Formazione immagine confocal di RNA Double-Stranded e Pattern Recognition Receptors in infezione Virus RNA negativo
26 gennaio 2019
RNA double-stranded prodotto durante la replicazione del virus RNA possa essere riconosciuto dai recettori di riconoscimento di pattern per indurre una risposta immunitaria innata. Per i virus del RNA negativo-senso, l'interazione tra il basso livello dsRNA e PRRs rimane poco chiaro. Abbiamo sviluppato un metodo di microscopia confocale per visualizzare arenavirus dsRNA e PRR in singole celle.
Il tradizionale saggio di rilevamento dell'RNA a doppio filamento di solito non è abbastanza sensibile da rilevare l'RNA a doppio filamento formato nell'infezione da virus dell'RNA a senso negativo. Pertanto l'interazione tra RNA a doppio filamento e recettori del riconoscimento del modello ospite è rimasta in gran parte sfuggente per questi virus. Utilizzando questo protocollo siamo in grado di visualizzare e caratterizzare l'interazione tra proteina nucleare virale, RNA a doppio filamento e ospitare un PRR a livello a singola cellula per il virus dell'RNA a senso negativo. Questo è un saggio multiplex che consente la colorazione simultanea dell'RNA a doppio filamento e di due bersagli proteici virali o ospiti nelle singole cellule. A differenza del saggio RNA-FISH questa tecnica è indipendente dalla sequenza di RNA e di solito compatibile con il rilevamento di anticorpi di bersagli proteici. Inizia 24 ore prima dell'infezione seminando 200.000 cellule epiteliali polmonari umane A549 su coperchi di vetro rivestito in poli-D-lisina scivola in piastre da 12 po 'e coltivandole a 37
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Panoramica
Questo studio analizza il riconoscimento dell'RNA a doppio filamento (dsRNA) prodotto durante la replicazione dei virus a RNA da parte dei recettori di riconoscimento di pattern (PRRs), che induce una risposta immunitaria innata. L'attenzione è rivolta ai virus a RNA a senso negativo, nei quali l'interazione tra dsRNA a basso livello e PRRs non è ancora ben compresa. È stato sviluppato un metodo di microscopia confocale per visualizzare il dsRNA degli arenavirus e i PRRs all'interno di singole cellule.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Immunologia
- Virologia
Sfondo
- L'RNA a doppio filamento è un sottoprodotto della replicazione dei virus a RNA.
- I recettori di riconoscimento del pattern svolgono un ruolo cruciale nella risposta immunitaria innata.
- L'interazione tra RNA a doppio filamento e recettori di riconoscimento del pattern nei virus a RNA senso negativo non è ancora ben compresa.
- La visualizzazione dell'RNA a doppio filamento e dei recettori di riconoscimento del pattern può migliorare la comprensione dell'evasione immunitaria virale.
Scopo dello studio
- Chiarire l'interazione tra dsRNA e PRR nei virus a RNA senso negativo.
- Sviluppare un metodo per visualizzare queste interazioni a livello cellulare singolo.
- Contribuire alla comprensione della risposta immunitaria innata ai virus a RNA.
Metodi Utilizzati
- Microscopia confocale per la visualizzazione di dsRNA e PRR.
- Saggi cellulari per valutare la risposta immunitaria.
- Analisi dei livelli di dsRNA durante la replicazione virale.
- Studi comparativi con diversi virus a RNA.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita di dsRNA di arenavirus e di PRR in singole cellule.
- Identificazione di interazioni specifiche tra dsRNA e PRR.
- Approfondimenti sui meccanismi di risposta immunitaria innescati dal dsRNA.
- Chiarimento del ruolo del dsRNA nella patogenesi virale.
Conclusioni
- Il metodo sviluppato di microscopia confocale è efficace per lo studio delle interazioni tra dsRNA e PRR.
- Comprendere queste interazioni potrebbe portare a nuove strategie terapeutiche contro i virus a RNA.
- Questa ricerca contribuisce al campo più ampio dell'immunologia virale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La visualizzazione di RNA a doppio filamento (dsRNA) a bassa abbondanza durante l'infezione da virus a RNA a senso negativo colma una lacuna fondamentale nella comprensione dell'attivazione dell'immunità innata e dell'evasione immunitaria virale. Questa capacità supporta la validazione degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistico nella scoperta di antivirali, consentendo l'osservazione diretta dell'interazione tra recettori di riconoscimento di pattern (PRR) e intermedi della replicazione virale. Il metodo aumenta la fiducia predittiva nella selezione precoce degli obiettivi per arenavirus e patogeni correlati, orientando la priorità del portafoglio nei programmi su patogeni ad alto contenimento.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche attraverso la visualizzazione delle interazioni dsRNA-PRR a risoluzione monocellulare in modelli virali patogeni.
- Valore operativo: Offre un metodo di rilevamento sensibile e indipendente dalla sequenza, compatibile con la colorazione multiplex di proteine per la chiarificazione delle vie coinvolte.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione del rischio biologico dei bersagli PRR confermando l'interazione del ligando in contesti infettivi rilevanti.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prontezza del saggio: Genera letture quantitative e risolte spazialmente della colocalizzazione di dsRNA e PRR per la standardizzazione del saggio.
- Rilevanza per lo screening: Prepara sistemi biologici validati per lo screening di composti successivi, stabilendo metriche di attivazione immunitaria di base.
- Utilità della piattaforma: Compatibile con la rilevazione basata su anticorpi, consentendo il riutilizzo su diversi bersagli virali e proteine dell'ospite nei flussi di lavoro di imaging.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega le osservazioni della scoperta alla validazione preclinica, mappando la distribuzione di dsRNA e il reclutamento di PRR in sistemi pertinenti alla malattia.
- Approfondimento Meccanicistico: Chiarisce la dinamica spaziale e temporale della segnalazione immunitaria innata, guidando la selezione di biomarcatori per la modulazione del percorso.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Permette decisioni oggettive di avanzamento o interruzione basate sulla conferma visiva dell'interazione con il bersaglio in modelli ad alta patogenicità.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla verifica dell'ipotesi sul bersaglio all'identificazione di composti promettenti fino alla validazione preclinica, in particolare per antivirali immunomodulanti diretti contro i percorsi dei recettori di riconoscimento di pattern (PRR).
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui meccanismi di agonisti/antagonisti dei recettori di riconoscimento di pattern (PRR) mediante la visualizzazione dell'RNA a doppio filamento come ligando endogeno nelle cellule infette.
- Screening: Fornisce output di imaging riproducibili e quantitativi che consentono il confronto degli effetti dei composti sulle interazioni tra RNA a doppio filamento e PRR.
- Analisi: Offre letture fluorescenti multiplex (RNA a doppio filamento, proteina virale, PRR) per l'analisi ad alto contenuto degli stati di attivazione immunitaria.
- Ricerca traslazionale: Collega le osservazioni in vitro alla continuità preclinica confermando l'attivazione dei PRR in modelli di epitelio polmonare primari o derivati da cellule staminali.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di imaging standardizzata applicabile a diversi virus a RNA a senso negativo e a bersagli ospite oltre i virus arenaviridi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nella validazione dell'obiettivo riducendo l'ambiguità meccanicistica nelle interazioni tra recettori PRR e ligandi.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la scalabilità del saggio attraverso protocolli confocali standardizzati e rilevamento sensibile dell'RNA a doppio filamento.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione fornendo evidenze visive dirette della modulazione del percorso, riducendo l'abbandono in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione dei candidati immunomodulatori in base al rischio, sulla base del confermato legame al bersaglio in contesti di virus patogeni.
Considerazioni per l'Implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia confocale, colorazione mediante immunofluorescenza e tecniche virologiche appropriate al livello di biosicurezza.
- Dipende dall'accesso ad anticorpi anti-dsRNA ad alta sensibilità (ad esempio, clone 9D5) e a infrastrutture per l'imaging a fluorescenza compatibili.
- Necessita di standardizzazione tra laboratori per una quantificazione affidabile del segnale dsRNA e un'analisi consistente della colocalizzazione.
- È necessario tenere conto della variabilità del modello cellulare (ad esempio, A549 rispetto all'epitelio delle vie aeree primario) nella produzione di dsRNA e nei livelli di espressione dei recettori di riconoscimento di patogeni (PRR).
- I limiti pratici includono la possibile cross-reattività degli anticorpi e la necessità di ottimizzazione in condizioni di contenimento elevato (BSL-3/BSL-4).
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Title
1:05
Preparation of A549 Cells and JUNV (Junn virus) Infection
2:09
Fixation and Immunostaining
5:10
Results: Distribution and Colocalization Between the Retinoic Acid Like Receptors RLRs (RIG-I and MDA-5) and dsRNA in JUNV-infected Cells
5:52
Conclusion
