טכניקה ללא תווית להדמית החלל-הזמן של פרשות תא בודדת

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא למדוד הפרשת חלבונים מתאים בודדים ברזולוציה זמןית ומרחבית גבוהה. דבר זה מושג על ידי ייצור ליתוגרפי של ננו-חיישנים פלסמוניים מזהב על לבישי זכוכית לצורך דימוי נטול סמנים (label free) של הפרשות מתא בודד. כשלב שני, שבב החיישן מנוקה ומצופה בשכבה מולקולרית המרכיבה את עצמה (self-assembled monolayer), ולאחר מכן מעובד פונקציונלית עם ליגנדים בעלי זיקה גבוהה לחלבוני האנליט המופרשים.

בשלב הבא, תאים מוטמעים על שבבי החיישן הפונקציונליים כדי למדוד את הפרשותיהם במרחב ובזמן. התוצאות מראות כי ניתן למפות הפרשות חלבונים מתאים בודדים הן מבחינה מרחבית והן מבחינה זמנית ללא צורך בסימון. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום התקשורת הבין-תאית, כגון האופן שבו מסלולי איתות פראקריניים ואוטוקריניים שולטים בניידות תאים.

כדי להתחיל בהליך זה, שקיעו שכבה דקה של כרום בעובי 10 nanometer על כיסויי זכוכית (cover slips) שנוקו מראש באמצעות אידוי באלומה אלקטרונית (electron beam evaporation), כדי למנוע השפעות מטען במהלך התבנית והדימוי של הננו-מבנים. לאחר מכן, מרחו את השכבה הראשונה של רזיסט דו-שכבתי המורכב מפולימר של ethyl lactate ו-methylmethacrylate במהירות של 2000 RPM למשך 45 שניות. לאחר מכן, אפו את התשתית בטמפרטורה של 150 degrees Celsius לאחר שהתשתית התקררה לטמפרטורת החדר.

סובב את השכבה השנייה של פולימתילמתאקרילט ב-3000 RPM למשך 45 שניות ואפה את התשתית ב-150 degrees Celsius. צור דפוס בשכבת הרזისტ הכפולה באמצעות ליתוגרפיית אלומת אלקטרונים או EBL.פתח את הדפוס באמצעות תמיסה של isopropyl alcohol או IPA ו-methyl isobutyl ketone, או MIBK ביחס של שניים לאחד, ושטוף ב-IPA.

הסר את הכרום מהאזור המפותח של הננו-מבנים באמצעות תהליך תכתוש רטוב (wet etch) באמצעות CR seven למשך 10 שניות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שטוף במים מזוקקים ודה-יוניים. השקע שכבת טיטניום-זהב על תשתית באמצעות מאדה של קרן אלקטרונים (electron beam evaporator) בעקבות השקעת הזהב. בצע הסרה (Lift off) של שכבת הפולימר המשותפת ושל הרזיסט על ידי השריה של התשתית באצטון למשך ארבע שעות.

בשלב הבא, יש לבחון את התשתית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק כדי לאשר את צורתם וגודלם של הננו-מבנים. הננו-מבנים המתקבלים מופרדים בדרך כלל במרווח (pitch) של 300 nanometers. מערכים של 20 על 20 ננו-מבנים מרוחקים ב-30 microns ממרכז למרכז.

תוך השארת מקום מספיק עבור דימות תאים, שבב טיפוסי יכיל 300 מערכים. הסר את שאריות הכרום מהמצע באמצעות תהליך wet edge באמצעות תמיסת CR seven etching למשך 60 שניות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטוף את המצע במים מזוקקים דה-יוניים.

לאחר מכן, בדקו תת-קבוצה של מערכים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (atomic force microscope) לאימות הגודל והאחידות. ניתן להשתמש בכיסוי זכוכית תבניתי זה מספר פעמים, כל עוד נשמרים נהלי הניקוי המתאימים לניקוי ולהח Dealers של שבבי פלזמה מקומית ותהודה של פני השטח (LSPR). בצעו שריפת פלזמה (Plasma ash) בהספק של 40 watts בתערובת של 300 milli הכוללת 5% hydrogen ו-95% argon למשך 45 seconds.

בצעו פונקציונליזציה למשטח הזהב ולננו-מבנים מיד לאחר שריפת פלזמה (plasma ashing). טבלו את השבב בתמיסת אתנול-תיול דו-רכיבית המורכבת מיחס של שלושה לאחד של SPO ו-SPC. לאחר השארת השבב בתמיסת התיול למשך לילה להיווצרות שכבה מונחית עצמית (self-assembled monolayer), שטפו אותו באתנול וייבשו בגז חנקן. טענו את שבב ה-LSPR לתוך מחזיק מיקרופלואידי בהתאמה אישית על ידי הנחת השבב על בסיס אלומיניום.

לאחר מכן, הניחו את השבב בין החלק התחתון הזה לבין אטם סיליקון וחלק עליון מפלסטיק שקוף, והשתמשו בארבעה ברגים כדי להדק את המכלול. עבור יישום טיפוסי של thiol מבוסס SPC, הניחו בטפטוף (drop coat) 300 µL של תערובת ביחס של 1:1 של 133 mM EDC ו-33 mM NHS במים מזוקקים ודה-יוניים כדי להפעיל את קבוצות הקרבוקסיל של רכיב ה-SPC thiol. לאחר המתנה של 10 דקות, שטפו ידנית את הפני השטח עם 10 mM PBS, ולאחר מכן צמדו את קבוצת הקרבוקסיל הפעילה לליגנד הרצוי על ידי הנחה בטפטוף של 300 µL מתמיסת הליגנד.

לאחר המתנה של שעה ושטיפת הפני השטח ב-10 millimolar PBS, טפטפו 300 microliters של 0.1 molar ethanolamine ב-PBS על השבב כדי למזער קישור לא ספציפי. לאחר המתנה של 10 דקות, שטפו את ה-ethanolamine באמצעות PBS המכיל 0.005% בין 20 ל-PBST 20. לאחר מכן, הניחו פיסת קוורץ מעל השבב כדי להפחית תנודות בנתונים הנובעות משינויים במניסקוס.

שמרו על השבב רטוב עם תמיסת PBST 20 בזמן ההרכבה על המיקרוסקופ. חברו את צינורות המיקרופלואידיקה למכלול והזרימו תמיסת באפר עד להגעה למצב יציב. לאחר מכן, מקמו את מכלול שבב ה-LSPR בחוזקה בתוך מחזיק הדגימות של הבמה המחוממת.

המערך האופטי עבור שיטה זו מוצג כאן. האור מהמנורה ההלוגנית עובר דרך מסנן מעביר אורך גל (long pass filter) של 593 nanometer כדי להסיר אורכי גל שאינם תורמים לתגובה הננו-פלסמונית. לאחר מכן האור מקוטב ליניארית והדגימה מוארת באמצעות עדשה עם מפתח מספרי (numerical aperture) של 40 x 1.4 לצורך עירור של ננו-מבני הזהב הפלסמוניים.

האור המפוזר נאסף על ידי העדשה והועבר דרך מקטב מצולב כדי להפחית את אות הרקע מהמצע הזכוכית. מפיתח קרן 50 50 מוכנס לנתיב האור הנאסף לצורך ניתוח ספקטרוסקופי וניתוח תמונתי בו-זמנית. לאחר מתן זמן למכלול ולמיקרוסקופ להגיע לשיווי משקל במשך שעתיים לפחות, יישרו את השבב באמצעות הג'ויסטיק כך שהמערך המרכזי יהיה מיושר עם הסיב האופטי לספקטרוסקופיה.

לאחר גידול וריכוז של תאי DOMA היברידיים באמצעות סבב צנטריפוגה, קצרו אותם ובדקו את חיוניותם לפני העברתם לשבבי ה-LSPR. לאחר מכן, העבירו ידנית 50 µL מתמיסת התאים אל שבבי ה-LSPR באמצעות מיקרו-פיפט. לבסוף, שטפו את התאים שנותרו בתמיסה באמצעות מצע טרי נטול סרום בעזרת מערכת פרפוזיה מיקרופלואידית, כדי להכין את שבבי ה-LSPR לדימוי.

מוצגת כאן תמונה המורכבת משכבה של תמונת דימות LSPR, המדגישה את המערכים הריבועיים, ותמונת תאורה באור תמסורת, המדגישה את התא בפינה השמאלית התחתוית. תא שנצבע בצבע הפלואורסצנטי לממברנה rod Domine, DHPE מראה שלוחות דמויות פילופודיה. לו שלוחות אלו היו חופפות למערכים, הן היו גורמות לתוצאה חיובית שגויה בנתוני ספקטרומטריית הפרשת חלבונים. מוצגים כאן הנתונים לפני ואחרי הוספת תמיסה רוויה של נוגדנים אנטי-cmic למערכים הפונקציונליים מסוג cmic.

שיטה זו משמשת לצורך כיול המערכים. כיול המערכים מסייע בנרמול התגובה של החיישנים ובקביעת התפוסה השברית (fractional occupancy) על בסיס פרופיל הביו-פונקציונליזציה של כל הרצה. מכשיר SPR מסחרי משמש לקביעת קבוע הדיסוציאציה וכן לבחינת העמידות לקשירה לא ספציפית, תוך שימוש באותו פרוטוקול שהגדר עבור שבב ה-LSPR.

ערכים מנורמלים משני מערכים מוצגים כאן. מערך אחד היה במרחק של 10 micrometers מהתא, בעוד שהביקורת הייתה במרחק של 130 micrometers מהתא. העלייה הפתאומית בתגובה המנורמלת של המערך הקרוב ביותר לתא, ביחס לתגובה השטוחה של מערך הביקורת, מעידה על פריצה מקומית של נוגדנים מופרשים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן למדוד הפרשות חלבון מתאים בודדים ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה.