Bacterial Artificial Chromosomes: uno strumento Genomica Funzionale per lo studio di positivo-strand virus RNA

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere particelle virali infettive prodotte interamente da un cDNA clonato di virus a RNA a filamento positivo, i cui genomi presentano la stessa polarità dell'mRNA cellulare, come il virus dell'encefalite giapponese. La genetica inversa basata su cDNA è un metodo fondamentale che consente la manipolazione diretta dell'RNA genomico virale, generando così virus ricombinanti per lo studio molecolare e genetico della replicazione virale e della patogenesi. Questa tecnica fornisce inoltre una piattaforma preziosa che permette lo sviluppo di vettori virali vaccinici geneticamente definiti per il trasferimento di geni estranei.

Questi metodi sono applicabili al clonaggio di cDNA di lunghezza completa per virus a RNA a polarità negativa o positiva, in particolare quelli con genomi più grandi di 10 kb. A dimostrazione della procedura ci saranno diversi membri del mio laboratorio: l'assistente di ricerca Sang-Im Yun, i ricercatori postdottorandi Byung-Hak Song e Jin-Kyoung Kim e lo studente universitario Jordan Frank.

La parte video di questa pubblicazione illustra la preparazione del cromosoma artificiale batterico contenente le sequenze di interesse, la sintesi dell'RNA trascritto dal plasmide, nonché come misurare l'infettività dell'RNA e il rendimento virale. Tutte le procedure eseguite prima della generazione del plasmide BAC sono descritte nel protocollo testuale con grande dettaglio. Per questa procedura, coltivare innanzitutto una singola colonia di E. coli DH10B, portatrice del plasmide BAC, in tre millilitri di brodo 2X YT contenente cloramfenicolo. Incubare la coltura per 10 ore a 35 gradi Celsius con agitazione a 225-250 giri al minuto.

Dopo 10 ore, aumentare la scala della coltura. Quindi inoculare 500 microlitri di coltura in 500 millilitri di mezzo e coltivare l'inoculo per sei ore con agitazione vigorosa. Dopo sei ore, centrifugare la coltura batterica in 2 bottiglie da 250 millilitri a 3.100 ×g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, risospendere ogni pellet in 30 millilitri di soluzione GTE.

Aggiungere 500 microlitri di lisozima e incubare le sospensioni sul ghiaccio per 10 minuti. Nel frattempo, preparare una soluzione di lisi fresca per il passaggio successivo. Dopo 10 minuti, aggiungere 60 millilitri della soluzione di lisi e mescolare ruotando delicatamente fino a quando la soluzione appare limpida.

Lasciare avvenire le reazioni a temperatura ambiente per 10 minuti. Successivamente, aggiungere 45 millilitri di soluzione di neutralizzazione in ciascun flacone e capovolgere i flaconi fino a quando non siano completamente miscelati. Poi metterli sul ghiaccio per 10 minuti.

Raccogliere i lisati neutralizzati mediante centrifugazione refrigerata ad alta forza g. Quindi trasferire i soprannatanti in due nuovi flaconi da 250 millilitri. Aggiungere 0,6 volumi di isopropanolo al 100% a ciascun flacone e porli sul ghiaccio per 20 minuti.

Successivamente, centrifugare i precipitati, scartare i soprannatanti e sciogliere i pellet in cinque millilitri di tampone TE. Unire i due volumi in un unico tubo da 50 millilitri e precipitare l'RNA aggiungendo un volume uguale di cloruro di litio 5 M e incubando la miscela su ghiaccio per 10 minuti. Utilizzare una centrifugazione fredda di 20 minuti per raccogliere il precipitato di RNA.

Quindi trasferire il soprannatante in un nuovo tubo da 250 millilitri, aggiungere due volumi di isopropanolo al 100% e porre il tubo sul ghiaccio in modo che si formi il precipitato di DNA. Dopo 20 minuti, centrifugare per far sedimentare il precipitato, aspirare il soprannatante, risospendere il pellet di DNA in 9,5 millilitri di tampone TE e trasferire la soluzione di DNA in un tubo da 50 millilitri.

Proseguire la preparazione impostando il gradiente di cloruro di cesio con bromuro di etidio. Caricare la miscela in un tubo in polipropilene sigillabile utilizzando una siringa con un ago da 18 gauge e sigillare il tubo. Centrifugare il tubo sigillato tutta la notte in un ultracentrifugo per formare un gradiente di cloruro di cesio.

Il giorno successivo, raccogliere una banda di DNA del plasmide BAC dal gradiente al cloruro di cesio. Utilizzare un ago da 18 gauge per creare un'apertura di ventilazione nella parte superiore del gradiente e un ago da 20 gauge con siringa per raccogliere il DNA BAC dal lato del gradiente, quindi trasferire il campione in una provetta microcentrifuga da 1,7 millilitri. Eseguire un lavaggio, aggiungendo 2,5 volumi di butanolo saturo di acqua e mescolare con vortexing normale.

Quindi centrifugare la miscela a temperatura ambiente e trasferire la fase acquosa inferiore in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,7 millilitri. Ripetere questo lavaggio un totale di sei volte per rimuovere tutto il bromuro di etidio. A questo punto, precipitare il DNA BAC. Aggiungere al tubo un decimo di volume di acetato di sodio 3 molar e 2,5 volumi di etanolo al 100%. Incubare la miscela sul ghiaccio per 10 minuti. Quindi centrifugare il precipitato a temperatura ambiente e lavare il pellet di DNA con un millilitro di etanolo al 70%. Ripetere la centrifugazione e raccogliere nuovamente il pellet. Infine, asciugare il DNA pelletizzato all'aria per 10 minuti ed eluirlo in 200 microlitri di tampone TE.

Iniziare con una digestione su larga scala del plasmide BAC mediante l'enzima di restrizione Xba-I in un volume totale di 100 microlitri. Eseguire questa digestione a 37 gradi Celsius per 12-15 ore. Successivamente, proseguire l'incubazione della digestione con ulteriori 25 unità di nuclease di mung-bean a 30 gradi Celsius per due ore.

Dopo l'incubazione, portare il volume a 300 microlitri con acqua distillata. Eseguire ora un'estrazione fenolica aggiungendo un volume uguale di fenolo-cloroformio, alcol isoamilo al campione diluito, vortexando vigorosamente per un minuto, centrifugando il tubo e trasferendo la fase acquosa superiore in un nuovo tubo.

Quindi ripetere l'estrazione con cloroformio. Successivamente, recuperare il DNA BAC linearizzato mediante precipitazione alcolica. Raccogliere il pellet di DNA mediante centrifugazione, scartare il soprannatante e lavare il pellet con un millilitro di etanolo al 70%. Ripetere la centrifugazione e lasciare asciugare il pellet all'aria. Dopo 10 minuti di essiccazione, sciogliere il pellet di DNA in 30 microlitri di acqua distillata. Quindi analizzare un microlitro del BAC recuperato su un gel di agarosio allo 0,8%.

Successivamente, impostare una trascrizione di runoff di 25 microlitri del DNA BAC linearizzato, inclusa UTP triziata per la quantificazione dell'RNA. Eseguire la reazione a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi analizzare uno o due microlitri della reazione di trascrizione di runoff su un gel di agarosio allo 0,6%.

Iniziare con cellule BHK-21 coltivate per 24 ore in piatti da 150 millimetri seminati a 3 milioni di cellule per piatto. Lavare il monostrato cellulare con soluzione A fredda e quindi staccare le cellule mediante trypsinizzazione. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 270 g per due minuti.

Quindi risospendere le cellule in 50 millilitri di soluzione A fredda e centrifugarle nuovamente. Ripetere questo lavaggio per tre volte. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le cellule a 20 milioni per millilitro in soluzione A. Quindi mescolare un'aliquote di 400 microlitri della sospensione cellulare con due microgrammi di RNA sintetico in una cuvetta da due millimetri.

Elettroporare immediatamente la miscela in condizioni ottimali e lasciare riposare le cellule per 10 minuti. Trasferire quindi le cellule in una provetta microcentrifuga contenente 600 microlitri di mezzo di coltura completo. Preparare ora delle diluizioni seriali decrescenti delle cellule elettroporate in volumi di un millilitro. Piastrare aliquote di 100 microlitri di ciascuna diluizione su monocapati di cellule BHK21 normali. Dopo un'incubazione di quattro-sei ore, ricoprire le cellule con agarosio allo 0,5% in MEM aggiunto di FBS e coltivare per altri quattro giorni.

Le cellule BHK21 sono state sottoposte a elettroporazione fittizia o elettroporate con trascritti di RNA derivati da due cloni indipendenti del JEV-BAC a lunghezza intera. Quattro giorni dopo, le cellule sono state colorate con violetto di cristallo per visualizzare l'RNA infettivo all'interno delle cellule. Mediante questa colorazione, sono stati quantificati i centri infettivi. Successivamente, l'espressione delle proteine virali è stata analizzata in cellule elettroporate con RNA a 20 ore post trasfezione, utilizzando un antisiero da coniglio anti-NS1 e un anticorpo secondario coniugato con Cy3, visibile in rosso. I nuclei sono stati contrastati con DAPI, visibile in blu. Successivamente, a 22 e 40 ore post trasfezione, la produzione di virioni infettivi accumulati nei supernatanti di coltura delle cellule elettroporate con RNA è stata valutata mediante saggi di placca.

Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare un virus infettivo interamente da un cDNA clonato di una ceppo positivo, RNA, come il virus dell'encefalite giapponese. Pertanto, non dimenticare che lavorare con il virus dell'encefalite giapponese e altri patogeni umani può essere estremamente pericoloso. È necessaria un'adeguata formazione in materia di sicurezza biologica prima di eseguire questa procedura.