Name: Analisi delle sospensioni cellulari isolate da tessuti solidi da Spectral citometria a flusso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Impara la citometria a flusso spettrale per analizzare cellule da tessuti solidi come intestino, cuore, polmone e fegato. Questa tecnica gestisce l'autofluorescenza come parametro indipendente, permettendo l'identificazione di popolazioni cellulari rare in immunologia e biologia delle cellule staminali.

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Riconosciamo i contributi tecnici e teorici in citometria spettrale di K. Futamura, che ha anche rivisto criticamente il manoscritto. Siamo anche in debito con C. Ait-Mansour, P.-H. Commere, A. Bandeira, e P. Pereira per la lettura critica del manoscritto e per la consulenza tecnica senza fine e sostegno. Ringraziamo anche P. Pereira per il dono degli anti Vγ7-APC e Vδ4-biotina anticorpi marcati. Si ringraziano il Centre d&#39;Enseignements da Pasteur per accogliere e sostenere la logistica di ripresa. Questo lavoro è stato sostenuto dal Pasteur Institute, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM); il Fondo nazionale svizzero e Pasteur Bourse Roux (SS); Fundação para a Ciência ea Tecnologia - SFRH / BD / 74218/2010 (MV); e Université Paris Diderot, l&#39;Agence Nationale de la Recherche (ANR) del progetto Twothyme, l&#39;ANR, e il Programma REVIVE (investimento per il futuro) (AC).

<ol><li>Futamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+full-spectral+flow+cytometry+with+multiple+spectrally-adjacent+fluorescent+proteins+and+fluorochromes+and+visualization+of+in+vivo+cellular+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Novel full-spectral flow cytometry with multiple spectrally-adjacent fluorescent proteins and fluorochromes and visualization of in vivo cellular movement.</a> Cytometry A. 87 (9), 830-842 (2015).</li>
<li>Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+Cytometry+Has+Unique+Properties+Allowing+Multicolor+Analysis+of+Cell+Suspensions+Isolated+from+Solid+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Spectral Cytometry Has Unique Properties Allowing Multicolor Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues.</a> PLoS One. 11 (8), e0159961(2016).</li>
<li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+FACS+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multiparameter FACS analysis.</a> Curr Protoc Immunol. , Chapter 5, Unit 5.8, (2002).</li>
<li>Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seventeen-colour+flow+cytometry%3A+unravelling+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system.</a> Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).</li>
<li>Grigoriadou, K., Boucontet, L., Pereira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor-gamma+allele-specific+selection+of+V+gamma+1%2FV+delta+4+cells+in+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell receptor-gamma allele-specific selection of V gamma 1/V delta 4 cells in the intestinal epithelium.</a> J Immunol. 169 (7), 3736-3743 (2002).</li>
<li>Guy-Grand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin%2C+trafficking%2C+and+intraepithelial+fate+of+gut-tropic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Origin, trafficking, and intraepithelial fate of gut-tropic T cells.</a> J Exp Med. 210 (9), 1839-1854 (2013).</li>
<li>Lavoinne, A., Cauliez, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BCardiac+troponin+I+and+T%3A+specific+biomarkers+of+cardiomyocyte%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Med+Interne%22%5BJournal%5D)">[Cardiac troponin I and T: specific biomarkers of cardiomyocyte].</a> Rev Med Interne. 25 (2), 115-123 (2004).</li>
<li>Staudt, D. W., Liu, J., Thorn, K. S., Stuurman, N., Liebling, M., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+of+cardiomyocyte+behavior+reveals+two+distinct+steps+in+ventricular+trabeculation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging of cardiomyocyte behavior reveals two distinct steps in ventricular trabeculation.</a> Development. 141 (3), 585-593 (2014).</li>
<li>Beltrami, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+cardiac+stem+cells+are+multipotent+and+support+myocardial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration.</a> Cell. 114 (6), 763-776 (2003).</li>
<li>Keith, M. C., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22String+theory%22+of+c-kit%28pos%29+cardiac+cells%3A+a+new+paradigm+regarding+the+nature+of+these+cells+that+may+reconcile+apparently+discrepant+results%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">"String theory" of c-kit(pos) cardiac cells: a new paradigm regarding the nature of these cells that may reconcile apparently discrepant results.</a> Circ Res. 116 (7), 1216-1230 (2015).</li>
<li>Valente, M., Nascimento, D. S., Cumano, A., Pinto-do-Ó, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sca-1%2B+cardiac+progenitor+cells+and+heart-making%3A+a+critical+synopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Sca-1+ cardiac progenitor cells and heart-making: a critical synopsis.</a> Stem Cells Dev. 23 (19), 2263-2273 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

FCM convenzionale si basa sulla rilevazione di fotoni emessi dopo l&#39;eccitazione di sonde fluorescenti. L&#39;emissione di fluorescenza di un fluorocromo rilevato in un rivelatore progettato per misurare il segnale da un altro fluorocromo induce sovrapposizione fisica. Questo ricaduta tra spettri di emissione deve essere corretto da compensazioni. FCM spettrale e elaborazione dati dall&#39;algoritmo unmixing deconvoluzione consente la combinazione di fluorocromi con stretti picchi di emis...

Negli ultimi decenni, Citometria a flusso (FCM) è diventato un metodo analitico ampiamente disponibile essenziale per gli studi di fenotipizzazione delle cellule. V&#39;è stato un aumento sostanziale nei coloranti fluorescenti disponibili, in particolare fluorocromi eccitati dal laser viola (405 nm) (ad esempio, viola brillante e nuovi coloranti Q-dot). Tuttavia, la crescita di coloranti fluorescenti disponibili aumenta il rischio di emissioni sovrappongono e richiede matrici compensazione intensità di lavoro. FCM diventato ampiamente utilizzato per analizzare sospensioni di cellule da tessuto solido, ma la presenza di cellule auto-fluorescente limita la discriminazione delle popolazioni specificamente etichettati. I principi fondamentali della spettrale FCM sono riportati in dettaglio nel Futamura et al. 1, 2. Brevemente, la FCM spettrale qui utilizzato (vedere la tabella dei materiali) è dotato di 405, 488 e 638 nm laser. La spettrale FCM cattura tutto il f emessaLuorescenza come spettro in un array lineare a 32 canali PMT (32ch PMT) per 500 nm a 800 nm e 2 PMT indipendenti per 420 nm a 440 nm e rispettivamente da 450 a 469 nm che sostituiscono i tradizionali filtri passa-banda. I punti laser 488 e 405/638 nm sono separati spatialmente, mentre i punti laser 405 nm e 638 nm sono co-lineari. Per ogni singola particella, l&#39;FCM spettrale misura fino a 66 canali di dati di fluorescenza eccitati dai laser da 405 nm e 488 nm. Quando le cellule sono eccitate dal laser da 638 nm, l&#39;FCM spettrale misura 58 canali di dati di fluorescenza, perché viene inserita una maschera per impedire che il laser da 638 nm brilla nel PMT. FCM Spectral analizza i dati dello spettro completo acquisito con un algoritmo basato sul metodo Ponderato dei minimi quadrati (WLSM), che consente la separazione di spettri fluorescenti sovrapposti. Spectra derivata da campioni singoli macchiati e non colorati sono riconosciuti come gli spettri di base di riferimento. I campioni multi-colorati sono dotati di matematica and miscelati, e lo spettro di un campione con etichette fluorescenti misti viene scomposto in una raccolta dei suoi spettri costituente. L&#39;unmixing, nella tecnologia spettrale 3, 4, sostituisce la compensazione che rimuove il segnale da tutti i rivelatori tranne quella che misura un determinato colorante. In questo studio, abbiamo combinato e testati 19 fluorocromi in una singola analisi 21-parametro che caratterizza i principali sottoinsiemi ematopoietiche presenti nella milza mouse. Inoltre, abbiamo dimostrato che la citometria spettrale può gestire segnale auto-fluorescente, migliorando così la caratterizzazione intestinale linfociti intra-epiteliali e del cuore embrionale. Infatti, in questi tessuti, gestione auto-fluorescenza consentito per l&#39;assegnazione di fluorescenza specifica per le cellule che sarebbero esclusi dall&#39;analisi in FCM convenzionale.

<table><tbody><tr><td>Topi</td><td>Janvier Labs</td><td>CD45.2</td><td>Fonte di cellule</td></tr><tr><td>Etanolo 70%</td><td>VWR</td><td>83801.36</td><td>Sterilizzazione</td></tr><tr><td>DPBS (Ca2+, Mg2+)</td><td>GIBCO ThermoFisher</td><td>14040-174</td><td>Raccolta di embrioni</td></tr> Soluzione <tr><td>salina bilanciata di Hanks (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+)</td><td>GIBCO Life ThermoFisher</td><td>14025092</td><td>Soluzioni per dissociazione, digestione e colorazione</td></tr> Soluzione <tr><td>salina bilanciata di Hanks (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-)</td><td>GIBCO Life ThermoFisher</td><td>14175095</td><td>Soluzioni per dissociazione, digestione e colorazione</td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello (FCS)</td><td>EUROBIO</td><td>CVFSVF00-0U</td><td>Soluzioni per dissociazione, digestione e colorazione</td></tr><tr><td>Collagenasi</td><td>Sigma</td><td>C2139</td><td>Soluzione enzimatica</td></tr><tr><td>90 x 15 mm, piastre di Petri per colture di tessuti plastici.</td><td>TPP</td><td>T93100</td><td>Raccolta di embrioni e cuori</td></tr><tr><td>35 x 15 mm, piastre di Petri per colture di tessuti plastici.</td><td>TPP</td><td>T9340</td><td>Collezione Cuori</td></tr><tr><td>Forbice a iride fine</td> Strumenti per le <td>scienze Fine</td><td>14090-09</td><td>Strumenti per dissezione</td></tr><tr><td>Pinze lorde (pinze strette, curve 12 cm)</td><td>Strumenti per le scienze</td><td>11003-12</td><td>Strumenti per la dissezione</td></tr><tr><td>Pinze fini (Dumont n. 7 pinze)</td><td>Strumenti per le scienze</td><td>11272-30</td><td>Strumenti per la dissezione</td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>VWR</td><td>21909-668</td><td>Strumenti di dissezione</td></tr><tr><td>LEICA MZ6 Microscopio di dissezione</td><td>LEICA</td><td>MZ6 10445111</td><td>Campionamento; Oculare W-Pl10x/23</td></tr><tr><td>Sorgente lampada fredda</td><td>SCHOTT VWR</td><td>KL1500 compatto</td><td>Campionamento; Due fibre di collo d'oca adattate</td></tr><tr><td>a tubi FACS</td><td>VWR</td><td>60819-310</td><td>Celle di digestione</td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti (fondo tondo)</td><td>VWR</td><td>10861-564</td><td>Celle di colorazione</td></tr><tr><td>Panno di bulloneria a rete di nylon sterilizzato, pezzi da 50/50 mm.</td><td>SEFAR NITEX</td><td>SEFAR NITEX</td><td>Filtrazione cellulare</td></tr><tr><td>UltrasComp eBeads</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi marcati con fluorescenza</td><td>Biolegend</td><td>Numero di catalogo vedi tabella sottostante</td><td>Colorazione delle cellule</td></tr></tbody></table>

analisi delle sospensioni cellulari isolate da tessuti solidi da spectral citometria a flusso

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Citometria a flusso è stato utilizzato negli ultimi 40 anni per definire e analizzare il fenotipo di linfoide e di altre cellule ematopoietiche. Inizialmente limitata all&#39;analisi di alcuni fluorocromi, attualmente esistono diverse decine di coloranti fluorescenti, e fino a 14-18 diversi coloranti possono essere combinati in un momento. Tuttavia, alcune limitazioni ancora alterino le capacità analitiche. A causa della molteplicità di sonde fluorescenti, analisi dei dati è diventata sempre più complessa a causa della necessità di grandi matrici compensazione multiparametriche. Inoltre, i modelli di topo mutante che trasportano proteine ​​fluorescenti per rilevare e tracciare specifici tipi cellulari nei diversi tessuti sono diventati disponibili, quindi è necessaria l&#39;analisi (mediante citometria di flusso) di sospensioni cellulari auto-fluorescenza ottenute da organi solidi. Spectral citometria a flusso, che distingue le forme di spettri di emissione lungo un ampio intervallo di lunghezze d&#39;onda continue, affronta alcuni di questi problemi. I dati vengono analizzati with un algoritmo che sostituisce matrici di compensazione e tratta autofluorescenza come parametro indipendente. Così, spettrale citometria di flusso dovrebbe essere in grado di discriminare fluorocromi con picchi di emissione simili e può fornire un&#39;analisi multiparametrica senza esigenze di compensazione. Questo protocollo descrive il flusso spettrale analisi di citometria, consentendo un 21-parametro di caratterizzazione (19 sonde fluorescenti) e la gestione di un segnale di auto-fluorescente, fornendo alta risoluzione nel rilevamento popolazione minore. I risultati qui presentati indicano che il flusso spettrale presenta citometria vantaggi nell&#39;analisi delle popolazioni cellulari da tessuti difficili da caratterizzare in flusso convenzionale citometria, come il cuore e l&#39;intestino. Spectral citofluorimetria così dimostra la capacità di analisi multi-parametrica di gestione performante flusso convenzionale citometria senza obbligo di compensazione e consente auto-fluorescenza.

21-parametro pannello FCM spettrale per analizzare splenociti La Figura 1 mostra i risultati ottenuti con il pannello 19-fluorescente-anticorpo applicata alle cellule spleniche comprendenti diversi anticorpi che riconoscono sottoinsiemi di T, B, NK, dendritiche e cellule mieloidi, mentre CD45 etichette tutte le cellule nucleate ematopoietiche. Il pannello comprende inoltre un colorante vitalità (PI), nonché le di...

Questo articolo descrive spettrale citometria, un nuovo approccio per citometria di flusso che utilizza le forme di spettri di emissione per distinguere fluorocromi. Un algoritmo sostituisce compensazioni e può trattare auto-fluorescenza come parametro indipendente. Questo nuovo approccio permette la corretta analisi delle cellule isolate da organi solidi.

Analisi delle sospensioni cellulari isolate da tessuti solidi da Spectral citometria a flusso

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

L'obiettivo generale di questa tecnica di citometria spettrale è distinguere diversi fluorocromi utilizzando i loro interi spettri di emissione. Inoltre, questo protocollo consente l'implementazione dell'autofluorescenza come parametro indipendente, permettendo un'analisi accurata delle cellule isolate da organi solidi. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi dell'immunologia e dello sviluppo della biologia delle cellule staminali, ad esempio su come identificare popolazioni cellulari rare.Il principale vantaggio di questa tecnica è la sua capacità unica di analizzare contemporaneamente un elevato numero di parametri e di gestire l'autofluorescenza dei tessuti solidi. Sebbene questo metodo venga utilizzato per la preparazione di una sospensione di singole cellule derivata dall'intestino e dal cuore, può essere applicato anche ad altri organi, come polmone, muscolo scheletrico, fegato, tessuto adiposo e rene. Per iniziare, isolare e lavare l'intestino tenue di un topo adulto.Quindi, posizionare il tessuto su un tovagliolo di carta e, utilizzando forbici affilate, rimuovere con attenzione le placche di Peyer. Aprire l'intestino praticando un'incisi

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