campione da diluire per l'uso. Negli esperimenti di cinetica, misurare il DNA risospeso utilizzando uno spettrofotometro seguendo le istruzioni del produttore.

Quindi aggiungere quattro unità dell'enzima di nicking M-B-B-S-R-D una per un microgrammo di plasmide e aggiungere il corrispondente tampone enzimatico. Incubare il campione a 65 gradi Celsius per un'ora per digerire i cancelli articolari. Successivamente, digerire le forchette aggiungendo otto unità dell'enzima di nicking NT BST mb una per un microgrammo di plasmide e il corrispondente tampone enzimatico.

Incubare il campione a 55 gradi Celsius per un'ora. Per preparare i reporter fluorescenti prima Resus, sospendere e quantificare i campioni come descritto nel protocollo di testo allegato. Quindi mescolare 10 microlitri del filamento inferiore dei reporter con 13 microlitri del filamento del quencher superiore in tampone EDTA tris acetato con 12,5 millimolari di magnesio.

Per garantire che tutta la flora, quattro filamenti etichettati siano estinti, è necessario aggiungere un eccesso del 30% del filamento etichettato per estinguere. Successivamente, analizzare il complesso C reporter utilizzando un termociclatore. Raffreddare il campione da 95 gradi Celsius a 20 gradi Celsius a una velocità di un grado Celsius al minuto.

Al termine, conservare il campione a quattro gradi Celsius dopo la calibrazione. Iniziare le misurazioni della fluorescenza impostando prima il regolatore di temperatura a 25 gradi Celsius mentre la temperatura si stabilizza. Impostare i parametri corretti per le misure cinetiche nel software di acquisizione dati.

Dopo aver aperto il software per il fluorimetro spettrale, impostare la larghezza di scorrimento a 2,73 nanometri sia per l'eccitazione che per l'emissione monocromatica. Quindi impostare il tempo di integrazione su 10 secondi per ogni 62° punto temporale e impostare il tempo di misurazione totale su 24 ore. Infine, impostare le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione in modo che corrispondano alla flora forestale utilizzata nell'esperimento.

Successivamente, aggiungere 410,2 microlitri di acqua priva di nucleasi e 52,8 microlitri di 10 tampone EDTA in acetato extra contenente 125 millimolari di magnesio a una cella di quarzo sintetico. Aggiungere anche due microlitri di filamenti di poli T da 300 millimolari, quindi agitare la cella di quarzo sintetico per 10-15 secondi. Segue a nove microlitri dei filamenti reporter a 10 micromolari e sei microlitri di ciascun filamento ausiliario a 10 micromolari.

Quindi, a 45 microlitri di entrambe le saracinesca articolare e a forcella, in un micromolare e mescolare delicatamente la soluzione pipettandola su e giù almeno 20 volte. Infine, a nove microlitri di sodio al 10% fare solfato duttale per raggiungere una concentrazione finale dello 0,15% SDS, mescolare delicatamente la reazione pipettando su e giù almeno 20 volte, posizionare immediatamente le celle di quarzo sintetiche nella camera del fluter degli spettri e avviare la misurazione cinetica. Dopo cinque minuti di misurazione, aggiungere tre microlitri dei filamenti di ingresso.

Aggiungere 10 micromolari alla cella di quarzo sintetica. Mentre il programma di acquisizione dati è in pausa, miscelare delicatamente la reazione pipettandola su e giù almeno 20 volte, quindi chiudere il coperchio della luce e continuare a registrare la cinetica di reazione fino a quando non raggiunge la stabilità. I dati cinetici di stato per i gate derivati dal plasma e i gate sintetizzati sono mostrati qui negli esperimenti.

La concentrazione del filamento di segnale A è fissa mentre la quantità del segnale catalitico B è variata. Il segnale C viene utilizzato per leggere l'andamento della reazione senza interruzioni. Il turnover del ciclo catalitico è definito come la quantità di segnale C prodotta per ciascun catalizzatore B in un dato momento.

Per un sistema catalitico ideale, questo numero di turnover dovrebbe aumentare linearmente con il tempo ed essere indipendente dalla quantità di catalizzatore, purché il substrato non sia limitante. Qui si osserva che il sistema sintetizzato devia dall'aumento lineare ideale del turnover molto prima di quanto non faccia il sistema derivato dal plasma, indicando il sequestro del catalizzatore attraverso una reazione collaterale indesiderata. Qui vengono confrontate le perdite del circuito sia delle porte derivate dal plasma che di quelle sintetizzate, e si osserva che il rapporto del segnale di perdita utilizzando le porte derivate dal plasma è circa l'8% inferiore rispetto a quello che utilizza le porte sintetizzate dopo 10 ore di reazione.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare robusti gate di DNA da plasmidi batterici e testare i gate utilizzando misure di cinetica di fluorescenza.