Quantificazione tridimensionale di spine dendritiche da piramidale neuroni derivate da cellule staminali umane pluripotenti indotte

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di acquisire immagini di spine dendritiche da neuroni corticali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane e di quantificarle in tre dimensioni. Questo viene ottenuto trattando innanzitutto coprislip in piastre a sei pozzetti con poliornitina e laminina per la coltura di cellule staminali neurali. Successivamente, le cellule staminali neurali vengono diluite in coltura.

I campioni vengono seminati utilizzando un movimento rotatorio delicato della pipetta e lasciati differenziare fino a 70 giorni in coltura. Rinnovando regolarmente il mezzo, le cellule vengono quindi trasdotte con lentivirus GFP, colorate con anticorpi anti-GFP e visualizzate. Infine, le colture vengono fissate e le spine dendritiche sono immaginate mediante microscopia confocale.

In definitiva, i dati immagine delle spine dendritiche umane vengono ricostruiti in 3D per la loro classificazione e quantificazione. Questo protocollo fornisce una procedura passo dopo passo per ottenere neuroni glutammatergici dello strato due-quattro della corteccia cerebrale umana. Prevede l'uso di cellule staminali neurali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane, ottenute a partire da fibroblasti umani, basandosi su un metodo precedentemente pubblicato.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che consente la segmentazione automatica di DON destro e PY in 3D. Ciò comporta un apprezzabile risparmio di tempo rispetto ai software esistenti, che tipicamente si basano soltanto su analisi in 2D. Le classificazioni donr e spy sono molto pratiche e facili da utilizzare.

Per preparare colture neuronali, posizionare coprioggetti in vetro in piatti da coltura a sei pozzetti e aggiungere poliornitina; incubare tutta la notte sotto cappa a flusso laminare. Il giorno seguente, lavare i coprioggetti tre volte con DPBS e aggiungere laminina; incubare sotto cappa a flusso laminare per almeno 10 ore. Preparare il mezzo di coltura contenente i seguenti componenti.

Quindi utilizzare il mezzo per seminare e differenziare cellule staminali neurali o NSCS a una densità di 50.000 cellule per centimetro quadrato, pipettando con movimenti lenti e rotatori per ridurre l'aggregazione cellulare al fine di trasdurre neuroni derivati da iPSC umane. In qualsiasi fase della maturazione, aggiungere un microlitro di una soluzione madre contenente 40 nanogrammi di vettore lentivirale GFP per ogni pozzetto di coltura contenente mezzo fresco, e incubare a 37 gradi Celsius per 48 ore. Per preparare le cellule all'immunofluorescenza, rimuovere il mezzo di coltura e utilizzare formaldeide al 4% per fissare le cellule trasdotte a temperatura ambiente per 10 minuti.

Quindi utilizzare un XPBS per lavare le cellule tre volte per 10 minuti ciascuna. Successivamente, immergere i coprioggetti in PBS integrato con 0,05% di Triton X-100 e 10% di siero di cavallo e incubare a temperatura ambiente per un'ora. Quindi lavare i coprioggetti con PBS per tre volte.

Aggiungere un millesimo di anticorpo primario GFP in 100 microlitri di PBS con siero di cavallo al 4% su ogni coprivetrino. Incubare in una scatola scura a quattro gradi Celsius durante la notte. Diluire ora l'anticorpo coniugato con Alexa Fluor 488 da uno a 200 in PBS con tween 20 allo 0,5%, e incubare le cellule con la soluzione anticorpale a temperatura ambiente per un'ora, dopo aver lavato i vetrini con PBS per tre volte.

Utilizzare un mezzo di montaggio per montare i vetrini per la microscopia a fluorescenza. Al microscopio confocale, selezionare almeno 10 neuroni sani per condizione con una morfologia parametale e un'arborizzazione dendritica ramificata per quantificare da 60 a 100 micrometri per dendrite. Acquisire le immagini con un obiettivo ad olio 40x na 1,3 e un laser a 488 nanometri con una potenza di picco tipica a livello del campione di circa 20 microwatt, impostando la dimensione del pixel intorno a 80 nanometri per campionare correttamente le spine dendritiche.

Per campionare l'intero volume del neurone, acquisire uno stack Z con un intervallo Z compreso tra 150 e 300 nanometri, ottenendo da 20 a 30 sezioni Z per eseguire la quantificazione tridimensionale delle spine dendritiche. Utilizzare le seguenti impostazioni nel software di analisi per la pre-elaborazione. Applicare un filtraggio gaussiano selezionando il filtro gaussiano di smoothing nell'elaborazione delle immagini.

Impostare la larghezza del filtro uguale alla dimensione del pixel nel piano XY per eseguire un tracciamento semi-automatico dei dendriti a partire dal modulo tracciatore di filamenti. Nella scheda sezione, utilizzare lo strumento distanza per stimare il diametro del dendrite. Successivamente, nella scheda superata, fare clic sullo strumento filamenti e scegliere di saltare la creazione automatica per una maggiore robustezza nella scheda disegno.

Ora selezionare "auto path" come metodo, "dendrite" come tipo e inserire il diametro stimato del dendrite. Utilizzando la modalità di selezione del puntatore, trasformare il cursore in una casella e tenere premuto shift mentre si fa clic con il tasto destro sul punto iniziale del dendrite. Il software eseguirà i calcoli iniziali.

Ora spostare il puntatore lungo la dendrite a partire dal punto iniziale. Viene mostrata una linea gialla che rappresenta il percorso più probabile della dendrite. Premere Maiusc e il tasto sinistro.

Fare clic sull'estremità del dendrite per eseguire la segmentazione automatica delle spine nell'interfaccia del modulo. Fare clic sulla scheda di creazione nell'elenco a discesa ricostruisci. Scegliere ricostruisci diametro del dendrite e selezionare la casella mantieni dati.

Quindi fare clic su ricostruisci. Impostare la soglia in modo che il volume segmentato corrisponda al volume reale del dendrite. Come algoritmo, selezionare la distanza minima dalla mappa delle distanze.

Quindi fare clic sul pulsante successivo nella scheda slice e determinare la spina più piccola, il diametro della testa e la lunghezza massima. Successivamente, nella scheda surpass, inserire valori dei parametri compresi tra 200 e 300 nanometri per il diametro minimo e quattro micrometri per la lunghezza massima, che rappresentano buoni punti di partenza; senza selezionare la casella allow spines, fare clic sul pulsante successivo. Successivamente, regolare la soglia dei punti seme in modo che i punti blu, che rappresentano le spine, siano localizzati effettivamente sulle teste delle spine.

Quindi fare clic su avanti. Ora verrà eseguito il calcolo principale e potrebbe richiedere del tempo per classificare le spine. Nella scheda strumenti dell'interfaccia del modulo, fare clic su classifica spina. Dopo aver verificato che ci siano quattro classi come descritto nel protocollo testuale, l'interfaccia del modulo genererà quattro nuovi oggetti filamento con i risultati della classificazione.

Infine, esportare i dati statistici dalla scheda delle statistiche facendo clic su "esporta tutte le statistiche in un file". Questa figura illustra la coltura di neuroni umani marcata con un anticorpo anti-tubulina beta tre. Anche la tendenza all'aggregazione cellulare è chiaramente visibile in questo caso.

Qui è mostrato un neurone parametale etichettato con GFP, 40 giorni dopo la differenziazione da un progenitore corticale tardivo. Proveniente dai livelli corticali superficiali. L'ingrandimento mostra una riduzione della magnificazione con il corpo cellulare apparente.

Questi pannelli rappresentano la ricostruzione 3D di segmenti di spine dendritiche in diverse fasi di maturazione. Qui viene mostrata l'analisi quantitativa della densità delle spine e del volume della testa delle spine. Come previsto, questi due parametri aumentano nel corso del periodo di coltura.

Durante il tentativo della procedura di coltura, è importante seminare e distribuire con molta attenzione le cellule staminali neurali aggiungendo lentamente le cellule con un movimento delicato e rotatorio al fine di ridurre il danno cellulare. In effetti, questo metodo richiede l'identificazione di singoli neuroni.