Name: Rilevazione sensibile di Proteopathic Semina attività con FRET Citometria a flusso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Scopri un saggio FRET a citometria a flusso per rilevare attività di semina proteopatica con elevata sensibilità. Questo metodo consente di studiare aggregati proteici nelle malattie neurodegenerative.

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Questo lavoro è stato supportato dal Consorzio Tau (M.I.D); National Institutes of Health Grant 1R01NS071835 (M.I.D.), una sovvenzione del Dipartimento della Difesa PT110816 (a M.I.D.), 1F32NS087805 (a J.L.F.) e 1F31NS079039 (a B.B.H.).

NOTA: Questo protocollo enfatizza l&#39;uso di FRET citometria a flusso per rilevare attività di seeding da campioni biologici del mouse. E &#39;anche compatibile con fibrille ricombinanti e campioni biologici umani. Mouse l&#39;eutanasia e il cervello raccolta è stata effettuata in conformità con le procedure IACUC approvati. 1. Cervello Estrazione <ol><li> A seguito di profonda anestesia con isoflurano (2%), defluire in un mouse con ghiacciata PBS contenente 0,03% di eparina, ed estrarre il cervello seguendo le istruzioni dettagliate riportate nella Gage et al. 18 </li><li> Posizionare il tessuto estratto in crio-fiala, e far scattare freeze mettendo in azoto liquido. In alternativa, congelare il tessuto in ghiaccio secco. Una volta congelato, trasferire tessuto a -80 ° C e conservare per un periodo di tempo prolungato, se necessario. NOTA: Questo protocollo è compatibile con interi omogenati cerebrali o regioni cerebrali micro-sezionato. Vedere Hagihara et al., Per una dettagliata protocollo micro-dissezione 19. </li></ol&gt; 2. Preparazione delle sementi biologiche materiale <ol><li> Preparare tampone omogeneizzazione sciogliendo inibitori della proteasi (EDTA gratuito) in 1x TBS (1 compressa per 10 ml). Vortex con vigore, e memorizzare sul ghiaccio. Gli inibitori della proteasi devono essere EDTA liberi al fine di preservare la vitalità cellulare biosensore. </li><li> Pesare tessuto cerebrale congelato in una pesa barca usa e getta, e trasferire in una provetta da 5 ml. Aggiungere ghiacciata buffer di omogeneizzazione tale che questa soluzione finale è del 10% peso / volume. Temporaneamente memorizzare sul ghiaccio. Massa di tessuto e successiva omogeneizzazione polmone variano a seconda delle dimensioni del cervello e / o delle regioni utilizzato. Qui, un hemibrain topo adulto peso 0,2 g viene sospeso in 2 ml di 10% w / soluzione vol. </li><li> Campioni di trasferimento in una stanza fredda e regolare un sonicatore sonda per le impostazioni appropriate. Per sonda sonicazione con Omni Ruptor (qui illustrato), impostare la potenza al 20%, che corrisponde a circa 75 W. Utilizzare un modo a impulsi per garantire campioni non sono Over-riscaldata durante sonicazione. Impostare il pulser al 30%, corrispondente a circa 500 msec. </li><li> Pulire la punta della sonda sonicatore risciacquando con acqua, isopropanolo, e ancora acqua, rimuovendo la sonda tra ciascuna soluzione. Essere certi di lavare e pulire entrambi i lati e la parte inferiore della sonda con laboratorio-salviette. </li><li> Lavorare con un campione alla volta, immergere la punta della sonda nel buffer di omogeneizzazione, e avviare il sonicatore. Utilizzando le impostazioni di alimentazione e pulser sopra descritte, consegnare 25 impulsi totali. Assicurarsi che il tessuto è completamente in sospensione. Fare attenzione ad evitare la formazione di schiuma del campione durante questa fase. NOTA: I campioni sono suscettibili alla formazione di schiuma se a) il volume totale è basso o b) l&#39;omogenato riscalda. Con questo strumento specifico, non sonicare con volumi inferiori a 250 microlitri. Per garantire i campioni rimangono refrigerati, i tubi possono essere conservati in ghiaccio durante questa fase. </li><li> Pulire la sonda asciugandosi lisato residua, poi consegnare 10 impulsi in un bicchiere oacqua pulita f. Sciacquare le pareti e il fondo della sonda con acqua, isopropanolo, e l&#39;acqua di nuovo (come al punto 2.4), asciugandosi asciugare tra un passo. Per evitare la contaminazione, sciacquare la sonda in tra i campioni. NOTA: Con aggregati tau, non abbiamo trovato che i metodi di pulizia più severi sono necessari per prevenire la contaminazione da campione a campione. Altri amiloidi, tuttavia, possono necessitare di cure aggiuntive che è stato ampiamente descritto in letteratura 20,21. </li><li> Conservare omogenati in ghiaccio fino sono stati elaborati tutti i campioni. </li><li> Spin omogenati a 21.300 xg per 15 minuti a 4 ° C. </li><li> Trasferire il surnatante in una provetta pulita, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Eliminare il pellet. Aliquota il surnatante, e conservare lisati a -80 ° C per un ulteriore uso. Evitare cicli di congelamento / scongelamento dei omogenati, tuttavia, come questo riduce l&#39;efficienza semina. </li></ol> 3. Cellule replating biosensore NOTA:Utilizzare quattro linee di cellule per questo dosaggio: HEK 293T (linea cellulare # 1), RD-P301S-CFP (linea cellulare 2 #), RD-P301S-YFP (linea cellulare 3 #), e RD-P301S-CFP / YFP ( linea cellulare # 4). Si prega di fare riferimento Tabella 1 per il contributo di ogni linea cellulare per il test. <ol><li> In un ambiente sterile, terreno di coltura aspirato. Lavare le cellule con PBS caldo, e aspirare. Trypsinize cellule (3 ml di tripsina-EDTA (0,05%)) per 3 minuti, spegnere con terreno di coltura caldo (9 ml di DMEM, 10% FBS, 1% penna / strep, 1% Glutamax), e trasferire immediatamente le cellule a una tubo conico. </li><li> Cellule centrifugare a 1000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il terreno, e pellet di cellule risospendere in mezzo di coltura caldo. </li><li> Utilizzando un emocitometro, determinare la densità delle cellule per ciascuna linea cellulare. Densità cellulare varia a seconda confluenza al momento della raccolta e del volume risospensione. Risospendere le cellule raccolte da un piatto 10 cm al 90% di confluenza in 10 ml media, per la densità cellulare di circa 1 milione di cellule / ml. </li><li> Compiereun master mix di cellule + supporti in modo tale che ciascun pozzetto di una piastra ben 96 conterrà 35.000 cellule in 130 microlitri mezzi (ad esempio, per fare un master mix per 100 pozzi, risospendere 3,5 milioni di cellule in 13 ml di media). Modificare il numero di cellulare per soddisfare i singoli progetti sperimentali e scadenze. Per il trattamento delle cellule ~ 18 ore dopo la placcatura, aggiungere 35.000 cellule per ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. </li><li> Utilizzando una pipetta multicanale, lentamente pipetta 130 ml di sospensione cellulare master mix in ogni pozzetto di un fondo piatto, tessuto cultura trattati 96 pozzetti. Mentre placcatura, posizionare la punta della pipetta nel centro del pozzo, senza toccare il fondo della piastra. NOTA: Sebbene formato placcatura può essere modificata, rendendo n = 4 pozzetti per ogni linee cellulari 1-3 per piastra è raccomandato. Il resto della piastra (n = 84) è riservato per linea cellulare # 4 (cellule biosensori). </li><li> Permettono alle cellule di stabilirsi lasciando la placca indisturbato per 10 minuti a temperatura ambiente. Incubare O / N a 37 ° C, 5% CO 2, e &amp;# 8805; 80% di umidità relativa. </li></ol> 4. Cellule Trattamento NOTA: Il giorno seguente, quando le cellule biosensori tau sono 60-65% confluenti, preparare semi di complessi di trasduzione come segue: <ol><li> In un tubo, unire reagenti di trasfezione, come Lipofectamine, con media-siero ridotto, come Opti-MEM, per fare un master mix. Per bene, aggiungere 1,25 ml di reagente di trasfezione e 8,75 ml di media-siero ridotto. Tubo Flick delicatamente per miscelare brevemente spin down, e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> In un altro tubo, combinare materiale seme (aliquota di lisato dal punto 2.9) con media-siero ridotto. NOTA: Volume del materiale di seme varierà secondo l&#39;esperimento individuale. Al momento di scegliere il volume del seme, prendere in considerazione: l&#39;abbondanza di semi in un campione e potenziale tossicità. Omogenati greggio possono essere tossici per le cellule. In quanto tale, utilizzare il volume più basso possibile per monitorare l&#39;effetto desiderato. Volumi precedentemente testati di lisato / pozzetto gamma from 1-5 ml, corrispondenti a proteine ​​totali 5-20 mg. Assicurarsi che il volume totale per pozzetto (semi + media-siero ridotto) è di 10 ml. </li><li> Unire il contenuto dei due tubi descritti in 4.1 e 4.2, flick delicatamente per miscelare brevemente spin down (1.000 xg, 5 sec), e incubare a temperatura ambiente per almeno 20 minuti e fino a 2 ore. </li><li> Pipettare delicatamente 20 ml di complesso trasduzione sul lato di singoli pozzetti biosensori. Utilizzare tre repliche tecnici, se possibile. Ritorna cellule trattate per l&#39;incubatore per 24-48. Incubare nelle stesse condizioni come descritto al punto 3.6. NOTA: La condizione di controllo negativo appropriato per questa configurazione è cellule biosensori trattate con liposomi vuoti (ad esempio, il reagente liposomi + media-siero ridotto), perché l&#39;applicazione di fosfolipidi introduce un leggero cambiamento nel profilo di fluorescenza rispetto al biosensori cellule non esposte al reattivo liposomi. </li></ol> 5. Celle di raccolta per FRET Citometria a flusso <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; NOTA: prima della raccolta cellule generalmente a 24-48 post-trattamento è possibile ottenere una lettura preliminare di attività semina utilizzando il filtro GFP su un microscopio a fluorescenza invertito. Le cellule trattate senza materiale di semi (cioè liposomi vuote) mostreranno fluorescenza diffusa, mentre le cellule trattate con materiale seme mostrerà intenso puntata e inclusioni reticolari intracellulari (Figura 1A - B). <ol><li> Utilizzando una pipetta multicanale, aspirare tutte di medie cella (150 ml). Trypsinize (50 ml), le cellule per 5 minuti, e dissetare con 150 ml refrigerata terreno di coltura. Non includere un risciacquo PBS prima di tripsinizzazione in questa fase, in quanto può provocare il sollevamento delle cellule e la successiva perdita di cellule. Escludere eventuali cellule morte contaminanti e detriti durante citometria a flusso, tramite strategie di gating. </li><li> Subito dopo tempra, le cellule di trasferimento ad una piastra di fondo pozzo rotondo 96, e centrifugare a 1000 xg per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare e scartare medio, avendo cura di evitare di disturbare il pellet. </li><li> Delicatamente, ma a fondo, risospendere il pellet cellulare in 50 ml 2% paraformaldeide, e incubare per 10 min. In alternativa, le cellule eseguire dal vivo, anche se la fissazione fornisce i risultati più puliti e più coerenti. </li><li> Cellule centrifugare a 1000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare e scartare paraformaldeide, avendo cura di evitare di disturbare il pellet. </li><li> Delicatamente, ma accuratamente, risospendere il pellet cellulare in 200 microlitri di flusso refrigerata citometria tampone (HBSS, 1% FBS, 1 mM EDTA) ed eseguire la piastra appena possibile per evitare grumi cellule. </li></ol> 6. FRET Citometria a Flusso NOTA: Utilizzare un citofluorimetro come il MACSQuant VYB, che è dotato di FRET-compatibile linee laser e set di filtri (Tabella 2). Per ogni passo all&#39;interno di questa sezione, fare clic sul pozzo di interesse utilizzando il modello a 96 pozzetti del software, quindi fare clic su&quot;Play&quot; per iniziare l&#39;assorbimento e il flusso del campione. Fai trame o tabelle statistiche cliccando sull&#39;icona &#39;nuova finestra di analisi&#39;. Modificare i parametri degli assi su singoli appezzamenti bivariati facendo clic sul titolo sulla X o Y e selezionare il filtro appropriato. Per spostare popolazioni cellulari o segnali di fluorescenza, aumentare o diminuire le tensioni associate con i filtri appropriati. Con questo strumento, eseguire &lt;1.000 eventi / sec per garantire un monitoraggio cella singola accurata. <ol><li> Fai un Side Scatter-Area (SSC-A) vs Forward Scatter-Area (FSC-A) plot bivariata, e con linea cellulare # 1 in funzione, regolare le tensioni di SSC e FSC fino a quando la popolazione cellulare è nel quadrante in basso a sinistra. Fare clic sullo strumento poligono, e definire la popolazione cellulare (Porta P1). Per tutti i parametri di gating vedi figura 2. </li><li> Fare un FSC-H (altezza) vs plot FSC A bivariate, e applicare Porta P1 a tale grafico, facendo clic su &quot;live&quot; al di sopra della trama, e selezionando P1. Con la linea di cellule # 1in esecuzione, fare clic sullo strumento poligono, e definire singole cellule (Porta P2). </li><li> Fai 3 istogramma, uno per ognuno dei filtri di interesse: CFP, YFP e FRET. Applicare Porta P2 a tutte queste trame cliccando su &quot;live&quot; sopra le trame, e selezionando P2. Con la linea di cellule # 1 in funzione, regolare le tensioni in modo che la popolazione di cellule mediana nella PCP, YFP, e ti agiti istogrammi sono tutti tra 0 e 1. Per misurare la PCP e FRET, eccitare le cellule con il laser 405 nm, e la cattura di fluorescenza con una 450/50 nm e 525/50 nm filtro, rispettivamente. Per misurare YFP, eccitare le cellule con un laser e cattura la fluorescenza 488 nm con un 525/50 nm filtro. Impostazioni laser e filtro sono ulteriormente descritti nella Tabella 2. </li><li> Eseguire il risarcimento dei CFP spillover nei canali FRET e YFP. NOTA: Il risarcimento è il processo di correzione di fluorescenza spillover. Fluorescenza spillover si verifica ogni volta che viene rilevata l&#39;emissione di fluorescenza di un fluorocromo all&#39;interno di un filtro designato per misurare il segnale da un altro fluorocromo. Con una corretta compensazione, le ripercussioni di fluorescenza PCP può essere rimosso dai canali FRET e YFP. NOTA: Compensazione richiede la presenza di entrambe le celle -positive e -negative fluorescenza. Pertanto, per compensare su cellule PCP-positive (linea cellulare 2 #), cellule negative (linea cellulare # 1) devono essere aggiunti al campione prima della corsa. <ol><li> Spike in 30 ml di linea cellulare # 1 sospensione da un singolo pozzo in 200 ml di linea cellulare # 2 sospensione immediatamente prima di compensazione. </li><li> Fare clic sull&#39;icona &quot;Impostazioni strumento&quot;, quindi la scheda &#39;indennizzo&#39;, e verificare &#39;matrice&#39; per aprire la tabella di compensazione. </li><li> Fare un FRET-A vs CFP-Una trama bivariate, e applicare porta P2, come descritto al punto 6.3. Con le linee di cellule 1 + 2 in esecuzione, fare clic sull&#39;icona &#39;quadrante&#39; e disegnare quadranti tale che le popolazioni di fluorescenza -negative e -positive sono separati da due quadranti inferiori (Gates LL3 unnd LR3, rispettivamente). </li><li> Creare una tabella delle statistiche che visualizza l&#39;intensità media di fluorescenza (MFI) di FRET per la LL3 e cancelli LR3. Regolare il parametro FRET nella matrice di compensazione fino alla MFI del segnale FRET è equivalente tra LL3 e LR3. Dopo questo passo, l&#39;MFI del segnale FRET è uguale tra le cellule e le cellule non colorate CFP-positive, suggerendo l&#39;assenza di PCP spillover nel canale FRET. </li><li> Fare un YFP-A vs CFP-Una trama bivariate, e applicare porta P2, come descritto al punto 6.3. Disegna quadranti (LL4 e LR4) simile a quella fatta nel passaggio 6.4.3. </li><li> Creare una tabella delle statistiche che visualizza la MFI di YFP per LL4 e LR4. Regolare il parametro YFP nella matrice di compensazione fino alla MFI del segnale YFP è equivalente tra LL4 e LR4. Dopo questo passo, l&#39;MFI di un segnale YFP è uguale tra le cellule e le cellule non colorate CFP-positive, suggerendo l&#39;assenza di PCP spillover nel canale YFP. </li></ol></li><li> Folla causa di configurazione porta e la compensazione, evidenziare pozzi di interesse ed eseguire il resto del piatto. </li><li> Dopo che tutti i campioni sono stati eseguiti, i file di dati di esportazione facendo clic su &#39;file&#39;, quindi &#39;copia&#39;. Selezionare la scheda &#39;file di dati &quot;, evidenziare la cartella esperimento, e fare clic su&#39; copia &#39;. </li></ol> Analisi 7. I dati NOTA: i parametri degli assi cambiamento su singoli appezzamenti bivariati facendo clic sul titolo sulla X o Y e selezionare il filtro appropriato. <ol><li> Aprire i file FCS nella citometria a flusso programma di analisi. </li><li> In base alle proprietà di dispersione, utilizzare una porta poligonale per definire la popolazione cellulare (SSC vs FSC) e la popolazione singoletto (FSC-H vs FSC-A) da cellule trattate con liposomi vuoti, simile a quella descritta nella sezione 6. </li><li> Se la compensazione PCP è stato eseguito durante l&#39;installazione, non regolare ulteriormente PCP. </li><li> Creare una FRET vs YFP bivariata trama. Utilizzando linea cellulare # 3, Definire un cancello FRET falso disegnando un cancello poligonale che corre lungo il pendio della popolazione di cellule FRET-positivo. Questa porta esclude YFP singole cellule positive che emettono un segnale all&#39;interno del filtro FRET, ed è attratto simile a quello precedentemente indicato, vietando et al. 22 </li><li> Definire un cancello FRET tracciando cellule CFP / YFP liposomi trattati vuote su una FRET vs. PCP bivariata trama. Introdurre un cancello poligonale lungo il pendio della popolazione che si estende verso l&#39;alto e verso sinistra dalla popolazione. Questa porta deve escludere maggior parte delle cellule (~ 99%), in modo tale che sfondo FRET è ≥1% delle cellule. Tutti gli eventi che spostano in questa porta sono considerate FRET-positivo. NOTA: Ogni individuo porta sopra descritto si applica a tutti i campioni prima di costruire porte successive. A seguito di analisi, quattro porte individuali sono definiti (popolazione cellulare; singoletto, falso FRET, FRET). </li><li> Parametri di analisi record di interesse, tra cui: cento FRET positività e MFIdi cellule FRET-positive. Calcolare manualmente la densità FRET integrata misurando il prodotto della percentuale di positività e di MFI. NOTA: Se la densità FRET integrato viene utilizzato come misura di esito, impostare sfondo FRET (come definito al punto 7.5) e MFI maggiore o uguale a 1 per evitare il calcolo di un prodotto che è inferiore rispetto ai suoi due fattori individuali. </li></ol>

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<li>Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Features+of+Tau+Fibrils+from+Alzheimer%27s+Disease+Brain+Are+Faithfully+Propagated+by+Unmodified+Recombinant+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational Features of Tau Fibrils from Alzheimer's Disease Brain Are Faithfully Propagated by Unmodified Recombinant Protein.</a> Biochemistry. , (2013).</li>
<li>Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+aggregation+assays+using+hyperphosphorylated+tau+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein.</a> J Vis Exp. (95), e51537(2015).</li>
</ol>

Questo test è stato concesso in licenza a Janssen Pharmaceuticals.

Il sistema FRET citometria a flusso qui descritto è un potente strumento per valutare in modo rapido e quantitativamente l&#39;attività tau seeding. Si richiede solo moderato esperienza coltura cellulare e una conoscenza di FRET e citometria a flusso. Altri saggi semina, come Thioflavin T - che espone migliorata fluorescenza quando si lega alla struttura foglietto beta - sono laboriosi e richiedono un puro, substrato proteina ricombinante. Inoltre, i test in vitro per la semina in tau sono solo semi-qu...

L&#39;accumulo di tau intracellulare amiloidi definisce tauopatie come il morbo di Alzheimer. Nelle fasi iniziali della malattia, la patologia è generalmente localizzata alle regioni discrete del cervello, ma con la progressione della malattia, la patologia si diffonde sempre lungo le reti neurali distinte 1-5. Accumulare evidenza suggerisce transcellulare propagazione di aggregati proteici tossici alla base di questa patologia (rivisto in 6-10). In questo modello, i semi proteopathic (ad esempio, tau) vengono rilasciati dalle cellule del donatore e entrano nelle cellule vicine, trasformando proteina tau nativo nella forma misfolded via su modelli cambiamento conformazionale 11-15. Il test qui descritto è stato sviluppato per rilevare sensibilmente tale attività semina. E &#39;compatibile con proteina ricombinante e campioni biologici e consente una quantificazione dei livelli di attività di seeding proteopathic 16 minuti. Cellule HEK 293T che esprimono stabilmente tau ripetizione dOMain (RD) contenente il P301S mutazione associata a malattia fuso a uno CFP o YFP (di seguito indicato come cellule tau-RD-CFP / YFP) servire come biosensore stabile di attività di seeding. In assenza di semi proteopathic, le cellule mantenere tau come monomero solubile, e non hanno sfondo apprezzabile FRET. Assorbimento spontanea o liposomi mediata trasduzione di semi tau nelle cellule, però, si traduce in RD-CFP e aggregazione RD-YFP, che produce un segnale FRET che si misura all&#39;interno delle cellule singole tramite citometria a flusso. Numerosi componenti di questo test sono stati progettati per migliorare la sensibilità e ridurre la variabilità. Una linea di cellule monoclonale con un rapporto di 1: espressione RD-CFP / YFP 1 è stato scelto, in quanto fornisce il segnale ottimale: il rumore. Per aumentare la sensibilità, fosfolipidi vengono utilizzati per introdurre semi direttamente in cellule (anche per studiare i meccanismi biologici di assorbimento, questo può essere omesso). Infine, citometria a flusso monitor FRET a livello di popolazione e una singola cella<html> livello, a differenza di altre metodiche di aggregazione delle proteine. La misura di esito finale, densità FRET integrata, è altamente quantitativa e spiegherebbe sia il numero di cellule con aggregazione, e il grado in cui si è verificato l&#39;aggregazione all&#39;interno di ogni cella. Tutti questi parametri ottimizzati migliorare la sensibilità e garantire la riproducibilità. Questo sistema è stato recentemente impiegato in uno studio completo in transgenici P301S topi taupatia 17 che ha valutato l&#39;insorgenza e la progressione temporale di attività di seeding tau rispetto ad altri marker patologici tau comunemente usati (per esempio, MC1, AT8, PG5 e ThioflavinS). Attività di seeding è di gran lunga il marcatore prima e più robusto di tau patologia valutato, precedente rilevazione istologica di almeno 6 settimane. Attività di seeding appare a 1,5 mesi e aumenta progressivamente con l&#39;età, suggerendo un ruolo causale di semi proteopathic nell&#39;insorgenza e / o la progressione della neurodegenerazione 16. e_content &quot;&gt; quantificazione precisa dei livelli di materiale di seme da campioni biologici minuti può facilitare gli studi che monitorano la progressione della malattia precoce. Accorciando la durata di prova e consentendo l&#39;uso di animali più giovani, ciò potrebbe aumentare l&#39;efficienza e l&#39;accuratezza delle prove sugli animali preclinici. Ad esempio, in il mouse P301S precedentemente descritto, composti di piombo potrebbero essere consegnati già nel 4-6 settimane (immediatamente prima, o inizio dell&#39;attività seeding), e monitorati per l&#39;efficacia 2-4 settimane più tardi. Il dosaggio deve quantificare con precisione eventuali riduzioni di semina attività. FRET citometria a flusso è possibile testare rapidamente in vitro applicazioni di screening così. Ad esempio, reagenti anti-tau (ad esempio, anticorpi, molecole di piccole dimensioni, etc.) per la loro capacità di bloccare la semina di induzione direttamente in coltura, utilizzando tau ricombinante aggregati o lisati cervello-derivato come una fonte di semi (Figura 5). Con questa impostazione, una volta che il materiale seme è preparato, un exsperi- dura solo tre giorni per completare, compresa l&#39;analisi dei dati. La rapida quantificazione dell&#39;attività seeding proteopathic può quindi facilitare molti studi di neurodegenerazione.

<table><tbody><tr><td>TBS</td><td>Sigma</td><td>T5912</td><td></td></tr><tr><td>Inibitori completi della proteasi (senza EDTA)</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-fiale</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.006</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia analitica</td><td>Mettler Toledo</td><td>XSE 105DU</td><td></td></tr><tr><td>Barche di pesatura</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-735-743</td><td></td></tr><tr><td>tubo conico da 15 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1475-0501</td><td></td></tr><tr><td>Omogeneizzatore ad ultrasuoni Omni Sonic Ruptor</td><td>Omni International</td><td>18-000-115</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Tip per omogeneizzatore ad ultrasuoni</td><td>Omni International</td><td>OR-T-156</td><td></td></tr><tr><td>2-propanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451</td><td></td></tr><tr><td>Cuffie per le orecchie con cancellazione del rumore</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-145-412</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47299</td><td></td></tr><tr><td>Provette da 1,5 ml</td><td>USA Scientific</td><td><a href="http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-sterile.aspx">1615-5510</a></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.215</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche da 50 ml</td><td>Phenix Research</td><td>SS-PH15</td><td></td></tr><tr><td>Resevoir reagenti da 25 ml</td><td>VWR</td><td>41428-954</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta multicanale</td><td>Fisher Scientific</td><td>TI13-690-049</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a fondo piatto a 96 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>96 piastre a fondo rotondo</td><td>Corning</td><td>3788</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldeide</td><td>Microscopia Elettronica</td><td>Scienze RT 15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2SS</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga Sorvall ST 40</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004509</td><td></td></tr><tr><td>BIOLiner Rotore a secchio oscillante</td><td>Thermo Scientific</td><td>75003796</td><td></td></tr><tr><td>Ematocitometro</td><td>VWR</td><td>15170-172</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant VYB Flow Cytomter</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-116</td><td></td></tr><tr><td>Chill 96 Rack</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-459</td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi Flow Jo</td><td>Flow Jo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; l puntali per pipette</td><td>Rainin</td><td>GPS-L10</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l puntali per pipette</td><td>Rainin</td><td>GPS-250</td><td></td></tr><tr><td>1 ml puntali per pipette</td><td>Rainin</td><td>GPS-1000</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l pipette</td><td>USA Scientific</td><td>1111-1800</td><td></td></tr><tr><td>pipetta sierologica da 5 ml</td><td>Phenix Research</td><td>SPG-606180</td><td></td></tr><tr><td>pipetta sierologica da 10 ml</td><td>Phenix Research</td><td>SPG-607180</td><td></td></tr><tr><td>pipetta sierologica da 25 ml</td><td>Phenix Research</td><td>SPG-760180</td><td></td></tr></tbody></table>

rilevazione sensibile di proteopathic semina attività con fret citometria a flusso

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Prove crescenti supportano la propagazione transcellulare di aggregati proteici tossici, o semi proteopatici, come meccanismo per l'inizio e la progressione della patologia in diverse malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Alzheimer e le tauopatie correlate. Il ruolo potenzialmente critico dei semi di tau nella progressione della malattia supporta fortemente la necessità di un test sensibile che rilevi prontamente l'attività di semina nei campioni biologici. 
Combinando la specificità del trasferimento di energia per risonanza di fluorescenza (FRET), la sensibilità della citometria a flusso e la stabilità di una linea cellulare monoclonale, è stato progettato un saggio di semina ultrasensibile compatibile con la rilevazione di semi da campioni ricombinanti o biologici, inclusi omogeneizzati cerebrali umani e di topo. Il test impiega cellule monoclonali HEK 293T che esprimono stabilmente il dominio di ripetizione (RD) della tau soggetto ad aggregazione che ospita la mutazione P301S associata alla malattia fusa con CFP o YFP, che producono un segnale FRET dopo l'aggregazione proteica. L'assorbimento di semi proteopatici di tau (ma non di altre proteine) nelle cellule biosensore stimola l'aggregazione di RD-CFP e RD-YFP e la citometria a flusso monitora in modo sensibile e quantitativo questo FRET indotto dall'aggregazione. Il test rileva le concentrazioni femtomolari (monomero equivalente) di semi di tau ricombinanti, ha una gamma dinamica che si estende su tre ordini di grandezza ed è compatibile con gli omogenati cerebrali di topi transgenici taupatici e soggetti con taupatia umana. Con lievi modifiche, il test può anche rilevare l'attività di semina di altri semi proteopatici, come la α-sinucleina, ed è anche compatibile con le colture neuronali primarie. La facilità, la sensibilità e l'ampia applicabilità della citometria a flusso FRET la rendono utile per lo studio di un'ampia gamma di disturbi dell'aggregazione proteica.

FRET citometria a flusso consente sensibile, quantitativa, e la rapida individuazione di attività semina da campioni ricombinanti o biologici. Messa a punto del test è facile: le linee cellulari stabili monoclonali-derivati ​​che esprimono tau-RD-CFP / YFP sono trasdotte con materiale di seme, incubate per 24-48 ore, e sottoposti ad analisi di citometria di flusso (Figura 1A). In assenza di semi, cellule biosensori mantengono tau in un solubile, forma monomerica (Figura 1B). In presenza...

Il trasferimento da cellula a cellula di aggregati proteici, o semi proteopatici, può essere alla base della progressione della patologia nelle malattie neurodegenerative. In questo articolo, viene descritto un nuovo test di citometria a flusso FRET che consente di rilevare in modo specifico e sensibile l'attività di semina da campioni ricombinanti o biologici.

Rilevazione sensibile di Proteopathic Semina attività con FRET Citometria a flusso

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare l'attività di semina protopatica da fonti ricombinanti o biologiche, consentendo il rilevamento sensibile di proteine, aggregati e di un campione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della neurodegenerazione. Ad esempio, come possiamo valutare quantitativamente i cambiamenti nell'attività di semina a seguito di un intervento terapeutico in modelli animali di malattia?I vantaggi di questa tecnica comprendono l'elevata specificità nei confronti di basse concentrazioni di aggregati proteici. La sua straordinaria specificità, la semplicità d'uso e l'elevata produttività. A dimostrare questa procedura oggi sarò io, insieme al coautore Brandon Holmes.Per preparare il materiale biologico di partenza, iniziare pesando il tessuto cerebrale congelato in un contenitore monouso. Quindi trasferire il tessuto in un tubo conico e aggiungere il buffer di omogeneizzazione freddo di ghiaccio, in modo che la soluzione finale sia al 10% rispetto al volume, e trasferire i campioni in una stanza fredda su ghiaccio. Successivamente, regolare un ago in modo che l'indicatore sia impostato sui valori appropriati e risciacquare i lati e la parte inferiore dell'ago.Quindi agitare l'indicatore tre volte come indicato, asciugando la sonda tra ogni soluzione. Quando la sonda è pronta, immergere la punta nel buffer di omogeneizzazione di un campione e avviare la sonicazione erogando 25 impulsi in totale. Quando il tessuto è completamente in sospensione, centrifugare l'omogenato e trasferire il sopranatante in una provetta pulita.Avendo cura di non disturbare il palato. Sebbene siano disponibili numerose altre tecniche di omogeneizzazione, la prova è superiore per l'isolamento di piccole quantità di semi protio patici da campioni biologici. La dissociazione meccanica permette una degradazione del tessuto costante ed efficiente e il conseguente recupero dei semi. Quindi aliquotare il soprannatante e conservare i lisati a meno 80 gradi Celsius. Per riprendere la coltura delle cellule biosensore in condizioni sterili, risciacquare ogni linea cellulare con PBS caldo seguito da un'incubazione di tre minuti con tripsina EDTA. Quando le cellule si sono staccate, arrestare la reazione con mezzo di coltura caldo e trasferire immediatamente le cellule in un tubo conico.Centrifugare le cellule in sospensione, risospendendo il pellet in mezzo fresco. Quindi contare le cellule e preparare una diluizione master mix di 3.500.000 cellule per 13 millilitri di mezzo. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire lentamente 130 microlitri di cellule in ciascun pozzetto di una piastra tissutale a 96 pozzetti con fondo piatto, avendo cura di posizionare le punte della pipetta al centro dei pozzetti senza toccare il fondo della piastra.Dopo aver seminato le cellule, lasciarle stabilizzare indisturbate per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi incubare la piastra tutta la notte a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e umidità relativa maggiore o uguale all'80%. Il giorno successivo, quando le cellule del biosensore raggiungono una confluenza del 60-65%, combinare il mezzo a siero ridotto, il reagente a base di liposomi e la fonte biologica del materiale da seminare per formare i complessi di trasduzione. Quindi, aggiungere delicatamente con pipetta 20 microlitri di complesso di trasduzione lungo il bordo di ciascun pozzetto contenente le cellule del biosensore e reinserire le cellule trattate nell'incubatore per ulteriori 24-48 ore prima del raccolto.Le cellule non trattate mostreranno solo una fluorescenza diffusa. Tuttavia, le cellule trattate con materiale seme di tau mostreranno aggregati brillanti. Dopo uno o due giorni, raccogliere le cellule sostituendo il mezzo di coltura con 50 microlitri di tripsina EDTA, interrompendo così la reazione. Dopo cinque minuti, aggiungere 150 microlitri di mezzo di coltura freddo, trasferire immediatamente le cellule in una piastra a 96 pozzetti con fondo rotondo e centrifugare per formare il pellet. Aspirare i supernatanti senza disturbare i pellet, quindi risospendere delicatamente ma accuratamente le cellule in 50 microlitri di paraformaldeide al 2% per 10 minuti.Quindi centrifugare nuovamente le cellule e risospendere il pellet in 200 microlitri di tampone per citometria a flusso freddo nel più breve tempo possibile. Dopo la fissazione, posizionare la piastra su un citometro a flusso compatibile con fret e generare un grafico dell'area della scatterizzazione laterale rispetto all'area della scatterizzazione anteriore per variante. Successivamente, con la linea cellulare uno in esecuzione, regolare le tensioni della scatterizzazione laterale e di quella anteriore fino a quando la popolazione cellulare si trova nel quadrante in basso a sinistra.Quindi, utilizzando lo strumento poligono, definire la popolazione cellulare come gate P1. Creare ora un grafico di dispersione di forward scatter height rispetto a forward scatter area in funzione della variante e applicare il gate P1. Successivamente, definire le cellule singole come gate P2 e generare un istogramma ciascuno.Per i filtri C-F-P-Y-F-P e fret, applicare il gate P a due o tre istogrammi diversi, uno per ciascun filtro C-F-P-Y-F-P e filtro fret, per la compensazione. Aggiungere 30 microlitri della sospensione della linea cellulare uno a 200 microlitri della sospensione della linea cellulare due. Quindi fare clic sull'icona delle impostazioni dello strumento, seguita dalla scheda di compensazione e verificare la matrice per aprire la tabella di compensazione.Generare un grafico a dispersione dell'area del fret rispetto all'area del CFP e applicare la finestra P due. Quindi, con la linea cellulare uno e la linea cellulare due in esecuzione, fare clic sull'icona dei quadranti e tracciare i quadranti in modo che le popolazioni fluorescenti negative e positive siano separate dai due quadranti inferiori. Creare ora una tabella statistica che mostri l'intensità mediana di fluorescenza o MFI del fret per le finestre LL tre e LR tre e regolare il parametro del fret nella matrice di compensazione finché l'MFI del segnale fret non risulti approssimativamente uguale tra LL tre e LR tre.Successivamente, crea un grafico a variati di area YFP rispetto all'area CFP con quadranti. Regola il parametro YFP nella matrice di compensazione finché l'MFI del segnale YFP non è approssimativamente uguale tra i quadranti. Simile a quanto mostrato in precedenza per la citometria a flusso FRET.L'effetto primario di fuoriuscita fluorescente avviene dalla CFP emessa nel canale di rilevamento FRET, che può essere corretto mediante compensazione della fluorescenza utilizzando cellule di controllo positive monocromatiche. Una volta impostati tutti i gate e compensato il segnale CFP, evidenziare le pozzette di interesse ed eseguire l'analisi delle rimanenti pozzette della piastra. Per prima cosa, definire le cellule e le singole cellule utilizzando gli stessi parametri impostati per l'analisi in citofluorimetria.Successivamente, utilizzando la linea cellulare tre, tracciare le cellule singolarmente positive per YFP in un grafico di tipo fret contro YFP in funzione della variante. Disegnare una regione poligonale che segue e si allontana dalla pendenza della popolazione di cellule positive al fret per definire una regione falsa di fret, che esclude il fuoriuscire di segnale di YFP nel filtro del fret. Dopo aver applicato la regione falsa di fret a tutti i campioni, tracciare le cellule C-F-P-Y-F-P trattate con liposomi vuoti in un grafico di tipo fret contro CFP in funzione della variante e tracciare una regione poligonale lungo la pendenza della popolazione, estendendola verso l'alto e verso sinistra rispetto alla popolazione.Tutti gli eventi che entrano in questa finestra sono considerati positivi al fret e la percentuale di cellule corrisponderà al titolo del seme utilizzato durante il trattamento. Infine, registrare i parametri di analisi di interesse, inclusa la percentuale di positività al fret e l'intensità mediana della fluorescenza delle cellule positive al fret. Quindi misurare il prodotto tra la percentuale di positività e l'MFI per calcolare manualmente la densità integrata del fret.In assenza di aggregati o semi di tau, la proteina tau viene mantenuta in uno stato monomerico solubile, rappresentato da un segnale fluorescente diffuso costante e negativo al test fret. Dopo l'introduzione di semi di tau nelle cellule biosensore, la tau endogena viene convertita in uno stato aggregato e positivo al test fret, che permette la quantificazione tramite fret. L'analisi mediante citometria a flusso conferma che concentrazioni nell'ordine dei femtomoli di tau ricombinante sono sufficienti per il rilevamento. Qui.Il tessuto del tronco encefalico di topi con tauopatia sacrificati a diverse età rappresenta una regione cerebrale dimostrativa di un rilevamento costante dell'attività di semina negli animali già all'età di 1,5 mesi. In questo esperimento, gli omogenati cerebrali di soggetti affetti da malattia di Alzheimer hanno mostrato una marcata attività di semina, mentre soggetti controllo di età comparabile e soggetti con malattia di Huntington non hanno dimostrato specificità del saggio verso gli aggregati di tau. Colture primarie di neuroni non trattati, trasdotti con costrutti lentivirali di tau-CFP e tau-YFP, hanno mostrato un segnale fluorescente diffuso dopo il trattamento con semi ricombinanti di tau.Tuttavia, la tau endogena forma grandi aggregati rilevabili mediante citometria a flusso FRET anche in assenza di trasduzione mediata da liposomi. Quando le fonti di semi vengono pre-incubate con farmaci che inibiscono l'assorbimento della tau, come l'eparina, e trattate in assenza di liposomi, l'attività di semina contenuta sia nei campioni ricombinanti di fis che nei campioni cerebrali di topi con tauopatia può essere bloccata. Una volta padroneggiato.Questa tecnica può essere completata in tre giorni, con ogni giorno che richiede solo da una a due ore di lavoro al banco. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che sarà necessaria un'ottimizzazione interna per determinati passaggi. Ad esempio, quando si determinano i titoli efficaci da semi protio patogeni provenienti da diverse fonti biologiche.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impostare, eseguire e analizzare esperimenti di citometria a flusso FRET per rilevare l'attività di semina protopatica da fonti ricombinanti e biologiche.

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