Circuiti digitali genici basati su sistemi CRISPR-Cas e proteine anti-CRISPR

Il nostro protocollo spiega come progettare, costruire e analizzare circuiti digitali genici di lievito che utilizzano i sistemi dCas CRISPR di tipo due e cinque e le corrispondenti proteine anti-CRISPR. È assembly stay perché raccoglie zero procedure standard per assemblare e testare reti trascrizionali sintetiche nei servizi. Per iniziare, preparare una miscela di reazione contenente da 20 a 40 nanogrammi di modello di DNA, un microlitro di primer in avanti, un microlitro di primer inverso, cinque microlitri di miscela DNTP, 0,5 microlitri di DNA polimerasi, 10 microlitri di tampone di reazione 5x DNA polimerasi e acqua distillata doppia fino a un volume totale di 50 microlitri.

Amplificare le sequenze di DNA utilizzando il programma di PCR touchdown su un termociclatore come descritto nel manoscritto. Isolare i prodotti PCR mediante elettroforesi su gel e diluire le sequenze di DNA dal gel di agarosio tramite un kit di estrazione del gel di DNA. Utilizzando il metodo di assemblaggio Gibson, inserire i prodotti PCR purificati nel vettore shuttle tagliato-aperto lasciando entrare la miscela di DNA equimolare a 50 gradi Celsius per un'ora.

Costruire il vettore accettore dCas12a tramite PCR touchdown e il metodo di assemblaggio Gibson come dimostrato in precedenza. Inserire le proteine dCas12a ottimizzate per il codone di lievito nei due vettori accettori di nuova costruzione tramite digestione con BamH1 e Xhol1 e legatura con T4 DNA ligasi. Allo stesso modo, costruire i plasmidi basati sul vettore shuttle pRS2403 per esprimere le proteine anti-CRISPR tramite touchdown PCR e il metodo di assemblaggio Gibson.

Per eseguire il rilevamento di cellule al microscopio, posizionare due microlitri della soluzione cellulare su un vetrino e coprirlo con un vetrino. Osservare le cellule al microscopio a fluorescenza accendendo la sorgente luminosa fluorescente, il microscopio e il computer. Dopo aver annotato il numero della sorgente luminosa fluorescente, aprire il software del microscopio sul computer.

Metti il vetrino sul palco del microscopio e scegli l'obiettivo 40x mentre osservi le cellule sotto la luce verde. Spostare la manopola di messa a fuoco del corso fino a quando non appare il contorno delle cellule di lievito e la manopola di messa a fuoco fine per focalizzare le cellule. Per rilevare le cellule, dopo aver chiuso il campo visivo del microscopio passare allo schermo del computer e fare clic su live.

Attendere da tre a cinque secondi. Fare clic su cattura per scattare una foto e salvare l'immagine. Quindi, spegnere il computer, il microscopio e la sorgente luminosa fluorescente.

Accendere la macchina FACS 20 minuti prima delle misurazioni per riscaldare il laser e mescolare 20 microlitri di coltura cellulare con 300 microlitri di acqua bidistillata. Eseguire il software FACS sul computer collegato al computer FACS e creare un nuovo esperimento. Quindi impostare i parametri di misurazione.

Quindi, selezionare il filtro in base alle lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione dei campioni e impostare il numero della cella di acquisizione su 10.000. Regolare la tensione del filtro FITC misurando l'intensità delle sfere fluorescenti, assicurando che la differenza relativa nell'intensità delle sfere tra due esperimenti consecutivi non superi il 5%Lavare la macchina con acqua distillata doppia per alcuni secondi per rimuovere eventuali sfere in eccesso. Misurare l'intensità di fluorescenza del campione e fare clic sull'anteprima mentre si attende da tre a cinque secondi per la stabilità dell'iniezione del campione.

Infine clicca su acquisisci. Misurare nuovamente le perline alla fine dell'esperimento. Dopo aver verificato se la differenza relativa tra le due misurazioni delle perline supera il 5%Esportare i dati FACS come file FCS.

Apri R studio e carica lo script BDverse_analysis. R per analizzare i file FCS. Impostare il nome dell'esperimento come ename, il percorso della directory in cui i file FCS sono memorizzati come dir_d e i file dei risultati verranno creati come dir_r.

Quindi, impostare il canale di fluorescenza. Impostare il numero di campioni misurati. Le dimensioni dei grafici a punti e la lunghezza massima degli assi x e y per i grafici a barre e i box plot.

Scegli il metodo di valutazione rimuovendo l'hashtag dalle righe corrispondenti. Selezionare il gated dell'oggetto flowSet corrispondente al metodo di gating scelto e la risoluzione del dot plot, che deve essere almeno uguale a 256. Decommentare le due istruzioni di filtraggio per rimuovere le misurazioni in cui la fluorescenza è negativa e per rimuovere i valori anomali dovuti ad altri esperimenti come descritto nel manoscritto.

Premere source ed eseguire lo script. Tutti i file contenenti i risultati dell'analisi vengono creati in dir_r. La migliore efficienza di attivazione di dSpCas9-VP64 è stata raggiunta quando c'erano sei siti target lexOp sul promotore sintetico.

Mentre per dCas12a-VPR massima efficienza di attivazione quando tre copie di lexOp sono state inserite nel promotore sintetico. L'attivazione da parte dell'RNA CRISPR e dell'RNA guida singolo localizzato su un plasmide integrativo era da 1,4 a 2,4 e da 1,1 a 1,5 volte superiore rispetto a quando era stato posto su un plasmide episomiale. I risultati di RT-qPCR hanno mostrato che un vettore episomiale ha prodotto un livello molto più elevato di RNA CRISPR RNA guida rispetto al vettore integrativo, indipendentemente dal sistema di espressione.

È stata testata l'efficienza di attivazione del complesso dSpCas9 e dello scaffold RNA che recluta MCP-VP64. L'RNA dello scaffold contenente un singolo wild type e una forcina F6MS2 ha dato rispettivamente un'attivazione di 5,27 e 4,3 volte. Tuttavia, la combinazione delle due forcine ha portato a 7,54 volte con la massima efficienza di attivazione.

Quattro diversi promotori sono stati utilizzati per guidare l'espressione di tre tipi di anti CRISPR di tipo due, dimostrando che funzionavano in modo dose-dipendente. Un forte promotore ha ridotto il livello di fluorescenza rispettivamente a 0,21, 0,11 e 0,13 del suo valore. La curva di titolazione mostra che il circuito si comporta come un'andatura nodata con un rapporto on-off che si avvicina a 2,3.

Il tipo cinque anti-CRISPR A riduce l'espressione di fluorescenza di denAS-Cas12a e dLB-Cas12a come attivatori dal 19% al 71%La relazione tra attivatori e repressori è stata studiata dove quello Acr-VA ha mostrato grandi fluttuazioni nelle sue prestazioni quando prodotto da pGAL1 sotto pTEF1 e genetico CYC1t-pCYC1noTata tipo cinque anti-CRISPR-A1 ha mostrato una certa repressione solo sul nudo dLB Cas12a. La macchina FACS è fragile, quindi deve essere maneggiata con cura. La soluzione cellulare non deve mai essere troppo densa e la macchina deve essere mantenuta pulita.