Imaging spine dendritiche di Rat Primaria neuroni dell'ippocampo utilizzando Structured Illumination Microscopy

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare le spine dendritiche in super risoluzione. Ciò si ottiene preparando prima un ippocampo primario di ratto chiamato il secondo passo è visualizzare le spine dendritiche mediante trasfezione e colorazione GFP. Successivamente, l'acquisizione delle spine dendritiche marcate con GFP viene effettuata in super risoluzione utilizzando un microscopio SIM.

Il passaggio finale consiste nel ricostruire i dati dell'immagine grezza in 3D pronti per la successiva analisi dell'immagine. In definitiva, i neuroni primari dell'ippocampo che esprimono GFP ripresi in super risoluzione vengono utilizzati per mostrare sottili cambiamenti nella morfologia della spina dendritica. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la microscopia confocale convenzionale è che consente di studiare la morfologia della colonna vertebrale dendritica in modo più dettagliato.

Questo metodo può aiutare a esaminare le questioni chiave in corso nelle neuroscienze, come le alterazioni molecolari e farmacologiche dipendenti nella forma delle spine dendritiche. La microscopia di eliminazione strutturata si basa sulla proiezione di modelli di linee sul campione, e questo fornisce informazioni extra che possono essere estratte da un programma per computer e fornisce immagini più nitide e che consentono di osservare i mitocondri MI e altre piccole strutture nella cellula. Una dimostrazione visiva di questo metodo è importante per ottenere una valida ricostruzione di un'immagine SIM è fondamentale per passare attraverso i passaggi che ti danno una buona qualità dei dati grezzi.

Un'importante fase preparatoria prevede la verniciatura dei vetrini, lavorando in una cappa laminare sterile. Utilizzare piccole pinze sterili per posizionare i singoli vetrini di copertura nei singoli pozzetti di una piastra a 12 pozzetti. Quindi aggiungere 500 microlitri di soluzione di polilisina a ciascun pozzetto per immergere i vetrini.

Dopo aver lavato i pozzetti, aggiungere un millilitro di terreno di placcatura e lasciare i vetrini nell'incubatore di coltura tissutale per un massimo di 24 ore prima di galvanizzare le cellule. La procedura sarà dimostrata da HU is SH uno studente di dottorato nel nostro gruppo. Dopo aver isolato l'embrione di un ratto, utilizzare una pinza fine per rimuovere e scartare il cervelletto dal cervello.

Separare i due emisferi praticando un taglio sagittale lungo la linea mediana al microscopio da dissezione, utilizzare un paio di piccole pinze per tenere delicatamente il mesencefalo e rimuovere il mesencefalo. Con un altro paio di pinze, lasciare intatto il resto dell'emisfero contenente la corteccia e l'ippocampo. Quindi, rimuovere con cura le meningi, riorientare il tessuto in modo che l'ippocampo sia rivolto verso l'alto.

L'ippocampo può essere identificato dalla sua caratteristica struttura a forma di CS. Usando una pinza fine, seziona l'ippocampo e mettilo in un nuovo piatto da 30 millimetri contenente un piatto freddo fresco X-H-B-S-S. Dopo aver rimosso i campi ippopotamo da tutti gli embrioni, conta il numero totale di campi ippopotami e poi tagliali in piccoli pezzi.

Raccogliere i pezzi in una provetta da centrifuga da 15 millilitri contenente tre millilitri di un X-H-B-S-S. Dopo aver centrifugato e rimosso il surnatante, aggiungere sei microlitri di tripsina per ippocampo. Dopo l'incubazione e il lavaggio dei frammenti dell'ippocampo come descritto nel protocollo di testo, tatuare lentamente i frammenti 30 volte con una pipetta da pastore lucidata a fuoco fino a quando tutti i pezzi di tessuto sono dispersi in modo omogeneo in singole cellule.

Fare attenzione a evitare bolle. Quindi, aggiungere cinque millilitri di mezzo di placcatura, preavvertito a 37 gradi Celsius. Dopo aver contato le cellule utilizzando un seme di colorazione vitale trian blue, 50.000 cellule per pozzetto di una piastra a 12 pozzetti in un millilitro di terreno di placcatura per un volume totale di due millilitri.

Dopo aver fatto oscillare la piastra per distribuire uniformemente le cellule, incubare le cellule a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica. Dopo due o tre giorni, sostituire 0,5 millilitri di terreno di coltura con terreno di coltura contenente 10 micromolari di FUDR. Per trasfettare, i neuroni aggiungono una lipectomia.

Mescolare goccia a goccia fino a ottenere una miscela di DNA e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. In una cappa a flusso laminare, 10 minuti prima della fine della miscela di lipectomia DNA di 30 minuti, incubazione, pipettare il terreno condizionato dalla piastra di coltura originale o dalla prima piastra di coltura a una seconda 12. Preparare bene e conservare questa piastra a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica nella prima piastra di coltura.

Rapidamente sostituito il terreno condizionato con un millilitro di terreno di incubazione preriscaldato per evitare che le cellule si secchino. Riposizionare entrambe le piastre nell'incubatrice a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica. Al termine dell'incubazione della lipectomia del DNA di 30 minuti, la miscela per lipectomia del DNA è pronta per essere aggiunta alle cellule.

Aggiungere delicatamente 200 microlitri della miscela per lipectomia DNA in ogni pozzetto e incubare per 45 minuti a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica. Dopo l'incubazione di 45 minuti, utilizzare una piccola pinza per sollevare i vetrini coprioggetti che trattengono i neuroni. Sciacquateli immergendoli in un piatto di tre centimetri contenente un terreno neurobasale fresco e caldo e metteteli in una fontana.

Nel secondo 12, piastra a pozzetti contenente il mezzo condizionato. Quindi incubare i neuroni trasfettati a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per 48 ore. Per prepararsi alla colorazione immunologica, aspirare delicatamente il terreno dai pozzetti contenenti i vetrini.

Quindi aggiungere con attenzione 500 microlitri di PFA caldo al 4% per evitare di danneggiare i dendriti. Dopo l'incubazione e il lavaggio del blocco cellulare con una soluzione all'1% di T-B-S-B-S-A a temperatura ambiente per 30 minuti dopo un nuovo lavaggio, aggiungere l'anticorpo primario diluito in incubazione, mescolare e incubare a temperatura ambiente per un'ora. Quindi incubare per una notte a quattro gradi Celsius agitando delicatamente.

La mattina dopo, rimuovere l'anticorpo primario e lavare nuovamente da qui in poi, tenere i vetrini coprioggetto al riparo dalla luce. Quindi, aggiungere l'anticorpo coniugato fluorescente secondario diluito in incubazione. Mescolare e incubare a temperatura ambiente per due ore.

Quindi rimuovere l'anticorpo secondario e lavare le cellule con una pinzetta fine. Rimuovere i vetrini coprioggetto dai pozzetti e asciugare l'eccesso di TBS con un fazzoletto. Infine montare i vetrini coprioggetto utilizzando il mezzo di montaggio e sigillare con smalto per unghie.

Per iniziare l'imaging SIM, accendi il laser a 488 nanometri, la lampada al mercurio, il controller da palco, il controller pizo e la lampada alogena per la luce trasmessa. Avviare il software SIM in modalità e o per nsim. Dopo aver messo una goccia di olio da immersione sull'obiettivo, verificare che non vi siano bolle d'aria nella goccia d'olio.

Posizionare il vetrino coprioggetti con i neuroni dell'ippocampo sul tavolino del microscopio. Spostare l'obiettivo verso l'alto fino a quando l'olio tocca il campione. Ricordarsi di posizionare una copertura sul tavolino durante la procedura di acquisizione per proteggere il campione dalla luce ambientale e attenuare il più possibile la luce nella stanza.

Nel software SIM, selezionare la configurazione ottica IFI e selezionare un blocco filtro vuoto tra loro per l'ispezione visiva con messa a fuoco del campione di impostazione della luce bianca. Successivamente spegnere la luce bianca e accendere la lampada al mercurio. Apri l'otturatore e seleziona il filtro verde per cercare un dendrite sufficientemente luminoso.

Dopo aver incontrato un dendrite di interesse sufficientemente luminoso e aver centrato un segmento di interesse nel campo visivo, chiudere l'otturatore. Impostare il software sulla configurazione ottica 3D SIM 4 88 e le impostazioni della fotocamera come segue. Imposta la modalità di lettura su em.

Guadagna un megahertz a 16 bit. Impostare il tempo di esposizione su 100 millisecondi. Imposta la potenza del laser su 5% Imposta il guadagno EM su 200.

Con la velocità di messa a fuoco impostata su extra fine, mettere a fuoco l'oggetto di interesse. Regolare rapidamente le impostazioni della fotocamera come segue. Per ottenere un valore di intensità compreso tra 30, 040 e 5, 000, impostare la potenza del laser da 0% a 20% Impostare il tempo di esposizione da 50 millisecondi a due secondi.

Imposta la modalità di lettura su em. Guadagna un megahertz a 16 bit. Impostare il guadagno EM su zero a 300.

Impostare il guadagno di conversione da una x a 5,1 x. Impostare il formato per live su no Benning. Impostare il formato per l'acquisizione su no Benning.

Quindi, configurare le impostazioni dello stack a tre DZ nel pannello della sequenza ND come segue, impostare l'intervallo su due micron. Imposta la dimensione del passo su 120 nanometri e fai clic sulla posizione iniziale. Quindi selezionare la configurazione ottica, 3D SIM 4 88 nella sezione lambda.

Dopo aver selezionato la SIM 3D come modalità di acquisizione, eseguire l'acquisizione della sequenza ND e salvare i dati grezzi mostrati qui sono mostrati i dendriti e le spine dendritiche ripresi con la microscopia confocale e sim. Le acquisizioni sono state ricostruite a partire da immagini confocali e SIM. I dendriti sono stati tracciati e le spine sono state classificate automaticamente con il software dopo aver regolato i parametri principali come la lunghezza del collo, il diametro del collo e il diametro della testa.

Le aree in scatola mostrano una singola spina dendritica ripresa con microscopia confocale e simulata e ricostruita dalle corrispondenti pile Z, raffigurante differenze di risoluzione e accuratezza delle ricostruzioni 3D risultanti. Secondo la SIM, l'analisi quantitativa a risoluzione più elevata del diametro della testa e del collo ha rivelato che la microscopia sim misura dimensioni significativamente più piccole rispetto alla microscopia confocale per le stesse spine dendritiche, indicando che la SIM è in grado di rilevare cambiamenti più piccoli nella morfologia della spina dendritica. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordarsi di acquisire immagini grezze di alta qualità per una più valida ricostruzione successiva dell'immagine stessa.

La microscopia a illuminazione strutturata può anche essere efficace per l'imaging di cellule vive, consentendo lo studio della dinamica di cellule come cellule Hela, neuroni o batteri E coli. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare, visualizzare e l'immagine standard spiega dai neuroni primari dell'ippocampo in una super risoluzione.