Bacterial Artificial Chromosomes: uno strumento Genomica Funzionale per lo studio di positivo-strand virus RNA

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di salvare particelle virali infettive costituite interamente da un CDNA clonato di filamento positivo, virus a RNA i cui genomi sono nella stessa polarità dei Mr.NA cellulari, come il virus dell'encefalite giapponese. Questa genetica regene basata su CNA è un metodo semiale che consente la manipolazione diretta dell'RNA genomico virale, generando così virus ricombinanti per lo studio molecolare e genetico della replicazione e della patogenesi virale. Questa tecnica fornisce anche una preziosa piattaforma che consente lo sviluppo di vaccini geneticamente definiti e vettori virali per la consegna di geni estranei.

Questi recipienti sono applicabili alla clonazione di CDNA a lunghezza intera per ceppo di lunghezza o positivo, virus a RNA, in particolare quelli con genomi superiori a 10 kb. A dimostrare la procedura saranno diversi membri del mio assistente di ricerca di laboratorio, il professor San Nun, il collega post-dottorato UNG e Xing y Kim e gli studenti universitari, Jordan Frank. La parte video di questa pubblicazione copre la preparazione del cromosoma artificiale batterico contenente le sequenze di interesse, la sintesi dell'RNA, trascritto dal plasmide posteriore, e come misurare l'infettività degli RNA e la resa del virus.

Tutte le procedure utilizzate prima di generare il plasmide posteriore sono fornite nel protocollo di testo in modo molto dettagliato. Per questa procedura, coltivare prima una singola colonia di e coli DH 10 B, trasportando il plasmide posteriore in tre millilitri di brodo XYT con cloramfenicolo. Incubare la coltura per 10 ore a 35 gradi Celsius con agitazione a 225-250 giri/min.

Dopo 10 ore, ingrandire la coltura, quindi inoculare 500 microlitri di crescita in 500 millilitri di terreno e coltivare l'inoculo per sei ore agitando vigorosamente dopo sei ore. Centrifugare la coltura batterica in 2 flaconi da 250 millilitri a 3,100 g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi risospendere ogni pellet in 30 millilitri di soluzione GTE.

Aggiungere 500 microlitri di lisozima e incubare le sospensioni su ghiaccio per 10 minuti. Nel frattempo, preparare una soluzione di lisi fresca per il passaggio successivo. Dopo 10 minuti, aggiungere 60 millilitri della soluzione di lisi e mescolare agitando fino a quando la soluzione appare limpida.

Lasciare andare le reazioni a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi, aggiungi 45 millilitri di soluzione neutralizzante a ciascuna bottiglia e capovolgi le bottiglie fino a quando non sono completamente miscelate. Quindi metterli in ghiaccio per 10 minuti.

Raccogliere i lisati neutralizzati con la centrifugazione refrigerata ad alto G. Quindi raccogli i surnatanti in due nuove bottiglie da 250 millilitri. Aggiungere 0,6 volumi di isopropanolo al 100% a ciascuno e metterli in ghiaccio per 20 minuti.

Quindi, centrifugare i precipitati, quindi scartare i surnatanti e sciogliere i pellet in cinque millilitri di tampone TE. Combinare i due volumi in un'unica provetta da 50 millilitri e precipitare l'RNA aggiungendo un volume uguale di cinque molari di cloruro di litio e incubando la miscela su ghiaccio per 10 minuti. Utilizzare una centrifugazione a freddo di 20 minuti per raccogliere il precipitato di RNA.

Quindi trasferire il surnatante in una nuova provetta da 250 millilitri. Aggiungere due volumi di isopropanolo al 100% e mettere la provetta sul ghiaccio in modo che si formi il precipitato di DNA. Dopo 20 minuti, centrifugare il precipitato, aspirare il surnatante, risospendere il pellet di DNA in 9,5 millilitri di tampone TE e trasferire la soluzione di DNA in una provetta da 50 millilitri.

Continuare la preparazione impostando il gradiente di cloruro di cesio con un bromuro di tidio. Caricare la miscela in una provetta di polipropilene sigillabile utilizzando una siringa con ago calibro 18 e sigillare la provetta. Centrifugare la provetta sigillata per una notte in un'ultracentrifuga per formare un gradiente di cloruro di cesio.

Il giorno successivo raccogli una banda di DNA del plasmide posteriore dal gradiente di cloruro di cesio. Utilizzare un ago calibro 18 per creare una presa d'aria nella parte superiore del gradiente e un ago calibro 20 con siringa per raccogliere il DNA posteriore dal lato del gradiente, quindi trasferire la raccolta in un tubo micro fuge da 1,7 millilitri. Eseguire un lavaggio, aggiungere 2,5 volumi di butanolo saturo d'acqua e mescolare con il normale vortexing.

Quindi centrifugare la miscela a temperatura ambiente e trasferire la fase acquosa inferiore in una nuova provetta micro fuge da 1,7 millilitri. Ripetere questo lavaggio per un totale di sei volte per rimuovere tutto il bromuro di etidio. Ora precipita il DNA posteriore.

Aggiungere un decimo volume di acetato di sodio a tre molari e 2,5 volumi di etanolo al 100% al tubo. Incubare la miscela con ghiaccio per 10 minuti. Quindi centrifugare il precipitato a temperatura ambiente e lavare il pellet di DNA con un millilitro di etanolo al 70%.

Ripetere la centrifuga e raccogliere nuovamente il pellet. Infine, asciugare all'aria il DNA pellettato per 10 minuti e utilizzarlo in 200 microlitri di tampone TE. Inizia con una digestione enzimatica di restrizione su larga scala del plasmide posteriore con xbo.

Uno in un volume totale di 100 microlitri. Eseguire questa digestione a 37 gradi Celsius per 12-15 ore. Successivamente, incubare ulteriormente la digestione con altre 25 unità di nucleasi di fagiolo mung a 30 gradi Celsius per due ore.

Dopo l'incubazione, portare il volume a 300 microlitri con acqua distillata. Ora eseguire un'estrazione fenolica aggiungendo un volume uguale di fenolo cloroformio, alcol isoamilico al campione diluito. Vorticare vigorosamente per un minuto, girando lungo il tubo e trasferendo la fase acquosa superiore in un nuovo tubo.

Quindi ripetere l'estrazione con cloroformio. Successivamente, recupera il DNA posteriore linearizzato mediante precipitazione con etanolo. Raccogliere il pellet di DNA con centrifugazione, scartare il surnatante e lavare il pellet con un millilitro di etanolo al 70%.

Ripetere la fase di centrifugazione e asciugare il pellet all'aria. Dopo 10 minuti di essiccazione, sciogliere il pellet di DNA in 30 microlitri di acqua distillata. Esaminare quindi un microlitro del dorso recuperato su un gel AROS allo 0,8%.

Successivamente, impostare una trascrizione di deflusso di 25 microlitri del DNA posteriore linearizzato, inclusa l'UTP triziata per la quantificazione dell'RNA. Eseguire la reazione a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi esaminare uno o due microlitri della reazione di trascrizione del deflusso su un gel AROS allo 0,6%.

Iniziate con 21 cellule BHK coltivate per 24 ore in piastre da 150 millimetri piastrate a 3 milioni di cellule per piatto. Sciacquare le celle monostrato con la soluzione fredda A e poi staccarle con la tripsina. A livello di rete. Raccogliere le celle mediante centrifugazione a 270 GS per due minuti.

Quindi risospendere le cellule in 50 millilitri di soluzione fredda A e farle girare di nuovo. Ripetere questo lavaggio tre volte dopo l'ultimo lavaggio. Risospendere le cellule a 20 milioni per millilitro in soluzione A.Quindi mescolare un'aliquota di 400 microlitri della sospensione cellulare con due microgrammi di RNA sintetico in un vete di due millimetri.

Elettropurificare prontamente la miscela in condizioni ottimali e lasciare riposare le celle per 10 minuti. Quindi trasferire le cellule in una provetta per microfughe contenente 600 microlitri di terreno di coltura completo. Ora preparare una diluizione seriale di dieci volte delle cellule elettroporate in volumi di un millilitro, piastre 100 microlitri di aliquote di ciascuna diluizione su monostrati di normali cellule bhk 21 dopo quattro-sei ore di incubazione, sovrapporre le cellule con 0,5% di aros in MEM più FBS e coltivarle per altri quattro giorni.

cellule Bhk 21 sono state simulate elettroporate o elettroporate con trascrizioni di RNA derivate da due cloni indipendenti dell'intero JEV Back Quattro giorni dopo, le cellule sono state colorate con cristallovioletto per visualizzare l'RNA infettivo nelle cellule. Utilizzando questa colorazione, sono stati quantificati i centri infettivi. Successivamente, l'espressione della proteina virale è stata esaminata in cellule elettroporate a RNA 20 ore dopo la trasfezione utilizzando anti NS, un siero antis di coniglio e un anticorpo secondario coniugato SI tre visto in rosso.

I nuclei erano controtinta con DAPI visto in blu. Successivamente, a 22 e 40 ore dopo la trasfezione, la produzione di variani infettivi si è accumulata nella coltura. I surnatanti delle celle elettroporate a RNA sono stati esaminati mediante saggi di placca.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come salvare il virus infettivo interamente da un CNA clonato di ceppo positivo, RNA, come il virus dell'encefalite giapponese. Quindi non dimenticare che lavorare con un virus dell'encefalite giapponese e altri agenti patogeni umani può essere estremamente pericoloso. Prima di eseguire questa procedura è necessaria un'adeguata formazione sulla biosicurezza.