Name: Circuiti digitali genici basati su sistemi CRISPR-Cas e proteine anti-CRISPR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Scopri come progettare circuiti genici digitali in lievito utilizzando i sistemi CRISPR dCas di tipo due e cinque e le proteine anti-CRISPR. Questo metodo avanzato migliora la comprensione della regolazione trascrizionale in Saccharomyces cerevisiae.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Vogliamo ringraziare tutti gli studenti del laboratorio di biologia sintetica - SPST, TJU - per il loro aiuto generale, insieme a Zhi Li e Xiangyang Zhang per la loro assistenza negli esperimenti FACS.

<ol><li>Marchisio, M. A., Stelling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+design+of+digital+synthetic+gene+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Automatic design of digital synthetic gene circuits.</a> PLOS Computational Biology. 7 (2), 1001083(2011).</li>
<li>Karnaugh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+map+method+for+synthesis+of+combinational+logic+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+American+Institute+of+Electrical+Engineers%22%5BJournal%5D)">The map method for synthesis of combinational logic circuits.</a> Transactions of the American Institute of Electrical Engineers. 72 (9), 593-599 (1953).</li>
<li>Mandell, J. G., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+finger+tools%3A+custom+DNA-binding+domains+for+transcription+factors+and+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Zinc finger tools: custom DNA-binding domains for transcription factors and nucleases.</a> Nucleic Acids Research. 34, 516-523 (2006).</li>
<li>Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAL+effectors%3A+customizable+proteins+for+DNA+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting.</a> Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).</li>
<li>Drinnenberg, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNAi in budding yeast.</a> Science. 326 (5952), 544-550 (2009).</li>
<li>Gander, M. W., Vrana, J. D., Voje, W. E., Carothers, J. M., Klavins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+logic+circuits+in+yeast+with+CRISPR-dCas9+NOR+gates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Digital logic circuits in yeast with CRISPR-dCas9 NOR gates.</a> Nature Communications. 8, 15459(2017).</li>
<li>Farzadfard, F., Perli, S. D., Lu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+and+multifunctional+eukaryotic+transcription+factors+based+on+CRISPR%2FCas%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Tunable and multifunctional eukaryotic transcription factors based on CRISPR/Cas.</a> ACS Synthetic Biology. 2 (10), 604-613 (2013).</li>
<li>Nakamura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-CRISPR-mediated+control+of+gene+editing+and+synthetic+circuits+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Anti-CRISPR-mediated control of gene editing and synthetic circuits in eukaryotic cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 194(2019).</li>
<li>Louvion, J. F., Havaux-Copf, B., Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+GAL4-VP16+to+a+steroid-binding+domain+provides+a+tool+for+gratuitous+induction+of+galactose-responsive+genes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Fusion of GAL4-VP16 to a steroid-binding domain provides a tool for gratuitous induction of galactose-responsive genes in yeast.</a> Gene. 131 (1), 129-134 (1993).</li>
<li>DiCarlo, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.</a> Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).</li>
<li>Gao, Y., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-processing+of+ribozyme-flanked+RNAs+into+guide+RNAs+in+vitro+and+in+vivo+for+CRISPR-mediated+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Self-processing of ribozyme-flanked RNAs into guide RNAs in vitro and in vivo for CRISPR-mediated genome editing.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 56 (4), 343-349 (2014).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li>
<li>Fonfara, I., Richter, H., Bratovic, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR-associated+DNA-cleaving+enzyme+Cpf1+also+processes+precursor+CRISPR+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA.</a> Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).</li>
<li>Yu, L., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+synthetic+transcriptional+networks+harnessing+dCas12a+and+Type+V-A+anti-CRISPR+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae synthetic transcriptional networks harnessing dCas12a and Type V-A anti-CRISPR proteins.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (4), 870-883 (2021).</li>
<li>Zhang, Y., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+bare+dSpCas9%2C+scaffold+gRNA%2C+and+type+II+anti-CRISPR+proteins+highly+favors+the+control+of+gene+expression+in+the+yeast+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Interaction of bare dSpCas9, scaffold gRNA, and type II anti-CRISPR proteins highly favors the control of gene expression in the yeast S. cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (1), 176-190 (2022).</li>
<li>Sheff, M. A., Thorn, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+cassettes+for+fluorescent+protein+tagging+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Optimized cassettes for fluorescent protein tagging in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 21 (8), 661-670 (2004).</li>
<li>Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRdirect%3A+software+for+designing+CRISPR%2FCas+guide+RNA+with+reduced+off-target+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites.</a> Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).</li>
<li>Chee, M. K., Haase, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+redesigned+pRS+plasmid+shuttle+vectors+for+genetic+manipulation+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%7CGenomes%7CGenetics%22%5BJournal%5D)">New and redesigned pRS plasmid shuttle vectors for genetic manipulation of Saccharomyces cerevisiae.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 2 (5), 515-526 (2012).</li>
<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+DNA+fragments+in+yeast+by+one-step+assembly+of+overlapping+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 37 (20), 6984-6990 (2009).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e253(2007).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+Cloning.+Fourth+edition%22">Molecular Cloning. Fourth edition</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).</li>
<li>Sanger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+nucleotide+sequences+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Determination of nucleotide sequences in DNA.</a> Science. 214 (4526), 1205-1210 (1981).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate%2Fsingle-stranded+carrier+DNA%2Fpolyethylene+glycol+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).</li>
<li>Zalatan, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+complex+synthetic+transcriptional+programs+with+CRISPR+RNA+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds.</a> Cell. 160 (1-2), 339-350 (2015).</li>
<li>Song, W., Li, J., Liang, Q., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+terminators+be+used+as+insulators+into+yeast+synthetic+gene+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Can terminators be used as insulators into yeast synthetic gene circuits.</a> Journal of Biological Engineering. 10, 19(2016).</li>
<li>Rauch, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+CRISPR-Cas9+with+bacteriophage+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inhibition of CRISPR-Cas9 with bacteriophage proteins.</a> Cell. 168 (1-2), 150-158 (2017).</li>
<li>Hynes, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anti-CRISPR+from+a+virulent+streptococcal+phage+inhibits+Streptococcus+pyogenes+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">An anti-CRISPR from a virulent streptococcal phage inhibits Streptococcus pyogenes Cas9.</a> Nature Microbiology. 2 (10), 1374-1380 (2017).</li>
<li>Watters, K. E., Fellmann, C., Bai, H. B., Ren, S. M., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+of+natural+CRISPR-Cas12a+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery of natural CRISPR-Cas12a inhibitors.</a> Science. 362 (6411), 236-239 (2018).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Research. 33 (20), 179(2005).</li>
<li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Research. 29 (9), 45(2001).</li>
<li>Hahne, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((flowCore%3A+a+Bioconductor+package+for+high+throughput+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">flowCore: a Bioconductor package for high throughput flow cytometry.</a> BMC Bioinformatics. 10 (1), 106(2009).</li>
<li>Li, J., Xu, Z., Chupalov, A., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-CRISPR-based+biosensors+in+the+yeast+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Anti-CRISPR-based biosensors in the yeast S. cerevisiae.</a> Journal of Biological Engineering. 12, 11(2018).</li>
<li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anti-CRISPR+protein+disables+type+V+Cas12a+by+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An anti-CRISPR protein disables type V Cas12a by acetylation.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 26 (4), 308-314 (2019).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano alcun interesse finanziario concorrente.

Il protocollo ha mostrato un possibile flusso di lavoro completo per circuiti digitali di geni sintetici, seguendo il ciclo di ingegneria biologica "Design-Build-Test-Learn" (DBTL) e riguardante sia esperimenti di laboratorio secco che di laboratorio umido. Qui, ci siamo concentrati sul sistema CRISPR-Cas, principalmente dSpCas9, denAsCas12a, dLbCas12a e le corrispondenti proteine anti-CRISPR, progettando e costruendo in S. cerevisiae piccole reti trascrizionali. Alcuni di loro imitavano le porte booleane, che s...

Nel 2011, i ricercatori hanno proposto un metodo computazionale e sviluppato un software corrispondente per la progettazione automatica di circuiti genetici sintetici digitali1. Un utente doveva specificare il numero di ingressi (tre o quattro) e compilare la tabella di verità del circuito; Ciò ha fornito tutte le informazioni necessarie per derivare la struttura del circuito utilizzando tecniche dall'elettronica. La tavola di verità è stata tradotta in due formule booleane tramite il metodo 2 della mappa di Karnaugh. Ogni formula booleana è composta da clausole che descrivono le operazioni logiche (somma o moltiplicazione) tra (parte di) gli ingressi del circuito e le loro negazioni (i letterali). Le clausole, a loro volta, vengono sommate (OR) o moltiplicate (AND) per calcolare l'uscita del circuito. Ogni circuito può essere realizzato secondo una qualsiasi delle sue due formule corrispondenti: una scritta in forma POS (prodotto di somme) e l'altra in rappresentazione SOP (somma di prodotti). Il primo consiste in una moltiplicazione di clausole (cioè porte booleane) che contengono una somma logica dei letterali. Quest'ultimo, al contrario, è una somma di clausole in cui i valori letterali sono moltiplicati.
I circuiti elettrici possono essere realizzati, su una breadboard, collegando fisicamente diversi cancelli insieme. La corrente elettrica consente lo scambio di segnali tra i gate, che porta al calcolo dell'uscita.
In biologia, la situazione è più complessa. Un gate booleano può essere realizzato come unità di trascrizione (TU; cioè la sequenza "promotore-codificante regione-terminatore" all'interno di cellule eucariotiche), dove la trascrizione o la traduzione (o entrambe) sono regolate. Quindi, almeno due tipi di molecole stabiliscono un cablaggio biologico: le proteine del fattore di trascrizione e gli RNA antisenso non codificanti1.
Un circuito digitale genico è organizzato in due o tre strati di porte, vale a dire: 1) lo strato di ingresso, che è costituito da SÌ (buffer) e NON porte e converte le sostanze chimiche in ingresso in molecole di cablaggio; 2) il livello interno, che consiste di tanti TU quante sono le clausole nella corrispondente formula booleana. Se il circuito è progettato secondo la formula SOP, ogni clausola nello strato interno produrrà l'uscita del circuito (ad esempio, fluorescenza) in una cosiddetta architettura di uscita distribuita. Se viene utilizzata la formula del prodotto della somma (POS), è necessario uno strato finale 3), che conterrà un singolo gate moltiplicativo che raccoglie le molecole di cablaggio dallo strato interno.
Nel complesso, in biologia sintetica, molti schemi diversi possono essere progettati per lo stesso circuito. Differiscono nel numero e nel tipo di TU e molecole di cablaggio. Al fine di scegliere la soluzione più semplice da implementare nelle cellule di lievito, ogni progetto di circuito è associato a un punteggio di complessità S, definito come
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64539/64539eq01.jpg" style="margin: auto;">
dove A rappresenta il numero di attivatori, R rappresenta il numero di repressori e A è la quantità di molecole di RNA antisenso. Se gli attivatori o i repressori sono assenti dal circuito, il loro contributo a S è zero. Pertanto, è più difficile realizzare uno schema circuitale in laboratorio (alto S) quando richiede un numero elevato di fattori di trascrizione ortogonali. Ciò significa che nuovi attivatori e repressori devono essere progettati de novo per realizzare il cablaggio completo all'interno dei circuiti digitali. In linea di principio, nuove proteine leganti il DNA possono essere assemblate utilizzando le proteine Zinc Finger3 e gli effettori TAL4 come modelli. Tuttavia, questa opzione appare troppo ardua e richiede tempo; pertanto, si dovrebbe fare affidamento principalmente su piccoli RNA e regolazione della traduzione per finalizzare circuiti genici complessi.
Originariamente, questo metodo è stato sviluppato per fabbricare circuiti digitali nei batteri. Infatti, nelle cellule eucariotiche, invece che di RNA antisenso, è più adatto parlare di microRNA (miRNA) o piccoli RNA interferenti (siRNA)5. Tuttavia, la via dell'RNAi non è presente nel lievito S. cerevisiae. Quindi, si dovrebbe optare per reti completamente trascrizionali. Supponiamo che un circuito abbia bisogno di cinque attivatori e cinque repressori; il suo punteggio di complessità sarebbe S = 32. La complessità del circuito può essere ridotta sostituendo i 10 fattori di trascrizione con un singolo dCas96 (Cas9 carente di nucleasi) fuso in un dominio di attivazione (AD). Come mostrato in7, dCas9-AD funziona come repressore nel lievito quando lega un promotore tra la scatola TATA e il TSS (sito di inizio della trascrizione) e come attivatore quando si lega bene a monte della scatola TATA. Pertanto, è possibile sostituire 10 fattori di trascrizione con una singola proteina di fusione dCas9-AD e 10 sgRNA (RNA guida singola) per un punteggio di complessità totale di S = 11. È facile e veloce sintetizzare dieci sgRNA, mentre, come precedentemente commentato, l'assemblaggio di 10 proteine richiederebbe un lavoro molto più lungo e complicato.
In alternativa, si potrebbero usare due proteine dCas ortogonali (ad esempio, dCas9 e dCas12a): una per fondersi con un AD, e l'altra nuda o in combinazione con un dominio di repressione. Il punteggio di complessità aumenterebbe di una sola unità (S = 12). Quindi, i sistemi CRISPR-dCas sono la chiave per la costruzione di circuiti digitali genici molto complessi in S. cerevisiae.
Questo documento caratterizza profondamente l'efficienza dei repressori e degli attivatori basati su dCas9 e dCas12a nel lievito. I risultati mostrano che non richiedono un'elevata quantità di sgRNA per ottimizzare la loro attività, quindi i plasmidi episomiali sono preferenzialmente evitati. Inoltre, gli attivatori basati su dCas9 sono molto più efficaci quando si utilizza uno scaffold RNA (scRNA) che recluta copie del VP64 AD. Al contrario, dCas12a funziona bene se fuso direttamente al potente VPR AD. Inoltre, un promotore sintetico attivato richiede un numero variabile di siti bersaglio, a seconda della configurazione dell'attivatore (ad esempio, tre quando si utilizza dCas12a-VPR, sei per dCas9-VP64 e solo uno con dCas9 e uno scRNA). Come repressore, dCas12a appare più incisivo quando si lega la regione codificante piuttosto che il promotore.
Come svantaggio, tuttavia, CRISPR-dCas9 / dCas12a non interagiscono direttamente con le sostanze chimiche. Pertanto, potrebbero non essere utili nel livello di input. Per questo motivo, sono stati studiati progetti alternativi di gate booleani contenenti proteine anti-CRISPR (Acrs). Gli Acr agiscono sulle proteine (d)Cas e ne inibiscono il funzionamento8. Quindi, sono un mezzo per modulare l'attività dei sistemi CRISPR-(d)Cas. Questo articolo analizza a fondo le interazioni tra il tipo II Acrs e (d)Cas9, così come il tipo V Acrs e (d)Cas12a in S. cerevisiae. Poiché gli Acr sono molto più piccoli delle proteine Cas, è stato costruito un gate NOT sensibile all'estrogeno β-estradiolo fondendo il dominio legante l'ormone del recettore degli estrogeni umani9-HBD (hER) ad AcrIIA4. Inoltre, sono state realizzate una manciata di porte SÌ e NON che esprimevano costitutivamente dCas12a(-AD) e AcrVA dopo induzione con galattosio. Al momento, queste porte servono solo come prova di concetto. Tuttavia, rappresentano anche il primo passo verso un profondo ripensamento dell'algoritmo per effettuare la progettazione automatica computazionale di circuiti digitali genici sintetici nelle cellule di lievito.

<table><tbody><tr><td>Provette per PCR da 0,1 mL a 8 strisce</td><td>NEST</td><td>403112</td><td></td></tr><tr><td>Provette per PCR da 0,2 mL</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>Microprovette da 1,5 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga da 15 mL</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011150</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Microprovette</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga da 50 mL</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011500</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio-grado di biologia molecolare</td><td>Invitrogen</td><td>75510-019</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina sale sodico</td><td>Solarbio</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Applied biosystems veriti Termociclatore a 96 pozzetti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>AxyPrep Kit di estrazione del gel di DNA</td><td>Axygen</td><td>AP-GX-250</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSuite CS& Amp; Perle di ricerca T</td><td>BD</td><td>650621</td><td>Perle fluorescenti</td></tr><tr><td>BD FACSVicitometro a flusso aziendale&nbsp;</td><td>BD-Centrifuge</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Sorvall ST 16R</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004380</td><td></td></tr><tr><td>E. coli cellule competenti (Ceppo DH5&alfa;)</td><td>Life Technologies</td><td>18263-012</td><td></td></tr><tr><td>ECL seleziona il reagente di rilevamento Western Blotting</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2235</td><td></td></tr><tr><td>Apparecchio per elettroforesi</td><td>Beijing JUNYI Electrophoresis Co., Ltd</td><td>JY300C</td><td></td></tr><tr><td>Tappi piatti a 8 strisce</td><td>NEST</td><td>406012</td><td></td></tr><tr><td>Società di sintesi genica</td><td>Azenta Life Sciences</td><td></td><td>https://web.azenta.com/zh-cn/azenta-life-sciences</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario adsorbito incrociato anti-topo di capra Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>Kit di sintesi di cDNA HiFiScript</td><td>CWBIO</td><td>CW2569M</td><td>Kit utilizzato nella fase 6.2.2.1</td></tr><tr><td>Soluzione di lisato (Zymolyase)</td><td>zymoresearch</td><td>E1004-A</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza Nikon Eclipse 80i</td><td>Nikon</td><td>- </td><td>Microscopio a fluorescenza</td></tr><tr><td>Punte di pipette&mdash; 10 &mu; L</td><td>Axygen</td><td>T-300-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Punte per pipette&mdash; 1000 &mu; L</td><td>Axygen</td><td>T-1000-B-R-S Punte per</td><td></td></tr><tr><td>pipette&mdash; 200 &mu; L</td><td>Axygen</td><td>T-200-Y-R-S</td><td></td></tr><tr><td>pRSII403</td><td>Addgene</td><td>35436</td><td></td></tr><tr><td>pRSII404</td><td>Addgene</td><td>35438</td><td></td></tr><tr><td>pRSII405</td><td>Addgene</td><td>35440</td><td></td></tr><tr><td>pRSII406</td><td>Addgene</td><td>35442</td><td></td></tr><tr><td>pRSII424</td><td>Addgene</td><td>35466</td><td></td></tr><tr><td>pTPGI_dSpCas9_VP64&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>49013</td><td></td></tr><tr><td>Q5 DNA polimerasi ad alta fedeltà</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491</td><td></td></tr><tr><td>Enzima di restrizione-Acc65I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0599</td><td></td></tr><tr><td>Enzima di restrizione-BamHI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136</td><td></td></tr><tr><td>Enzima di restrizione-SacI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3156</td><td></td></tr><tr><td>Enzima di restrizione-XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146</td><td></td></tr><tr><td>Roche LightCycler 96&nbsp;</td><td>Strumento Roche-Real-Time</td><td></td> <td>PCR</td></tr><tr><td>S. cerevisiae CEN. PK2-1C</td><td>-</td><td>-</td><td>Il ceppo genitore. Il genotipo è: MATa; il suo3D1; leu2-3_112; URA3-52; TRP1-289; MAL2-8c; Kit SUC2</td></tr><tr><td>Stem-Loop</td><td>SparkJade</td><td>AG0502</td><td>Kit utilizzato nel passaggio 6.2.1.3</td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>BIO-RAD</td><td>186-1096</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>T5 Esonucleasi</td><td>New England Biolabs</td><td>M0363</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA ligasi</td><td>New England Biolabs</td><td>M0208</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polimerasi</td><td>New England Biolabs</td><td>M0495</td><td></td></tr><tr><td>TB Premix verde Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2x) (colorante SYBR Green I)</td><td>Takara</td><td>RR820Q</td><td></td></tr><tr><td>Kit RNA YeaStar</td><td>Zymo Research</td><td>R1002</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-estradiolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8875</td><td></td></tr></tbody></table>

circuiti digitali genici basati su sistemi crispr-cas e proteine anti-crispr

Gene Digital Circuits Based on CRISPR-Cas Systems and Anti-CRISPR Proteins

I gate booleani e i circuiti digitali dei geni sintetici hanno una vasta gamma di applicazioni, dalla diagnostica medica alla cura dell'ambiente. La scoperta dei sistemi CRISPR-Cas e dei loro inibitori naturali, le proteine anti-CRISPR (Acrs), fornisce un nuovo strumento per progettare e implementare circuiti digitali genici in vivo . Qui, descriviamo un protocollo che segue l'idea del ciclo di ingegneria biologica "Design-Build-Test-Learn" e fa uso di dCas9 / dCas12a insieme ai loro corrispondenti Acr per stabilire piccole reti trascrizionali, alcune delle quali si comportano come porte booleane, in Saccharomyces cerevisiae. Questi risultati evidenziano le proprietà di dCas9/dCas12a come fattori di trascrizione. In particolare, per ottenere la massima attivazione dell'espressione genica, dSpCas9 deve interagire con un RNA scaffold ingegnerizzato che raccoglie più copie del dominio di attivazione VP64 (AD). Al contrario, dCas12a deve essere fuso, al terminale C, con il forte VP64-p65-Rta (VPR) AD. Inoltre, l'attività di entrambe le proteine Cas non è potenziata aumentando la quantità di sgRNA/crRNA nella cellula. Questo articolo spiega anche come costruire porte booleane basate sull'interazione CRISPR-dCas-Acr. Il dominio di legame ormonale fuso AcrIIA4 del recettore degli estrogeni umani è il nucleo di un gate NOT sensibile al β-estradiolo, mentre gli AcrVA sintetizzati dal promotore inducibile GAL1 consentono di imitare sia le porte SÌ che NOT con galattosio come input. In questi ultimi circuiti, AcrVA5, insieme a dLbCas12a, ha mostrato il miglior comportamento logico.

Espressione di sgRNA/crRNA da parte di un promotore di tipo III della RNA polimerasi In primo luogo, questo lavoro ha affrontato l'ingegneria del circuito di attivazione trascrizionale (circuito 1) mostrato nella Figura 1A. Conteneva tre componenti di base: 1) il gene che codifica per yEGFP (il reporter), che è stato preceduto da una serie di diversi promotori sintetici che hanno fornito siti bersaglio per dCas9 / dCas12a-AD; 2) una versione ottimizzata per il codone di l...

I sistemi CRISPR-Cas e le proteine anti-CRISPR sono stati integrati nello schema delle porte booleane in Saccharomyces cerevisiae. I nuovi piccoli circuiti logici hanno mostrato buone prestazioni e approfondito la comprensione sia dei fattori di trascrizione basati su dCas9/dCas12a che delle proprietà delle proteine anti-CRISPR.

Circuiti digitali genici basati su sistemi CRISPR-Cas e proteine anti-CRISPR

Synthetic gene Boolean gates and digital circuits have a broad range of applications, from medical diagnostics to environmental care. The discovery of the ...

Il nostro protocollo spiega come progettare, costruire e analizzare circuiti digitali genici di lievito che utilizzano i sistemi dCas CRISPR di tipo due e cinque e le corrispondenti proteine anti-CRISPR. È assembly stay perché raccoglie zero procedure standard per assemblare e testare reti trascrizionali sintetiche nei servizi. Per iniziare, preparare una miscela di reazione contenente da 20 a 40 nanogrammi di modello di DNA, un microlitro di primer in avanti, un microlitro di primer inverso, cinque microlitri di miscela DNTP, 0,5 microlitri di DNA polimerasi, 10 microlitri di tampone di reazione 5x DNA polimerasi e acqua distillata doppia fino a un volume totale di 50 microlitri.Amplificare le sequenze di DNA utilizzando il programma di PCR touchdown su un termociclatore come descritto nel manoscritto. Isolare i prodotti PCR mediante elettroforesi su gel e diluire le sequenze di DNA dal gel di agarosio tramite un kit di estrazione del gel di DNA. Utilizzando il metodo di assemblaggio Gibson, inserire i prodotti PCR purificati nel vettore shuttle tagliato-aperto lasciando entrare la miscela di DNA equimolare a 50 gradi Celsius per un'ora.Costruire il vettore accettore dCas12a tramite PCR touchdown e il metodo di assemblaggio Gibson come dimostrato in precedenza. Inserire le proteine dCas12a ottimizzate per il codone di lievito nei due vettori accettori di nuova costruzione tramite digestione con BamH1 e Xhol1 e legatura con T4 DNA ligasi. Allo stesso modo, costruire i plasmidi basati sul vettore shuttle pRS2403 per esprimere le proteine anti-CRISPR tramite touchdown PCR e il metodo di assemblaggio Gibson.Per eseguire il rilevamento di cellule al microscopio, posizionare due microlitri della soluzione cellulare su un vetrino e coprirlo con un vetrino. Osservare le cellule al microscopio a fluorescenza accendendo la sorgente luminosa fluorescente, il microscopio e il computer. Dopo aver annotato il numero della sorgente luminosa fluorescente, aprire il software del microscopio sul computer.Metti il vetrino sul palco del microscopio e scegli l'obiettivo 40x mentre osservi le cellule sotto la luce verde. Spostare la manopola di messa a fuoco del corso fino a quando non appare il contorno delle cellule di lievito e la manopola di messa a fuoco fine per focalizzare le cellule. Per rilevare le cellule, dopo aver chiuso il campo visivo del microscopio passare allo schermo del computer e fare clic su live.Attendere da tre a cinque secondi. Fare clic su cattura per scattare una foto e salvare l'immagine. Quindi, spegnere il computer, il microscopio e la sorgente luminosa fluorescente.Accendere la macchina FACS 20 minuti prima delle misurazioni per riscaldare il laser e mescolare 20 microlitri di coltura cellulare con 300 microlitri di acqua bidistillata. Eseguire il software FACS sul computer collegato al computer FACS e creare un nuovo esperimento. Quindi impostare i parametri di misurazione.Quindi, selezionare il filtro in base alle lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione dei campioni e impostare il numero della cella di acquisizione su 10.000. Regolare la tensione del filtro FITC misurando l'intensità delle sfere fluorescenti, assicurando che la differenza relativa nell'intensità delle sfere tra due esperimenti consecutivi non superi il 5%Lavare la macchina con acqua distillata doppia per alcuni secondi per rimuovere eventuali sfere in eccesso. Misurare l'intensità di fluorescenza del campione e fare clic sull'anteprima mentre si attende da tre a cinque secondi per la stabilità dell'iniezione del campione.Infine clicca su acquisisci. Misurare nuovamente le perline alla fine dell'esperimento. Dopo aver verificato se la differenza relativa tra le due misurazioni delle perline supera il 5%Esportare i dati FACS come file FCS.Apri R studio e carica lo script BDverse_analysis. R per analizzare i file FCS. Impostare il nome dell'esperimento come ename, il percorso della directory in cui i file FCS sono memorizzati come dir_d e i file dei risultati verranno creati come dir_r.Quindi, impostare il canale di fluorescenza. Impostare il numero di campioni misurati. Le dimensioni dei grafici a punti e la lunghezza massima degli assi x e y per i grafici a barre e i box plot.Scegli il metodo di valutazione rimuovendo l'hashtag dalle righe corrispondenti. Selezionare il gated dell'oggetto flowSet corrispondente al metodo di gating scelto e la risoluzione del dot plot, che deve essere almeno uguale a 256. Decommentare le due istruzioni di filtraggio per rimuovere le misurazioni in cui la fluorescenza è negativa e per rimuovere i valori anomali dovuti ad altri esperimenti come descritto nel manoscritto.Premere source ed eseguire lo script. Tutti i file contenenti i risultati dell'analisi vengono creati in dir_r. La migliore efficienza di attivazione di dSpCas9-VP64 è stata raggiunta quando c'erano sei siti target lexOp sul promotore sintetico.Mentre per dCas12a-VPR massima efficienza di attivazione quando tre copie di lexOp sono state inserite nel promotore sintetico. L'attivazione da parte dell'RNA CRISPR e dell'RNA guida singolo localizzato su un plasmide integrativo era da 1,4 a 2,4 e da 1,1 a 1,5 volte superiore rispetto a quando era stato posto su un plasmide episomiale. I risultati di RT-qPCR hanno mostrato che un vettore episomiale ha prodotto un livello molto più elevato di RNA CRISPR RNA guida rispetto al vettore integrativo, indipendentemente dal sistema di espressione.È stata testata l'efficienza di attivazione del complesso dSpCas9 e dello scaffold RNA che recluta MCP-VP64. L'RNA dello scaffold contenente un singolo wild type e una forcina F6MS2 ha dato rispettivamente un'attivazione di 5,27 e 4,3 volte. Tuttavia, la combinazione delle due forcine ha portato a 7,54 volte con la massima efficienza di attivazione.Quattro diversi promotori sono stati utilizzati per guidare l'espressione di tre tipi di anti CRISPR di tipo due, dimostrando che funzionavano in modo dose-dipendente. Un forte promotore ha ridotto il livello di fluorescenza rispettivamente a 0,21, 0,11 e 0,13 del suo valore. La curva di titolazione mostra che il circuito si comporta come un'andatura nodata con un rapporto on-off che si avvicina a 2,3.Il tipo cinque anti-CRISPR A riduce l'espressione di fluorescenza di denAS-Cas12a e dLB-Cas12a come attivatori dal 19% al 71%La relazione tra attivatori e repressori è stata studiata dove quello Acr-VA ha mostrato grandi fluttuazioni nelle sue prestazioni quando prodotto da pGAL1 sotto pTEF1 e genetico CYC1t-pCYC1noTata tipo cinque anti-CRISPR-A1 ha mostrato una certa repressione solo sul nudo dLB Cas12a. La macchina FACS è fragile, quindi deve essere maneggiata con cura. La soluzione cellulare non deve mai essere troppo densa e la macchina deve essere mantenuta pulita.

gene-digital-circuits-based-on-crispr-cas-systems-anti-crispr

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Il sistema / Cas9 CRISPR offre il potenziale per fare l'editing genoma mirato accessibile e conveniente per la comunità scientifica. Questo protocollo ha lo scopo di dimostrare come creare virus che sarà ad eliminazione diretta di un gene di interesse utilizzando il sistema / Cas9 CRISPR, e poi iniettare stereotassica nel cervello di topo adulto.

Progettazione, Packaging, e consegna di alto titolo CRISPR Retro e lentivirus via Stereotassica iniezione

L'editing genomico mirato nel sistema modello Danio rerio (pesce zebra) notevolmente è stata facilitata dall'emergere di approcci basati su CRISPR. Qui, descriviamo un protocollo semplificato, robusto per la generazione e l'identificazione degli alleli di assurdità CRISPR-derivato che incorpora l'analisi di mobilità dell'eteroduplex e identificazione delle mutazioni mediante sequenziamento di nuova generazione.

Produzione efficiente e identificazione di CRISPR/Cas9-generato Gene Ko nel sistema modello Danio rerio

Utilizzando un Cas9 preassemblati complesso ribonucleoproteico (RNP) è un metodo potente per l'editing genomico precisa, efficiente. Qui, si evidenzia sua utilità in una vasta gamma delle cellule e degli organismi, tra cui cellule umane primarie e classico ed emergenti organismi modello.

Enhanced Genome Editing con Cas9 ribonucleoproteina nelle Diverse cellule e degli organismi

CRISPR-Cas è una potente tecnologia per progettare i complessi genomi delle piante e degli animali. Qui, dettagliamo un protocollo efficiente modificare il genoma umano usando diverse endonucleasi di Cas. Evidenziamo considerazioni importanti e parametri di progettazione per ottimizzare l'efficienza di editing.

Modifica di genoma in linee cellulari di mammifero usando CRISPR-Cas

Qui, descriviamo uno strumento di modifica del genoma basato sulla stabilizzazione temporale e condizionale della proteina 9 (Cas9) associata a ripetizione palindromica corta (CRISPR)(Cas9) raggruppata regolarmente intervallata sotto la piccola molecola, Shield-1. Il metodo può essere utilizzato per cellule in coltura e modelli animali.

Un nuovo toolkit per la valutazione delle funzioni geniche utilizzando la stabilizzazione condizionale Cas9

Questo articolo riporta la costruzione di cellule knockout della proteina E associata al centromero (CENP-E) utilizzando il sistema CRISPR/Cas9 e tre strategie di screening basate sul fenotipo. Abbiamo utilizzato la linea cellulare knockout CENP-E per stabilire un nuovo approccio per convalidare la specificità e la tossicità degli inibitori CENP-E, utile per lo sviluppo di farmaci e la ricerca biologica.

Generazione di linee cellulari knockout CENP-E-/- associate al centromero della proteina E utilizzando il sistema CRISPR/Cas9

Un ostacolo significativo a tecnologie come CRISPR sono gli eventi fuori bersaglio che possono interrompere i geni vitali. CIRCLE-seq ("Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing") è una tecnica progettata per identificare i siti di scissione non intenzionali. Questo metodo mappa l'attività dell'intero genoma di CRISPR-Cas9 con alta sensibilità e senza bias.

CIRCLE-Seq per l'interrogazione dell'editing genetico off-target

Flusso di fluido interstiziale è elevata in tumori solidi e in grado di modulare l'invasione delle cellule tumorali. Qui si descrive una tecnica per applicare il flusso di fluido interstiziale alle cellule incorporati in una matrice e quindi misurare i suoi effetti sulla invasione cellulare. Questa tecnica può essere facilmente adattato per studiare altri sistemi.

Tridimensionale Cultura modello cellulare per misurare gli effetti del flusso del fluido interstiziale sulla Invasion cellule tumorali

I cellulosomi sono complessi multienzimatici progettati per digerire la cellulosa. La SMFS basata su AFM è stata utilizzata per studiare le proprietà meccaniche e la configurazione di ripiegamento degli assemblaggi proteici associati al cellulosoma. Presentiamo un flusso di lavoro completo per l'immobilizzazione delle proteine, l'acquisizione e l'analisi dei dati per studiare le interazioni dei singoli complessi recettore-ligando coinvolti nell'assemblaggio del cellulosoma.

Indagare Sistemi recettore-ligando del Cellulosome con sede a AFM singola molecola di Forza Spettroscopia

In questo metodo, usiamo fotopolimerizzazione e tecniche di chimica clicca per creare modelli di proteina o peptide sulla superficie di idrogeli di polietilenglicole (PEG), fornendo immobilizzata bioattivi segnali per lo studio delle risposte cellulari in vitro .

Patterning bioattivi proteine o peptidi su idrogel utilizzando fotochimica per applicazioni biologiche

Scopri come progettare circuiti genici digitali in lievito utilizzando i sistemi CRISPR dCas di tipo due e cinque e le proteine anti-CRISPR. Questo metodo avanzato migliora la comprensione della regolazione trascrizionale in Saccharomyces cerevisiae.

Circuiti digitali genici basati su sistemi CRISPR-Cas e proteine anti-CRISPR

Esplora altri video