Quantificazione tridimensionale di spine dendritiche da piramidale neuroni derivate da cellule staminali umane pluripotenti indotte

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare le spine dendritiche da neuroni perali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo e quantificarle in tre dimensioni. Ciò si ottiene trattando prima i vetrini coprioggetti in piastre a sei pozzetti con poliuretano e laminina per la coltura di cellule staminali neurali. Successivamente, cellule staminali neurali diluite in coltura.

I terreni vengono placcati, utilizzando un leggero movimento rotatorio della pipetta e possono differenziare fino a 70 giorni in coltura. Rinnovando regolarmente il terreno, le cellule vengono trasdotte con lentivirus GFP colorate con anticorpi anti GFP e visualizzate. Infine, le colture vengono fissate e le spine dendritiche vengono visualizzate utilizzando la microscopia confocale.

Infine, i dati delle immagini delle spine dendritiche umane vengono ricostruiti in 3D per la loro classificazione e quantificazione. Questo protocollo fornisce una procedura graduale per ottenere neuroni glutammatergici di strato da due a quattro della corteccia cerebrale umana. Prevede l'uso di cellule staminali neurali derivate da cellule staminali prepotenti indotte dall'uomo che provengono da fibroblasti umani sulla base del metodo precedentemente pubblicato.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai nostri metodi esistenti è che consente la segmentazione automatica del diritto DON e del PY in 3D. Questo con un notevole guadagno di tempo rispetto ai software esistenti, che in genere si preparano solo dall'analisi 2D. Il donr e spy nelle classificazioni è molto pratico e facile da usare.

Per preparare le colture neuronali, posizionare i vetrini di copertura in sei piastre di coltura a pozzetti e aggiungere l'incubazione di poliornitina per una notte sotto una cappa di flusso il giorno successivo. Utilizzare DPBS per lavare i vetrini coprioggetto tre volte e aggiungere la laminina, incubare sotto una cappa di flusso per almeno 10 ore. Preparare il terreno di coltura contenente i seguenti componenti.

Quindi utilizzare il terreno per piastrare e inviare cellule staminali neurali o NSCS a una densità di 50.000 cellule per centimetro quadrato Pipettaggio con movimenti rotatori lenti al fine di ridurre il raggruppamento cellulare per trasdurre i neuroni umani derivati da IPSC. In qualsiasi fase della maturazione, aggiungere un microlitro di una soluzione madre contenente 40 nanogrammi di vettore lentivirale GFP per pozzetto di coltura contenente terreno di coltura fresco e incubare a 37 gradi Celsius per 48 ore. Per preparare le cellule all'immunofluorescenza, rimuovere il terreno di coltura e utilizzare il 4% di formaldeide per fissare le cellule trasdotte a temperatura ambiente per 10 minuti.

Quindi utilizzare un XPBS per lavare le celle tre volte per 10 minuti ciascuna. Successivamente, immergere i vetrini coprioggetto in PBS integrato con 0,05% di Tritone X 110% di siero di cavallo e incubare a temperatura ambiente per un'ora. Quindi utilizzare PBS per lavare i vetrini coprioggetto tre volte.

Aggiungere un anticorpo primario 1000th GFP in 100 microlitri di siero di cavallo PBS 4% a ciascun vetrino coprioggetti. Incubare in una scatola buia a quattro gradi Celsius per una notte. Ora diluire Alexa Fluor 4 88 anticorpo coniugato da uno a 200 in PBS 0,5% tra 20 e incubare le cellule con la soluzione di anticorpi a temperatura ambiente per un'ora dopo aver utilizzato PBS per lavare i vetrini tre volte.

Utilizzare il mezzo di montaggio per montare i vetrini per la microscopia a fluorescenza. Sotto un microscopio confocale, selezionare almeno 10 neuroni sani per condizione con una morfologia parametallica e un'arborizzazione dendritica a pieghe per quantificare da 60 a 100 micrometri per dendrite. Acquisire immagini con un obiettivo a olio 40 x na, 1,3 e un laser a 488 nanometri con una potenza di picco tipica a livello di campione di circa 20 micro watt, impostare la dimensione dei pixel intorno a 80 nanometri per le spine dendritiche correttamente campionate.

Per campionare l'intero volume del neurone, acquisire una pila Z con una spaziatura Z da 150 a 300 nanometri, producendo da 20 a 30 fette Z per eseguire la quantificazione 3D delle spine dendritiche. Utilizzare le seguenti impostazioni per il software di analisi per la pre-elaborazione. Utilizzare il filtro gaussiano scegliendo l'elaborazione delle immagini che leviga il filtro gaussiano.

Impostare la larghezza del filtro uguale alla dimensione dei pixel nel piano XY per eseguire un tracciamento semiautomatico dei dendriti dal modulo tracciante del filamento. Nella scheda fetta, utilizzare lo strumento distanza per stimare il diametro del dendrite. Successivamente, nella scheda superata, fai clic sullo strumento filamenti e scegli Salta creazione automatica per una migliore robustezza nella scheda Disegna.

Ora viene presentato selezionare il percorso automatico come metodo, il dendrite come tipo e inserire il diametro stimato del dendrite. Utilizzando la modalità di selezione del puntatore, ruotare il cursore in una casella e scegliere Maiusc e fare clic con il pulsante destro del mouse sul punto iniziale del dendrite. Il software eseguirà i calcoli iniziali.

Ora sposta il puntatore lungo il dendrite dal punto di partenza. Viene mostrata una linea gialla che rappresenta il percorso dei dendriti più probabile. Premi Maiusc e sinistra.

Fare clic sul punto finale del dendrite per eseguire la segmentazione automatica della colonna vertebrale nell'interfaccia del modulo. Fare clic sulla scheda di creazione nell'elenco a discesa di ricostruzione. Scegli Ricostruisci diametro dendrite e seleziona la casella Mantieni dati.

Quindi fare clic su Ricostruisci. Impostare la soglia in modo che il volume segmentato corrisponda al volume effettivo dei dendriti. Come algoritmo, selezionare la distanza più breve dalla mappa delle distanze.

Quindi fare clic sul pulsante successivo sotto la scheda della fetta, determinare la colonna vertebrale più piccola, il diametro della testa e la lunghezza massima. Quindi, nella scheda Oltrepassa, inserisci i valori dei parametri da 200 a 300 nanometri per il diametro minimo e quattro micrometri per la lunghezza massima sono buoni Punti di partenza senza selezionare la casella Consenti spine, fai clic sul pulsante Avanti. Quindi, regola la soglia dei punti di partenza in modo che i punti blu che rappresentano le spine siano localizzati rispetto alle teste effettive delle spine.

Quindi fare clic su Avanti. Il calcolo del nucleo verrà ora eseguito e può richiedere del tempo per classificare le spine nella scheda degli strumenti dell'interfaccia del modulo, fare clic su Classifica spine. Dopo aver verificato che ci siano quattro classi come indicato nel protocollo di testo, l'interfaccia del modulo genererà quattro nuovi oggetti filamento con i risultati della classificazione.

Infine, esporta i dati statistici nella scheda delle statistiche facendo clic su esporta tutte le statistiche su file. Questa figura illustra la coltura dei neuroni umani etichettati come anticorpi anti beta tre tubulina. La tendenza al raggruppamento cellulare è evidente anche qui.

Qui è mostrato un neurone parametallico marcato GFP 40 giorni dopo la differenziazione da un progenitore corticale tardivo. Dagli strati corticali superficiali. L'inserto mostra un ingrandimento inferiore con il corpo cellulare apparente.

Questi pannelli rappresentano la ricostruzione 3D di segmenti di spine dendritiche a diversi stadi di maturazione. L'analisi quantitativa della densità e del volume della testa della colonna vertebrale è mostrata qui. Come previsto, questi due parametri aumentano nel periodo di coltura.

Durante la procedura di coltura, è importante preparare e spedire con molta attenzione le cellule staminali neuro aggiungendo cellule lentamente con un leggero movimento rotatorio al fine di ridurre la colina cellulare. Infatti, questo metodo richiede l'identificazione dei singoli neuroni.