Rilevazione sensibile di Proteopathic Semina attività con FRET Citometria a flusso

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare l'attività di semina protio-patica da fonti ricombinanti o biologiche, consentendo la rilevazione sensibile di proteine, aggregati e un campione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurodegenerazione. Ad esempio, come potremmo valutare quantitativamente i cambiamenti nell'attività di semina a seguito di un intervento terapeutico in modelli animali di malattia?

I vantaggi di questa tecnica includono la sua elevata specificità verso bassi livelli di aggregati proteici. La sua squisita specificità, la sua facilità d'uso e la sua elevata produttività. A dimostrare questa procedura oggi sarò io, insieme al co-autore Brandon Holmes.

Per preparare il materiale biologico del seme, inizia pesando il tessuto cerebrale congelato in una barca di siero di latte usa e getta. Quindi trasferire il tessuto in una provetta conica, aggiungere un tampone di omogeneizzazione ghiacciato, in modo tale che la soluzione finale sia del 10% per attendere il volume e trasferire i campioni in una cella frigorifera su ghiaccio. Quindi, regolare un indicatore della sonda sulle impostazioni appropriate e risciacquare il lato e il fondo della sonda.

Quindi l'indicatore si ribalta tre volte come indicato, pulendo la sonda tra ogni soluzione. Quando la sonda è pronta, immergere la punta nel tampone di omogeneizzazione di un campione e avviare la sonicazione erogando 25 impulsi totali. Quando il tessuto è completamente in sospensione, centrifugare l'omogeneizzato e trasferire il supinato in una provetta pulita.

Facendo attenzione a non disturbare il palato. Sebbene siano disponibili numerose altre tecniche di omogeneizzazione, la probazione è superiore per isolare piccole quantità di semi protiopatici da campioni biologici. La dissociazione meccanica consente una scomposizione coerente ed efficiente del tessuto e la successiva estrazione del seme.

Quindi aliquotare il supino e conservare i lisati a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Per riprodurre le cellule biosensore in condizioni sterili, sciacquare ogni linea cellulare con PBS caldo seguito da un'incubazione di tre minuti con tripsina EDTA. Quando le cellule si sono staccate, interrompere la reazione con il terreno di coltura caldo e trasferire immediatamente le cellule in una provetta conica.

Centrifugare le celle di rianimazione, sospendendo il pellet in terreno fresco. Quindi contare le cellule ed effettuare una diluizione di 3.500.000 cellule per 13 millilitri di terreno. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire lentamente 130 microlitri di cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti trattata con coltura tissutale a fondo piatto, avendo cura di posizionare i puntali della pipetta al centro dei pozzetti senza toccare il fondo della piastra.

Una volta che le cellule sono state piastrate, lasciarle riposare indisturbate per 10 minuti a temperatura ambiente e poi incubare la piastra per una notte a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e maggiore o uguale all'80% di umidità relativa. Il giorno successivo, quando le cellule biosensore sono confluenti al 60-65%, combinare il reagente liposomico del mezzo sierico ridotto e la fonte di semi biologici per creare complessi di trasduzione. Quindi pipettare 20 microlitri di complesso di trasduzione lungo il lato di ogni singolo pozzetto del biosensore e rimettere le cellule trattate nell'incubatore per altre 24-48 ore prima della raccolta.

Le cellule non trattate mostreranno solo fluorescenza diffusa. Tuttavia, le cellule trattate con materiale di semi tau mostreranno aggregati luminosi Dopo uno o due giorni per raccogliere le cellule, sostituire il terreno di coltura cellulare con 50 microlitri di tryin EDTA, interrompendo la reazione. Dopo cinque minuti con 150 microlitri di coltura refrigerata, media, trasferire immediatamente le cellule su una piastra inferiore rotonda da 96 pozzetti e pellettare le cellule, aspirare i surnatanti S senza disturbare i pellet, quindi delicatamente ma accuratamente risuss, sospendere le cellule in 50 microlitri di paraldeide al 2% per 10 minuti.

Quindi far girare nuovamente le cellule e risospendere i pellet in 200 microlitri di tampone per citometria a flusso raffreddato il prima possibile. Dopo il fissaggio, caricare la piastra su un citometro a flusso compatibile con i tasti e generare un'area di dispersione laterale rispetto all'area di dispersione diretta mediante grafico variante. Quindi, con la linea cellulare uno in esecuzione, regolare una dispersione laterale e le tensioni di dispersione diretta fino a quando la popolazione cellulare non si trova nel quadrante inferiore sinistro.

Quindi, utilizzando lo strumento poligono, definisci la popolazione cellulare come andatura P uno. Ora crea un'altezza di dispersione in avanti rispetto all'area di dispersione in avanti tramite grafico variante e applica la porta P one. Successivamente, definisci le singole celle come andatura P due e genera un istogramma ciascuna.

Per i filtri C-F-P-Y-F-P e fret, applicare al gate P due o tre istogrammi diversi, uno ciascuno per C-F-P-Y-F-P e i filtri fret per la compensazione. Spike in 30 microlitri della linea cellulare una sospensione in 200 microlitri della linea cellulare due sospensione. Quindi fare clic sull'icona delle impostazioni dello strumento seguita dalla scheda di compensazione e controllare la matrice per aprire la tabella di compensazione.

Generare un'area dei tasti rispetto all'area CFP mediante un grafico variato e applicare il gate P due. Quindi, con la linea cellulare uno e la linea cellulare due in esecuzione, fare clic sull'icona del quadrante e disegnare quadranti in modo tale che le popolazioni fluorescenti negative e positive siano separate dai due quadranti inferiori. Ora crea una tabella statistica che mostri l'intensità di fluorescenza mediana o MFI del tasto per le porte LL tre e LR tre e regola il parametro del tasto nella matrice di compensazione fino a quando l'MFI del segnale del tasto è approssimativamente uguale tra LL tre e LR tre.

Quindi, crea un'area YFP rispetto all'area CFP mediante grafico variato con quadranti. Regolare il parametro YFP nella matrice di compensazione fino a quando l'MFI del segnale YFP è approssimativamente uguale tra i quadranti. Simile a quello mostrato in precedenza per la citometria a flusso di fret.

Lo spillover fluorescente primario si verifica dalla CFP emessa nel canale di rilevamento dei tasti, che può essere corretto tramite la compensazione della fluorescenza utilizzando le celle di controllo positive a colore singolo Quando tutti i gate sono stati impostati e il segnale CFP è stato compensato. Evidenzia i pozzetti di interesse ed esegui il resto della piastra per analizzare i dati. Innanzitutto, definisci le celle e le singole celle utilizzando gli stessi parametri con cui stiamo impostando l'analisi del flusso.

Successivamente, utilizzando la linea cellulare tre, tracciare le singole celle positive YFP in un fret rispetto a YFP per grafico variante. Disegna un gate poligonale che corre lungo e lontano dalla pendenza della popolazione cellulare positiva per definire una falsa andatura dei tasti, che esclude lo spillover YFP nel filtro dei tasti. Dopo aver applicato l'andatura a falso tasto a tutti i campioni, tracciare le cellule C-F-P-Y-F-P trattate con liposoma vuoto su un grafico fret versus CFP per variata e introdurre un ga poligonale lungo la pendenza della popolazione che si estende verso l'alto e verso sinistra lontano dalla popolazione.

Tutti gli eventi che si spostano in questo cancello sono considerati fret positivi e la percentuale di cellule sarà correlata al titolo del seme utilizzato durante il trattamento. Infine, registrare i parametri di analisi di interesse, tra cui la percentuale di positività dei tasti e l'intensità mediana della fluorescenza delle celle dei tasti positivi. Quindi misura il prodotto della percentuale di positività e dell'MFI per calcolare manualmente la densità dei tasti integrata.

In assenza di aggregati o semi di tau, la tau viene mantenuta in uno stato monomerico solubile, come rappresentato da un segnale fluorescente diffuso e negativo ai tasti. Dopo l'introduzione dei semi di tau nelle cellule biosensore, la tau endogena viene convertita in una quantificazione FRET di stato aggregato e FRET. La successiva analisi della citometria a flusso conferma che le concentrazioni femtomolari di tau ricombinante sono sufficienti per la rilevazione. Qui.

Il tessuto del tronco encefalico di topi taupatici sacrificati a diverse età, funge da regione cerebrale rappresentativa dimostrando un rilevamento coerente dell'attività di semina negli animali già a 1,5 mesi di età. In questo esperimento, i soggetti con malattia di Alzheimer omogenei al cervello hanno mostrato una robusta attività di semina, mentre i soggetti con controllo di pari età e malattia di Huntington non hanno dimostrato la specificità del test per aggregare tau colture neuronali primarie non trattate trasdotte con tau, CFP e tau. I costrutti lentivirali YFP hanno mostrato un segnale fluorescente diffuso dopo il trattamento con semi di tau ricombinanti.

Tuttavia, la tau endogena forma grandi aggregati rilevabili mediante citometria a flusso di fret anche in assenza di trasduzione mediata da liposomi. Quando le fonti di semi sono pre-incubate con farmaci che inibiscono l'assorbimento della tau come l'eparina e sono trattate in assenza di liposomi, l'attività di semina contenuta nei campioni di cervello di topo ricombinante fis e taupatia può essere bloccata. Una volta padroneggiato.

Questa tecnica può essere completata in tre giorni con ogni giorno solo una o due ore di lavoro al banco. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare che per alcuni passaggi sarà necessaria un'ottimizzazione interna. Ad esempio, quando si determinano titoli efficaci da semi di protio patici provenienti da varie fonti biologiche.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impostare, eseguire e analizzare esperimenti di citometria a flusso di fret allo scopo di rilevare l'attività di semina protio patica da fonti ricombinanti e biologiche.