Name: Quantificazione tridimensionale di spine dendritiche da piramidale neuroni derivate da cellule staminali umane pluripotenti indotte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Scopri l'analisi quantitativa tridimensionale delle spine dendritiche in neuroni piramidali umani derivati da cellule staminali pluripotenti indotte. Questo metodo consente di studiare la morfologia sinaptica in vitro.

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Questo lavoro è stato finanziato dall'Institut Pasteur, dalla fondazione Bettencourt-Schueller, dal Centre National de la Recherche Scientifique, dall'Università Paris Diderot, dall'Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), la Fondazione di beneficenza Conny-Maeva, la Fondazione Cognacq Jay, la Fondazione Orange e la Fondazione Fondamental. L.G. è supportato da una borsa di studio universitaria del Ministero della Salute. Ringraziamo l'aiuto di BitPlane, in particolare di Georgia Golfis, nella fase iniziale di questo lavoro.

1. Cultura neuronale Nota: riprogrammazione dei fibroblasti in cellule staminali pluripotenti, l&#39;impegno per il lignaggio telencefalo dorsale, derivazione, amplificazione, e delle banche dei progenitori tardivi corticali (LCP) sono state descritte in Boissart et al 4. La differenziazione neuronale di cellule LCP-simile è stato effettuato anche secondo Boissart et al 4 con lievi modifiche. Sono state sviluppate altre procedure per la riprogrammazione diretta dei fibroblasti in cellule staminali pluripotenti indotte seguita dalla loro differenziazione in neuroni. Questo protocollo è stato mantenuto poiché consente la produzione selettiva di neuroni glutamatergici piramidali. <ol><li> Trattare 6 pozzetti piastre di coltura con vetrini con poli-ornitina (diluito a 1/6 in DPBS, concentrazione della 0,01%) O / N, seguita da tre lavaggi in DPBS. Quindi aggiungere laminina (concentrazione magazzino 1 mg / ml, diluito 500 volte in DPBS) per almeno 10 ore sotto cappa a flusso<html> . </li><li> Piatto e inviare NSC a bassa densità (50.000 cellule / cm 2) a 6 pozzetti piastre di coltura con vetrini in 3 ml di terreno di coltura costituito da DMEM / F12 (500 ml), 2 flaconi (5 ml) di N2 supplemento, 2 flaconi (10 ml ciascuna) di supplemento B27, 10 ml di Pen-streptomicina (Penicillina = 10.000 unità / ml e streptomicina = 10.000 unità / ml), 1 ml di 2-mercaptoetanolo (Soluzione madre: 50 mm) e laminina (1 / 500), senza fattori di crescita. PUNTO CRITICO: Eseguire questo passo con attenzione con l&#39;aggiunta di cellule con movimenti lenti rotanti al fine di ridurre il clustering delle cellule. </li><li> Rimuovere il terreno di coltura. Aggiungere mezzo N2B27 fresco contenente 2 mg / ml di soluzione laminina fresco per mantenere il neurone attaccato sui vetrini ed evitare grumi. Cambia il mezzo ogni 3 giorni. Mantenere un po &#39;del fluido rimanente (200 ml) prima di aggiungere mezzo fresco per evitare la cella da essiccazione. In alternativa, procedere rapidamente e modificare il volume totale (3 ml). </li></ol>e_title &quot;&gt; 2. lentivirali trasduzione Nota: vettori lentivirali GFP sono stati gentilmente forniti dal Dr. Uwe Maskos laboratorio presso l&#39;Istituto Pasteur (Parigi) e preparati secondo il protocollo pubblicato 5. GFP è guidata dal promotore del mouse fosfoglicerato chinasi (PGK). Per questo studio, titolo virale è stato pari a 400 ng / ml (soluzione madre in PBS 1x). <ol><li> Trasdurre umane neuroni IPSC-derivati ​​in ogni fase di maturazione da particelle virali con l&#39;aggiunta di 1 ml di soluzione madre contenente 40 ng di GFP vettori lentivirali per la cultura (ben 6 pozzetti) e incubare per 48 ore in terreno di coltura fresco. Nota: per questo protocollo, la durata dell&#39;incubazione permette una buona etichettatura delle strutture della colonna vertebrale. </li></ol> 3. immunofluorescenza Nota: Al fine di migliorare l&#39;etichettatura di tutta la morfologia della colonna vertebrale, etichettatura immunofluorescenza è stata effettuata utilizzando un anticorpo anti-GFP in condizioni permeabilizzate. </p&gt; <ol><li> Togliere terreno di coltura e riparare cellule trasdotte su vetrini in paraformaldeide al 4% per 10 min a temperatura ambiente, poi lavare 3 volte in 1x PBS (10 minuti ciascuno). </li><li> Coprioggetto immergere in PBS integrato con 0,05% Triton (100x) e il 10% siero di cavallo per 1 ora a temperatura ambiente, poi lavare 3 volte in 1x PBS. </li><li> Aggiungere 100 pl di PBS 1x integrato con siero di cavallo 4% e anticorpo primario (1 / 1.000) sollevata contro GFP e diluito di un fattore di 1,000 su ciascun vetrino. Incubare in una scatola buia O / N a 4 ° C, quindi lavare 3 volte con PBS 1x. </li><li> Diluire Alexa Fluor 488 coniugato anticorpo (1/200) in PBS integrato con 0,5% di Tween 20 e incubare per 1 ora a RT. Quindi lavare 3 volte in PBS 1x e montare coprioggetto su vetrini con mezzo di montaggio per la microscopia a fluorescenza. </li></ol> 4. spine dendritiche Imaging <ol><li> Eseguire confocale Imaging attraverso un microscopio confocale a scansione laser. </li><li> Selezionare neuroni sani con una morfologia piramidaletrovare una dendritica pieno, e quantificare almeno 10 neuroni per condizione da esperimenti separati. Quantificare 60-100 micron per dendriti. </li><li> Acquisire le immagini utilizzando un olio 40X NA = 1.3 obiettivo e una linea laser 488 nm per GFP di eccitazione, con una potenza di picco tipica a livello di campione di circa 20? W. Imposta la dimensione dei pixel circa 80 nm per assaggiare correttamente spine dendritiche. Nota: La successiva chiamata analisi per un&#39;immagine in cui il rumore non compromette la corretta segmentazione dei dendriti e spine. Con le impostazioni di campionamento e di potenza spaziale di cui sopra, abbiamo osservato che un pixel di sosta a tempo di 3.15 ms è sufficiente per raccogliere abbastanza fotoni per costruire una tale immagine. Per campioni dim, la qualità dell&#39;immagine può essere migliorata facendo la media da 2 a 4 scansioni. L&#39;acquisizione di diverse piastrelle XY può essere necessario per coprire la regione di interesse, che poi deve essere cucita insieme prima della trasformazione. </li><li> Per campionare l&#39;intero volume neurone, acquisire un Z-stack, conZ spaziatura da 150 nm a 300 nm, producendo 20 a 30 fette Z. Nota: La risoluzione spaziale laterale realizzato con queste impostazioni è 234 nm e la risoluzione assiale è 591 nm. Il campionamento prescelto qui è adeguata, ma la risoluzione assiale è maggiore della dimensione minima delle spine da acquisire, l&#39;analisi favorisce le spine che si estendono lateralmente da dendriti. </li></ol> 5. 3D Quantificazione di spine dendritiche Nota: Le seguenti sezioni specificamente descrivono l&#39;uso del software Imaris per l&#39;analisi. Esistono implementazioni alternative, tra cui NeuronStudio 15 o Metamorph 8, che può fornire risultati simili. Utilizzare le seguenti impostazioni chiave: <ol><li> Come una fase di pre-processing, utilizzare il filtraggio gaussiana attraverso i servizi di elaborazione delle immagini offerte dal software. Eseguire il filtraggio gaussiano via Elaborazione immagini&gt; Smoocosa&gt; Filtro gaussiana. Impostare la larghezza del filtro di essere uguale alla dimensione dei pixel in XY. </li><li> Eseguire un tracciato semi-automatica dei dendriti, utilizzando il modulo Filament Tracer del software. <ol><li> Innanzitutto, stimare il diametro dendrite, utilizzando lo strumento distanza nella scheda Fetta del software. </li><li> Nella scheda Surpass, fare clic sullo strumento filamenti. Per una migliore robustezza, questo protocollo si basa su di tracking semi-automatico; clicca su Skip creazione automatica. L&#39;interfaccia del modulo ora sta mostrando la scheda Draw. Qui, seleziona AutoPath come metodo, Dendrite come tipo, e il diametro di ingresso dendrite stimato. </li><li> Utilizzare la Selezionare la modalità del puntatore, trasformando il cursore in una scatola. Shift-pulsante destro del mouse sul punto di partenza dendriti. Nota: il software esegue calcoli iniziali. </li><li> Spostare il puntatore lungo dendrite. Dal punto di partenza (rappresentareDE come una sfera blu), è mostrata una linea gialla che rappresenta il percorso dendrite più probabile. Shift-sinistra del mouse sul punto finale dendriti. </li></ol></li><li> Eseguire la spine di segmentazione automatica. Nota: Le spine sul dendrite tracciato si trovano automaticamente l&#39;interfaccia del modulo. <ol><li> Nell&#39;interfaccia del modulo, fare clic sulla scheda Creazione. Nel Ricostruisci casella di riepilogo, scegliere Rebuild Dendrite Diametro e selezionare la casella di dati Mastio. Quindi fare clic su Ricostruisci. </li><li> Impostare la soglia in modo che il volume segmentato corrispondente al volume effettivo dendrite. Come un algoritmo, selezionare più breve distanza dal Mappa distanza. Fare clic sul pulsante Avanti. </li><li> Determinare il più piccolo diametro della testa della colonna vertebrale e la lunghezza massima, sempre utilizzando lo strumento distanza nella scheda Fetta di software, per poi tornare alla scheda Surpass e immettere i parametri. Fo questo protocollo, i valori intorno a 200-300 nm per il diametro minimo e 4 micron per la lunghezza massima sono buoni punti di partenza. Non selezionare la casella Consenti Branch Spine. Fare clic sul pulsante Avanti. </li><li> Regolare la soglia Punti di semi in modo che i punti blu rappresentano spine localizzano alle teste della colonna vertebrale reali. Fare clic sul pulsante Avanti. Nota: Il calcolo nucleo è fatto ora e può essere lungo. </li></ol></li><li> Classificare spine andando alla scheda Strumenti dell&#39;interfaccia modulo. Clicca su Classifica Spine. Nell&#39;interfaccia utente viene richiesto, assicurarsi che non vi sono quattro classi, definite dalla loro morfologia come segue: tozza: lunghezza &lt;1 micron; Funghi: Lunghezza (colonna vertebrale)&gt; 3 e la larghezza massima (testa)&gt; significano larghezza (collo) x 2; Lungo e sottile: Media larghezza (testa) ≥ media larghezza (collo); Filopodia simile: Lunghezza ≤ 4 micron (senza testa). Nota: il moInterfaccia Dule genera quattro nuovi oggetti ad incandescenza contenenti i risultati della classificazione. </li><li> Esportazione Dati statistici: su uno di questi quattro interfacce degli oggetti, vai alla scheda Statistiche. Clicca sui Esporta tutte le statistiche su File. Nota: Altri valori statistici possono essere esportati per dendriti (es., Lunghezza, area, diametro, profondità ramo, diramazione angolo, volume, ecc media.), E per spine (per esempio, rettilineità, zona di attacco, la lunghezza e il volume di distinta parti della colonna vertebrale, del diametro della colonna vertebrale, densità, ecc.) </li></ol>

<ol><li>Durand, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHANK3+mutations+identified+in+autism+led+to+modification+of+dendritic+spine+morphology+via+an+actin-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism.</a> Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).</li>
<li>Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-synaptic+dendritic+spines+in+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Non-synaptic dendritic spines in neocortex.</a> Neuroscience. 145, 464-469 (2007).</li>
<li>Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-based+comparison+of+human+dendritic+spine+structure+using+complete+three-dimensional+reconstructions%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions.</a> Cerebral Cortex. 23 (8), 1798-1810 (2013).</li>
<li>Boissart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+of+cortical+neurons+of+the+superficial+layers+amenable+to+psychiatric+disease+modeling+and+high-throughput+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening.</a> Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).</li>
<li>Avale, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+of+beta+2%2A+nicotinic+receptors+and+dopamine+pathways+in+the+control+of+spontaneous+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion.</a> Proceedings of National Academy of Science USA. 105 (41), 15991-15996 (2008).</li>
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<li>Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+dendritic+spine+morphology+in+cultured+CNS+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2794(2011).</li>
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<li>Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+neuronal+differentiation+from+induced+pluripotent+stem+cells+to+model+ASD%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).</li>
<li>Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cells%3A+a+game+changer+for+future+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">iPS cells: a game changer for future medicine.</a> EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).</li>
<li>Stein, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquantitative+framework+to+evaluate+modeling+of+cortical+development+by+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells.</a> Neuron. 83, 69-86 (2014).</li>
<li>Sivapatham, R., Zheng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling.</a> Methods in Molecular Biology. , (2014).</li>
<li>Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+dysgenesis+in+Rett+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).</li>
<li>Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Three+Dimensional+Detection+and+Shape+Classification+of+Dendritic+spines+from+Fluorescence+Microscopy+Images%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images.</a> PLoS ONE. 3 (4), e1997(2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La quantificazione delle caratteristiche morfologiche di neuroni piramidali invocato il software. L&#39;interfaccia Filament Tracer è stato utilizzato per la segmentazione dei neuroni e spine, e il modulo XT è stato utilizzato per l&#39;analisi. Per analizzare la precisione della nostra tecnica, in primo luogo abbiamo confrontato i parametri morfologici misurati (lunghezza, area e volume totale della colonna vertebrale se applicabile), con quelli pubblicati utilizzando ratto neuroni piramida...

Spine dendritiche di neuroni piramidali corticali sono piccoli e sottili protuberanze che sono distribuiti lungo i dendriti basali e apicali di questi sottotipi neuronali in roditori, primati, e il cervello umano. Sono i luoghi di maggior sinapsi eccitatorie e visualizzare funzioni chiave nell&#39;apprendimento e processi cognitivi. Le strutture dettagliate delle spine dendritiche umani sono stati tecnicamente studiati da microscopia elettronica 2. Tuttavia, tale approccio è che richiede tempo e rappresenta pesante carico di lavoro. Più recentemente, un tridimensionale (3D) ricostruzione della morfologia delle spine dendritiche è stata riportata nella corteccia cerebrale umana usando software specifico combinato a grandi analisi colonna 3 manuale. Tecnologia verde proteina fluorescente (GFP) accoppiato ad immunofluorescenza rappresenta uno strumento preciso per l&#39;identificazione della colonna vertebrale e la misurazione forma al microscopio a fluorescenza. Questo approccio può essere facilmente applicato a colture neuronali. However, i dati non sono stati riportati sull&#39;analisi di maturazione della colonna vertebrale e della morfologia dei neuroni umani derivate da cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC). L&#39;obiettivo di questo studio è stato quello di descrivere un protocollo, che permette di spine dendritiche di imaging da colture di neuroni umani in vitro. Etichettatura GFP, microscopia confocale e analisi 3D con il modulo Filament Tracer di software Imaris sono stati utilizzati nel presente protocollo. Cultura passi che sono necessari per ottenere i neuroni glutamatergici corticali degli strati II-IV da cellule staminali neurali (NSC) sono anche brevemente descritto qui. L&#39;intero protocollo per la produzione NSC umano è già stato pubblicato altrove 4.

<table><tbody><tr><td>D-PBS (1x), senza calcio, magnesio e fenolo rosso</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di poli-L-ornitina Bioreagente</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Lamina di topo</td><td>Dutscher Dominique</td><td>354232</td><td></td></tr><tr><td>N2 Integratore</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>B-27 senza vitamina A (50x)</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/NUT. MIX F-12 W/GLUT-I</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>31331028</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Med SFM</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanolo</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Steptomicina</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>GFP Siero di coniglio Anticorpo policlonale</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>A-6455</td><td></td></tr><tr><td>Siero per cavalli</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit&nbsp;</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo policlonale anti-betaIII tubulina</td><td>Millipore</td><td>AB9354</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass 13 mm</td><td>VWR</td><td>631-0150</td><td></td></tr><tr><td>Reagente antisbiadimento Prolong Gold con DAPI</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Tween(R) 20 Bioextra, liquido viscoso</td><td>Sigma Aldrich Chimie</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich Chimie</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblasti umani</td><td>Biorepository della linea cellulare Coriell</td><td>GM 4603 e GM 1869</td><td>Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA</td></tr><tr><td>Microscopio a scansione laser confocale</td><td>Zeiss (Germania)</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>Imaris Software</td><td>Bitplane AG, Zurigo</td><td>versione 6.4.0</td><td>Sono necessari i moduli Filament Tracer e Imaris XT</td></tr><tr><td>Software Huygens Software</td><td>Huygens, SVI, Paesi Bassi</td><td>Versione Pro</td><td>Opzionale (per test di deconvoluzione)</td></tr></tbody></table>

quantificazione tridimensionale di spine dendritiche da piramidale neuroni derivate da cellule staminali umane pluripotenti indotte

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Spine dendritiche sono piccole sporgenze che corrispondono ai compartimenti post-sinaptici di sinapsi eccitatorie nel sistema nervoso centrale. Essi sono distribuiti lungo i dendriti. La loro morfologia dipende in gran parte l&#39;attività neuronale, e sono dinamici. Spine dendritiche esprimono i recettori glutamatergici (recettori AMPA e NMDA) sulla loro superficie e ai livelli di densità postsinaptiche. Ogni colonna vertebrale permette al neurone di controllare la propria attività statali e locali in modo indipendente. Morfologie della colonna vertebrale sono stati ampiamente studiati in cellule piramidali glutammatergici della corteccia cerebrale, utilizzando entrambi gli approcci in vivo e colture neuronali ottenute da tessuti di roditori. Condizioni neuropatologiche possono essere associate all&#39;induzione colonna vertebrale alterata e maturazione, come mostrato in roditori neuroni in coltura e analisi quantitativa unidimensionale 1. Il presente studio descrive un protocollo per l&#39;analisi quantitativa 3D di morfologie della colonna vertebrale utilizzando cortic umanoAl neuroni derivati ​​da cellule staminali neurali (progenitrici fine corticali). Queste cellule sono state inizialmente ottenute da cellule staminali pluripotenti indotte. Questo protocollo permette l&#39;analisi di morfologie della colonna vertebrale in periodi diversi della cultura, e con possibilità di confronto tra le cellule staminali pluripotenti indotte ottenuti da individui di controllo con quelli ottenuti da pazienti con malattie psichiatriche.

<html> Il presente studio descrive un protocollo standardizzato per la quantificazione della colonna vertebrale dei dendriti coltura di neuroni piramidali derivati ​​da IPSC. Questo protocollo permette l&#39;analisi della colonna maturazione sui neuroni umani e la sua possibile confronto con la maturazione delle spine in colture neuronali roditore standard così come in vivo in modelli animali. Figura 1A rappresenta uno schema delle varie fasi di coltura che permetton...

Spine dendritiche di neuroni piramidali sono i siti di maggior sinapsi eccitatorie in mammiferi corteccia cerebrale. Il metodo descrive un&#39;analisi quantitativa 3D di morfologie della colonna vertebrale nei neuroni piramidali glutamatergici corticali umane derivate da cellule staminali pluripotenti indotte.

Quantificazione tridimensionale di spine dendritiche da piramidale neuroni derivate da cellule staminali umane pluripotenti indotte

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di acquisire immagini di spine dendritiche da neuroni corticali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane e di quantificarle in tre dimensioni. Questo viene ottenuto trattando innanzitutto coprislip in piastre a sei pozzetti con poliornitina e laminina per la coltura di cellule staminali neurali. Successivamente, le cellule staminali neurali vengono diluite in coltura.I campioni vengono seminati utilizzando un movimento rotatorio delicato della pipetta e lasciati differenziare fino a 70 giorni in coltura. Rinnovando regolarmente il mezzo, le cellule vengono quindi trasdotte con lentivirus GFP, colorate con anticorpi anti-GFP e visualizzate. Infine, le colture vengono fissate e le spine dendritiche sono immaginate mediante microscopia confocale.In definitiva, i dati immagine delle spine dendritiche umane vengono ricostruiti in 3D per la loro classificazione e quantificazione. Questo protocollo fornisce una procedura passo dopo passo per ottenere neuroni glutammatergici dello strato due-quattro della corteccia cerebrale umana. Prevede l'uso di cellule staminali neurali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte

three-dimensional-quantification-dendritic-spines-from-pyramidal

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Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Numerosi studi recenti hanno identificato mutazioni di proteine ​​sinaptiche associate a patologie cerebrali. Colture di neuroni corticali primarie offrono una grande flessibilità in sede di esame gli effetti di queste malattie proteine ​​associate spine dendritiche sulla morfologia e la motilità.

Analisi di Morfologia spine dendritiche in colture di neuroni del SNC

Questo video descrive un metodo per preparare vetrini coprioggetti rivestiti con poliornitina e laminina per migliorare l'adesione e la crescita delle cellule staminali neurali. La tecnica prevede incubazioni e lavaggi sequenziali, facilitando la formazione di una matrice di supporto che promuove la crescita e la differenziazione delle cellule neuronali, imitando le strutture presenti nei neuroni.

Generazione di neuroni piramidali corticali da cellule staminali neurali umane

Fonte: Gouder, et. al. Quantificazione tridimensionale di spine dendritiche da neuroni piramidali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane. J. Vis. Exp. (2015).Questo video mostra l'imaging e l'analisi delle spine dendritiche in neuroni piramidali trasdotti e immunomarcati utilizzando la microscopia confocale. Il rumore di fondo è ridotto e i dendriti vengono tracciati stimandone il diametro e la lunghezza. La segmentazione automatizzata della colonna vertebrale comporta...

Quantificazione delle spine dendritiche mediante imaging al microscopio confocale

Questo articolo descrive un protocollo di lavoro di immagine spine dendritiche di neuroni dell'ippocampo in vitro utilizzando Structured Illumination Microscopy (SIM). Microscopia super-risoluzione usando SIM fornisce risoluzione di immagine notevolmente oltre il limite di diffrazione della luce in tutte le tre dimensioni spaziali, permettendo l'imaging di singole spine dendritiche con maggiore dettaglio.

Imaging spine dendritiche di Rat Primaria neuroni dell&#39;ippocampo utilizzando Structured Illumination Microscopy

Descriviamo due metodi per la visualizzazione e la quantificazione dell'arborizzazione dendritica nell'ippocampo di modelli murini: imaging in tempo reale e con profondità di campo estesa. Mentre il primo metodo consente un sofisticato tracciamento topografico e la quantificazione dell'estensione della ramificazione, il secondo consente una rapida visualizzazione dell'albero dendritico.

Valutazione della dendritiche arborizzazione nel giro dentato della Regione ippocampale nei topi

Il protocollo sviluppa un modello tridimensionale (3D) di un segmento dendritico con spine dendritiche per modellare la plasticità sinaptica. La rete costruita può essere utilizzata per la modellazione computazionale del traffico di recettori AMPA nella plasticità sinaptica a lungo termine utilizzando il programma software Blender con CellBlender e MCell.

Modellazione 3D di spine dendritiche con plasticità sinaptica

Vi presentiamo un protocollo per etichettare e analizzare i neuroni piramidali, che è fondamentale per valutare potenziali alterazioni morfologiche nei neuroni e nelle spine dendritiche che possono essere alla base di anomalie neurochimiche e comportamentali.

Etichettatura balistica dei neuroni piramidali nelle sezioni cerebrali e nella cultura cellulare primaria

Il protocollo descrive una modifica del metodo rapido Golgi, che può essere adattato a qualsiasi parte del sistema nervoso, per la colorazione dei neuroni nell'ippocampo e nella corteccia prefrontale mediale del ratto.

Macchia rapida di Golgi per la visualizzazione della colonna vertebrale dendritica nell'ippocampo e nella corteccia prefrontale

Le spine dendritiche sono compartimenti post-sinaptici della maggior parte delle sinapsi eccitatorie. Le alterazioni della morfologia della colonna vertebrale dendritica si verificano durante lo sviluppo neurologico, l'invecchiamento, l'apprendimento e molti disturbi neurologici e psichiatrici, sottolineando l'importanza di un'analisi affidabile della colonna vertebrale dendritica. Questo protocollo descrive la quantificazione della morfologia della spina dendritica in modo accurato e...

Quantificazione della spina dendritica utilizzando un software di ricostruzione automatica dei neuroni tridimensionali

Questo manoscritto fornisce una procedura passo-passo per la derivazione e il mantenimento di cheratinociti umani da capelli strappati e la successiva generazione di cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) prive di integrazione da vettori episomiali.

Generazione di cellule staminali Integrazione-libero umano pluripotenti indotte Utilizzando capelli derivati ​​da cheratinociti

Scopri l'analisi quantitativa tridimensionale delle spine dendritiche in neuroni piramidali umani derivati da cellule staminali pluripotenti indotte. Questo metodo consente di studiare la morfologia sinaptica in vitro.

Quantificazione tridimensionale di spine dendritiche da piramidale neuroni derivate da cellule staminali umane pluripotenti indotte (Video) | JoVE Journal

Quantificazione tridimensionale di spine dendritiche da piramidale neuroni derivate da cellule staminali umane pluripotenti indotte

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