Immunolocalizzazione della membrana esterna proteine ​​mediante citometria di flusso di mitocondri isolati

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di immunomarcare le proteine di interesse sulla membrana mitocondriale dell'ER con un anticorpo a scelta e analizzarle in concomitanza con la funzione mitocondriale. Ciò si ottiene raccogliendo prima il tessuto di interesse come il cervello, il midollo spinale o il fegato da un ratto. Il secondo passo consiste nell'isolare i mitocondri dal tessuto, in questo caso il midollo spinale.

Il midollo spinale viene omogeneizzato con una danza. L'omogeneizzatore e altri organelli e detriti cellulari vengono rimossi attraverso una serie di fasi di centrifugazione fino a raggiungere un palato mitocondriale grezzo: la mielina, un importante contaminante del tessuto nervoso centrale, viene rimossa mescolando i mitocondri con una soluzione di opti prep al 12% e centrifusion ancora una volta. Successivamente, i mitocondri isolati vengono marcati con un anticorpo primario di scelta, seguito da un anticorpo secondario coniugato a un Fluor.

Il passaggio finale consiste nell'aggiungere coloranti fluorescenti per confermare l'identità mitocondriale o meglio i parametri funzionali. In definitiva, la citometria a flusso viene utilizzata per mostrare l'abbondanza relativa delle membrane mitocondriali dell'alto durante la normale fisiologia o malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la microscopia è che consente un'elevata produttività e una rapida quantificazione di migliaia di singoli mitocondri.

Gli animali utilizzati in questo studio sono stati trattati in stretta conformità con un protocollo approvato dal Comitato istituzionale C-R-C-H-U-M per la protezione degli animali, che segue gli standard nazionali come delineato dal Canadian Council on Animal Care Air. Per iniziare questa procedura, posizionare un intero midollo spinale intatto che è stato raccolto da un ratto in un omogeneizzatore di vetro da cinque millilitri contenente cinque volumi di tampone di omogeneizzazione. Posizionare l'omogeneizzatore di vetro sul ghiaccio e omogeneizzare il tessuto a mano fino a quando non rimangono pezzi di tessuto più grandi, il che richiederà circa otto colpi.

Trasferire l'omogeneizzato in due o tre provette per microcentrifuga e centrifugare a 1.300 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius utilizzando la successiva pipetta Il surnatante S in una provetta per ultracentrifuga da cinque millilitri. Aggiungere 750 microlitri di tampone di omogeneizzazione al pellet e risospendere delicatamente il pellet. Quindi centrifugare la sospensione e risospendere il pellet.

Altre due volte per rimuovere piccoli detriti, tirare tutti i surnatanti nella stessa provetta da ultracentrifuga da cinque millilitri, quindi posizionare le provette in un rotore per ultracentrifuga. Dotato di secchi oscillanti, centrifugare le provette a 17.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine della centrifugazione, conservare il surnatante per un'ulteriore lavorazione se la frazione citosolica è di interesse.

Successivamente, sospendere il pellet, che è la frazione mitocondriale grezza in quattro millilitri di tampone di omogeneizzazione contenente centrifuga di cloruro di potassio da 50 millimolari. Il pellet risospeso a 17.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius in un rotore a secchiello oscillante, quindi scartare il supinato e risospendere delicatamente il pellet in 800 microlitri di tampone di omogeneizzazione in una nuova provetta per ultracentrifuga da cinque millilitri a esattamente 800 microlitri di pellet risospeso. Pipettare quindi 200 microlitri di iod dal negli 800 microlitri del pellet risospeso per creare una concentrazione finale del 12% iod Dal.

Mescolare delicatamente ma accuratamente il contenuto della provetta con una pipetta P 1000, quindi centrifugare a 17.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius in un rotore a secchiello oscillante, aspirare lo strato di mielina nella parte superiore della provetta e gettare accuratamente la supinata poiché la tavolozza potrebbe essere allentata. Resus sospendere il pellet in quattro millilitri di tampone di omogeneizzazione. Quindi centrifuga il tuo guadagno a 17.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius in un rotore a secchiello oscillante.

Scartare il supinato e risus. Sospendere il pellet in quattro millilitri di tampone di omogeneizzazione. Quindi ripetere nuovamente la centrifugazione e rimuovere l'agente supino reus.

Piegare il pellet finale in 100-200 microlitri di tampone di omogeneizzazione e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga da 1,7 millilitri. Determinare la quantità di proteine in ciascun campione utilizzando un test standard di quantificazione delle proteine, come il test dell'acido bionico o BCA. Quando si preparano i campioni per la quantificazione, diluire i campioni e la curva standard in solfato di sodio al 2% per garantire un'adeguata solubilizzazione dei mitocondri.

Per ogni miscela colorante da testare, pipettare 25 microgrammi di mitocondri isolati in una provetta da 1,7 millilitri per microcentri. Assicurarsi di includere un campione non colorato in ogni esperimento, nonché un controllo isotipico appropriato per ogni anticorpo testato, centrifugare ogni campione a 17.000 volte G per due minuti a quattro gradi Celsius in una microcentrifuga da banco. Quindi rimuovere il supinato e risospendere i mitocondri isolati in 50 microlitri di tampone mitocondriale.

Integrato con BSA privo di acidi grassi al 10%, incubare la soluzione per 15 minuti a quattro gradi Celsius, quindi aggiungere 20 microgrammi di anticorpo primario per millilitro di soluzione. Incubare i mitocondri isolati con l'anticorpo primario per 30 minuti a quattro gradi Celsius per eliminare l'anticorpo non legato, centrifugare ogni campione ed eliminare il natante supino. Quindi, risospendere delicatamente il pellet in 200 microlitri di tampone mitocondriale, quindi ripetere la fase di centrifugazione, scartare il natante supino e risospendere il pellet in 50 microlitri di tampone mitocondriale.

Aggiungere 0,5 microgrammi di anticorpo secondario per millilitro di campione. Quindi incubare i campioni per 30 minuti a quattro gradi Celsius, al riparo dalla luce. Al termine dell'incubazione, centrifugare ogni campione ed eliminare il supinato che contiene l'anticorpo secondario non legato. Reese.

Sospendere il pellet in 200 microlitri di tampone mitocondriale e centrifugare il campione. Di nuovo. Quindi rimuovere il supinato e Reese. Sospendi il pellet in 500 microlitri di tampone mitocondriale per assicurarti che gli eventi osservati siano effettivamente mitocondri.

Colorare il campione con un colorante fluorescente specifico per i mitocondri come il verde tracker MIT di Vitrogen per 15 minuti al buio. Se non sono necessarie ulteriori colorazioni per studiare altri parametri funzionali, trasferire il campione marcato in una provetta adatta per il caricamento in un citometro a flusso. Tenere i campioni sul ghiaccio e procedere con un citometro a flusso per l'acquisizione per verificare che i mitocondri isolati abbiano un potenziale transmembrana intatto, colorare i mitocondri con 100 nanomolari di domine a barre tetraetilari estere metilico per 15 minuti a temperatura ambiente al buio come controllo per la colorazione con domino a barre tetraetile.

L'estere metilico colora i mitocondri isolati con 100 nanomolari tetraetil rod domine metil estere metilico in presenza di 100 micromolari di cianuro di carbonile m clorofenolo HydroOne. Questa sostanza chimica è una disaccoppia mitocondriale e depolarizzerà i mitocondri per verificare che i mitocondri isolati producano superossido, colorare i mitocondri con un indicatore di superossido appropriato come le mitosi calze rosse in Vitrogen per 15 minuti a temperatura ambiente al buio come controllo per la produzione di superossido mitocondriale. Permanenza nei mitocondri isolati con colorante in presenza di 10 micromolari di antimicina.

L'antimicina A è un inibitore del complesso tre della catena respiratoria e aumenta la produzione di superossido mitocondriale prima dell'inizio dell'acquisizione. Impostare lo strumento come descritto nel protocollo di testo allegato. Quindi mescolare i campioni picchiettando delicatamente il tubo, ma senza vortici.

Inizia a raccogliere gli eventi iniziali a bassa pressione durante il gating. Assicurati di controllare la popolazione totale. Quindi, regolare di conseguenza le tensioni degli istogrammi.

Il picco del campione non colorato di solito corrisponde alla seconda decade. Quindi, una volta stabiliti i cancelli e i campioni in fase di elaborazione, passare alla citometria ad alto flusso. L'analisi dei preparati del midollo spinale ha identificato che il 94% degli eventi era positivo per il colorante specifico dei mitocondri.

In questo esperimento, il 30% degli eventi positivi ai mitocondri sono stati marcati con un anticorpo specifico per la fusione 2 del MIT, che è una proteina implicata nella fusione della membrana esterna dei mitocondri. L'analisi del potenziale transmembrana mitocondriale utilizzando l'estere metilico tetraetilrumrumina ha rilevato che il 95% dei mitocondri isolati ha un potenziale transmembrana intatto. Questa colorazione si è dimostrata specifica in quanto è stata osservata una significativa diminuzione della colorazione quando eseguita in presenza di un mitocondriale non funzionale I mitocondri producono una quantità basale di ossido di SUP misurata utilizzando un colorante permeabile alla membrana.

Questo diventa una reazione P fluorescente con l'ossido di SUP. Il trattamento dei mitocondri con antimicina a determina un aumento di circa il 10% della produzione di superossido Una volta padroneggiato. Questa tecnica può essere eseguita in sei o sette ore se eseguita correttamente.