Name: Analisi delle sospensioni cellulari isolate da tessuti solidi da Spectral citometria a flusso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Impara la citometria a flusso spettrale per analizzare cellule da tessuti solidi come intestino, cuore, polmone e fegato. Questa tecnica gestisce l'autofluorescenza come parametro indipendente, permettendo l'identificazione di popolazioni cellulari rare in immunologia e biologia delle cellule staminali.

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Riconosciamo i contributi tecnici e teorici in citometria spettrale di K. Futamura, che ha anche rivisto criticamente il manoscritto. Siamo anche in debito con C. Ait-Mansour, P.-H. Commere, A. Bandeira, e P. Pereira per la lettura critica del manoscritto e per la consulenza tecnica senza fine e sostegno. Ringraziamo anche P. Pereira per il dono degli anti Vγ7-APC e Vδ4-biotina anticorpi marcati. Si ringraziano il Centre d&#39;Enseignements da Pasteur per accogliere e sostenere la logistica di ripresa. Questo lavoro è stato sostenuto dal Pasteur Institute, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM); il Fondo nazionale svizzero e Pasteur Bourse Roux (SS); Fundação para a Ciência ea Tecnologia - SFRH / BD / 74218/2010 (MV); e Université Paris Diderot, l&#39;Agence Nationale de la Recherche (ANR) del progetto Twothyme, l&#39;ANR, e il Programma REVIVE (investimento per il futuro) (AC).

<ol><li>Futamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+full-spectral+flow+cytometry+with+multiple+spectrally-adjacent+fluorescent+proteins+and+fluorochromes+and+visualization+of+in+vivo+cellular+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Novel full-spectral flow cytometry with multiple spectrally-adjacent fluorescent proteins and fluorochromes and visualization of in vivo cellular movement.</a> Cytometry A. 87 (9), 830-842 (2015).</li>
<li>Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+Cytometry+Has+Unique+Properties+Allowing+Multicolor+Analysis+of+Cell+Suspensions+Isolated+from+Solid+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Spectral Cytometry Has Unique Properties Allowing Multicolor Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues.</a> PLoS One. 11 (8), e0159961(2016).</li>
<li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+FACS+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multiparameter FACS analysis.</a> Curr Protoc Immunol. , Chapter 5, Unit 5.8, (2002).</li>
<li>Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seventeen-colour+flow+cytometry%3A+unravelling+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system.</a> Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).</li>
<li>Grigoriadou, K., Boucontet, L., Pereira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor-gamma+allele-specific+selection+of+V+gamma+1%2FV+delta+4+cells+in+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell receptor-gamma allele-specific selection of V gamma 1/V delta 4 cells in the intestinal epithelium.</a> J Immunol. 169 (7), 3736-3743 (2002).</li>
<li>Guy-Grand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin%2C+trafficking%2C+and+intraepithelial+fate+of+gut-tropic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Origin, trafficking, and intraepithelial fate of gut-tropic T cells.</a> J Exp Med. 210 (9), 1839-1854 (2013).</li>
<li>Lavoinne, A., Cauliez, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BCardiac+troponin+I+and+T%3A+specific+biomarkers+of+cardiomyocyte%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Med+Interne%22%5BJournal%5D)">[Cardiac troponin I and T: specific biomarkers of cardiomyocyte].</a> Rev Med Interne. 25 (2), 115-123 (2004).</li>
<li>Staudt, D. W., Liu, J., Thorn, K. S., Stuurman, N., Liebling, M., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+of+cardiomyocyte+behavior+reveals+two+distinct+steps+in+ventricular+trabeculation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging of cardiomyocyte behavior reveals two distinct steps in ventricular trabeculation.</a> Development. 141 (3), 585-593 (2014).</li>
<li>Beltrami, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+cardiac+stem+cells+are+multipotent+and+support+myocardial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration.</a> Cell. 114 (6), 763-776 (2003).</li>
<li>Keith, M. C., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22String+theory%22+of+c-kit%28pos%29+cardiac+cells%3A+a+new+paradigm+regarding+the+nature+of+these+cells+that+may+reconcile+apparently+discrepant+results%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">"String theory" of c-kit(pos) cardiac cells: a new paradigm regarding the nature of these cells that may reconcile apparently discrepant results.</a> Circ Res. 116 (7), 1216-1230 (2015).</li>
<li>Valente, M., Nascimento, D. S., Cumano, A., Pinto-do-Ó, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sca-1%2B+cardiac+progenitor+cells+and+heart-making%3A+a+critical+synopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Sca-1+ cardiac progenitor cells and heart-making: a critical synopsis.</a> Stem Cells Dev. 23 (19), 2263-2273 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

FCM convenzionale si basa sulla rilevazione di fotoni emessi dopo l&#39;eccitazione di sonde fluorescenti. L&#39;emissione di fluorescenza di un fluorocromo rilevato in un rivelatore progettato per misurare il segnale da un altro fluorocromo induce sovrapposizione fisica. Questo ricaduta tra spettri di emissione deve essere corretto da compensazioni. FCM spettrale e elaborazione dati dall&#39;algoritmo unmixing deconvoluzione consente la combinazione di fluorocromi con stretti picchi di emis...

Negli ultimi decenni, Citometria a flusso (FCM) è diventato un metodo analitico ampiamente disponibile essenziale per gli studi di fenotipizzazione delle cellule. V&#39;è stato un aumento sostanziale nei coloranti fluorescenti disponibili, in particolare fluorocromi eccitati dal laser viola (405 nm) (ad esempio, viola brillante e nuovi coloranti Q-dot). Tuttavia, la crescita di coloranti fluorescenti disponibili aumenta il rischio di emissioni sovrappongono e richiede matrici compensazione intensità di lavoro. FCM diventato ampiamente utilizzato per analizzare sospensioni di cellule da tessuto solido, ma la presenza di cellule auto-fluorescente limita la discriminazione delle popolazioni specificamente etichettati. I principi fondamentali della spettrale FCM sono riportati in dettaglio nel Futamura et al. 1, 2. Brevemente, la FCM spettrale qui utilizzato (vedere la tabella dei materiali) è dotato di 405, 488 e 638 nm laser. La spettrale FCM cattura tutto il f emessaLuorescenza come spettro in un array lineare a 32 canali PMT (32ch PMT) per 500 nm a 800 nm e 2 PMT indipendenti per 420 nm a 440 nm e rispettivamente da 450 a 469 nm che sostituiscono i tradizionali filtri passa-banda. I punti laser 488 e 405/638 nm sono separati spatialmente, mentre i punti laser 405 nm e 638 nm sono co-lineari. Per ogni singola particella, l&#39;FCM spettrale misura fino a 66 canali di dati di fluorescenza eccitati dai laser da 405 nm e 488 nm. Quando le cellule sono eccitate dal laser da 638 nm, l&#39;FCM spettrale misura 58 canali di dati di fluorescenza, perché viene inserita una maschera per impedire che il laser da 638 nm brilla nel PMT. FCM Spectral analizza i dati dello spettro completo acquisito con un algoritmo basato sul metodo Ponderato dei minimi quadrati (WLSM), che consente la separazione di spettri fluorescenti sovrapposti. Spectra derivata da campioni singoli macchiati e non colorati sono riconosciuti come gli spettri di base di riferimento. I campioni multi-colorati sono dotati di matematica and miscelati, e lo spettro di un campione con etichette fluorescenti misti viene scomposto in una raccolta dei suoi spettri costituente. L&#39;unmixing, nella tecnologia spettrale 3, 4, sostituisce la compensazione che rimuove il segnale da tutti i rivelatori tranne quella che misura un determinato colorante. In questo studio, abbiamo combinato e testati 19 fluorocromi in una singola analisi 21-parametro che caratterizza i principali sottoinsiemi ematopoietiche presenti nella milza mouse. Inoltre, abbiamo dimostrato che la citometria spettrale può gestire segnale auto-fluorescente, migliorando così la caratterizzazione intestinale linfociti intra-epiteliali e del cuore embrionale. Infatti, in questi tessuti, gestione auto-fluorescenza consentito per l&#39;assegnazione di fluorescenza specifica per le cellule che sarebbero esclusi dall&#39;analisi in FCM convenzionale.

<table><tbody><tr><td>Topi</td><td>Janvier Labs</td><td>CD45.2</td><td>Fonte di cellule</td></tr><tr><td>Etanolo 70%</td><td>VWR</td><td>83801.36</td><td>Sterilizzazione</td></tr><tr><td>DPBS (Ca2+, Mg2+)</td><td>GIBCO ThermoFisher</td><td>14040-174</td><td>Raccolta di embrioni</td></tr> Soluzione <tr><td>salina bilanciata di Hanks (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+)</td><td>GIBCO Life ThermoFisher</td><td>14025092</td><td>Soluzioni per dissociazione, digestione e colorazione</td></tr> Soluzione <tr><td>salina bilanciata di Hanks (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-)</td><td>GIBCO Life ThermoFisher</td><td>14175095</td><td>Soluzioni per dissociazione, digestione e colorazione</td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello (FCS)</td><td>EUROBIO</td><td>CVFSVF00-0U</td><td>Soluzioni per dissociazione, digestione e colorazione</td></tr><tr><td>Collagenasi</td><td>Sigma</td><td>C2139</td><td>Soluzione enzimatica</td></tr><tr><td>90 x 15 mm, piastre di Petri per colture di tessuti plastici.</td><td>TPP</td><td>T93100</td><td>Raccolta di embrioni e cuori</td></tr><tr><td>35 x 15 mm, piastre di Petri per colture di tessuti plastici.</td><td>TPP</td><td>T9340</td><td>Collezione Cuori</td></tr><tr><td>Forbice a iride fine</td> Strumenti per le <td>scienze Fine</td><td>14090-09</td><td>Strumenti per dissezione</td></tr><tr><td>Pinze lorde (pinze strette, curve 12 cm)</td><td>Strumenti per le scienze</td><td>11003-12</td><td>Strumenti per la dissezione</td></tr><tr><td>Pinze fini (Dumont n. 7 pinze)</td><td>Strumenti per le scienze</td><td>11272-30</td><td>Strumenti per la dissezione</td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>VWR</td><td>21909-668</td><td>Strumenti di dissezione</td></tr><tr><td>LEICA MZ6 Microscopio di dissezione</td><td>LEICA</td><td>MZ6 10445111</td><td>Campionamento; Oculare W-Pl10x/23</td></tr><tr><td>Sorgente lampada fredda</td><td>SCHOTT VWR</td><td>KL1500 compatto</td><td>Campionamento; Due fibre di collo d'oca adattate</td></tr><tr><td>a tubi FACS</td><td>VWR</td><td>60819-310</td><td>Celle di digestione</td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti (fondo tondo)</td><td>VWR</td><td>10861-564</td><td>Celle di colorazione</td></tr><tr><td>Panno di bulloneria a rete di nylon sterilizzato, pezzi da 50/50 mm.</td><td>SEFAR NITEX</td><td>SEFAR NITEX</td><td>Filtrazione cellulare</td></tr><tr><td>UltrasComp eBeads</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi marcati con fluorescenza</td><td>Biolegend</td><td>Numero di catalogo vedi tabella sottostante</td><td>Colorazione delle cellule</td></tr></tbody></table>

analisi delle sospensioni cellulari isolate da tessuti solidi da spectral citometria a flusso

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Citometria a flusso è stato utilizzato negli ultimi 40 anni per definire e analizzare il fenotipo di linfoide e di altre cellule ematopoietiche. Inizialmente limitata all&#39;analisi di alcuni fluorocromi, attualmente esistono diverse decine di coloranti fluorescenti, e fino a 14-18 diversi coloranti possono essere combinati in un momento. Tuttavia, alcune limitazioni ancora alterino le capacità analitiche. A causa della molteplicità di sonde fluorescenti, analisi dei dati è diventata sempre più complessa a causa della necessità di grandi matrici compensazione multiparametriche. Inoltre, i modelli di topo mutante che trasportano proteine ​​fluorescenti per rilevare e tracciare specifici tipi cellulari nei diversi tessuti sono diventati disponibili, quindi è necessaria l&#39;analisi (mediante citometria di flusso) di sospensioni cellulari auto-fluorescenza ottenute da organi solidi. Spectral citometria a flusso, che distingue le forme di spettri di emissione lungo un ampio intervallo di lunghezze d&#39;onda continue, affronta alcuni di questi problemi. I dati vengono analizzati with un algoritmo che sostituisce matrici di compensazione e tratta autofluorescenza come parametro indipendente. Così, spettrale citometria di flusso dovrebbe essere in grado di discriminare fluorocromi con picchi di emissione simili e può fornire un&#39;analisi multiparametrica senza esigenze di compensazione. Questo protocollo descrive il flusso spettrale analisi di citometria, consentendo un 21-parametro di caratterizzazione (19 sonde fluorescenti) e la gestione di un segnale di auto-fluorescente, fornendo alta risoluzione nel rilevamento popolazione minore. I risultati qui presentati indicano che il flusso spettrale presenta citometria vantaggi nell&#39;analisi delle popolazioni cellulari da tessuti difficili da caratterizzare in flusso convenzionale citometria, come il cuore e l&#39;intestino. Spectral citofluorimetria così dimostra la capacità di analisi multi-parametrica di gestione performante flusso convenzionale citometria senza obbligo di compensazione e consente auto-fluorescenza.

21-parametro pannello FCM spettrale per analizzare splenociti La Figura 1 mostra i risultati ottenuti con il pannello 19-fluorescente-anticorpo applicata alle cellule spleniche comprendenti diversi anticorpi che riconoscono sottoinsiemi di T, B, NK, dendritiche e cellule mieloidi, mentre CD45 etichette tutte le cellule nucleate ematopoietiche. Il pannello comprende inoltre un colorante vitalità (PI), nonché le di...

Questo articolo descrive spettrale citometria, un nuovo approccio per citometria di flusso che utilizza le forme di spettri di emissione per distinguere fluorocromi. Un algoritmo sostituisce compensazioni e può trattare auto-fluorescenza come parametro indipendente. Questo nuovo approccio permette la corretta analisi delle cellule isolate da organi solidi.

Analisi delle sospensioni cellulari isolate da tessuti solidi da Spectral citometria a flusso

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

L'obiettivo generale di questa tecnica di citometria spettrale è distinguere diversi fluorocromi utilizzando i loro interi spettri di emissione. Inoltre, questo protocollo consente l'implementazione dell'autofluorescenza come parametro indipendente, permettendo un'analisi accurata delle cellule isolate da organi solidi. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi dell'immunologia e dello sviluppo della biologia delle cellule staminali, ad esempio su come identificare popolazioni cellulari rare.Il principale vantaggio di questa tecnica è la sua capacità unica di analizzare contemporaneamente un elevato numero di parametri e di gestire l'autofluorescenza dei tessuti solidi. Sebbene questo metodo venga utilizzato per la preparazione di una sospensione di singole cellule derivata dall'intestino e dal cuore, può essere applicato anche ad altri organi, come polmone, muscolo scheletrico, fegato, tessuto adiposo e rene. Per iniziare, isolare e lavare l'intestino tenue di un topo adulto.Quindi, posizionare il tessuto su un tovagliolo di carta e, utilizzando forbici affilate, rimuovere con attenzione le placche di Peyer. Aprire l'intestino praticando un'incisione longitudinale e dividerlo in pezzi di un centimetro. Successivamente, trasferire il tessuto in un becher contenente 30 millilitri di HBSS integrato con il 10 percento di FCS e incubare a 37 gradi Celsius con agitazione costante per 30 minuti.Al termine dell'incubazione, trasferire la sospensione cellulare in un tubo di plastica da 15 millilitri e vorticare vigorosamente per cinque minuti. Successivamente, incubare la sospensione sul ghiaccio per dieci minuti per consentire la sedimentazione dei frammenti grandi e non dissociati. Dopodiché, trasferire il soprannatante in un nuovo tubo e centrifugare le cellule a 120 ×g per sette minuti.Dopo la centrifugazione, sospendiamo le cellule in dieci millilitri di HBSS con FCS all'uno percento e le contiamo utilizzando una camera di Neubauer. Prima della colorazione cellulare, trasferire un milione di cellule intestinali in un tubo da cinque millilitri per preparare un controllo negativo. Per preparare un campione, aggiungere un milione di cellule intestinali, seguite da due millilitri di HBSS con FCS all'uno percento, in un nuovo tubo da cinque millilitri e centrifugare la sospensione a 120 ×g, a quattro gradi Celsius, per cinque minuti.Dopo aver eliminato il soprannatante, sospendiamo le cellule in 50 microlitri di soluzione di anticorpi. Avvolgere il tubo con carta d'alluminio e incubare le cellule a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Al termine dell'incubazione, aggiungere due millilitri di FCS all'uno percento in HBSS al campione e centrifugare a 120 ×g, a quattro gradi Celsius, per cinque minuti.Eliminare il soprannatante e risospendere il pellet in 200 microlitri di soluzione di ioduro di propidio a 0,5 microgrammi per millilitro. Dopo aver decapitato un embrione di topo, immergerne il corpo in una piastra di Petri, foderata con un tovagliolo di carta pre-umidificato e riempita con 50 millilitri di HBSS contenente l'uno percento di FCS. Al microscopio stereoscopico, praticare un'incisione sul lato destro del torace dell'embrione e aprire con cura la cavità toracica, evitando di danneggiare il cuore.Agganciare i grossi vasi ed estrarre il cuore collegato ai polmoni e al timo. Trasferire gli organi in una piastra da 35 millilitri riempita con due millilitri di FCS all'uno percento in HBSS. Successivamente, isolare il cuore dagli organi circostanti e dal tessuto connettivo.Dopo aver lavato il cuore, immergerlo in un millilitro di soluzione enzimatica preriscaldata e, utilizzando pinzette fini e un bisturi, tritare l'organo in pezzi di un millimetro cubo sotto un microscopio stereoscopico. Aggiungere un ulteriore millilitro di soluzione enzimatica preriscaldata e trasferire il tessuto frammentato in un tubo da cinque millilitri con tappo. Incubare il campione in posizione orizzontale a 37 gradi Celsius per 15 minuti.Al termine dell'incubazione, omogeneizzare il tessuto eseguendo un'aspirazione e un'espulsione ripetuta della sospensione con una pipetta P1000. Successivamente, mettere da parte i campioni, posizionati verticalmente, fino a quando i frammenti di tessuto non digerito si saranno sedimentati. Trasferire il soprannatante in un tubo da 50 millilitri.Aggiungere due millilitri di FCS al dieci percento in HBSS e mantenere le cellule isolate sul ghiaccio. Successivamente, aggiungere due millilitri di soluzione enzimatica preriscaldata al tubo da cinque millilitri contenente il sedimento del tessuto non digerito e continuare la digestione del tessuto come mostrato in precedenza fino a quando non si osserva più tessuto residuo. Centrifugare la sospensione cellulare ottenuta a 120 ×g per dieci minuti.Quindi, eliminare il soprannatante e risospendere le cellule in un millilitro di FCS all'uno percento in HBSS, privo di cationi calcio e magnesio. Per colorare le cellule cardiache, trasferire 200 microlitri della sospensione cellulare in pozzetti di una piastra a 96 pozzetti con fondo rotondo. Centrifugare la piastra a 480 ×g per un minuto ed eliminare il soprannatante.Successivamente, risospendere le cellule cardiache in 100 microlitri di soluzione anticorpale. Avvolgere la piastra in carta d'alluminio e incubare a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule cardiache con 200 microlitri di HBSS privo di calcio e magnesio contenente l'uno percento di FCS, quindi centrifugare la sospensione a 480 ×g per un minuto.Quindi, risospendere le cellule in 200 microlitri di FCS all'uno percento in HBSS privo di ioni calcio e magnesio e trasferire la sospensione in una provetta da cinque millilitri precedentemente riempita con 200 microlitri di FCS all'uno percento in HBSS senza calcio e magnesio. Infine, aggiungere 400 microlitri di FCS all'uno percento in HBSS privo di cationi calcio e magnesio, contenente 0,5 microgrammi per millilitro di ioduro di propidio, e filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro in nylon da 70 micro. Per visualizzare le cellule, caricare il campione colorato su un citometro a flusso e fare clic su anteprima, quindi registrare fino a due volte dieci alla sesta eventi nel campione cliccando su acquisisci.Nella scheda di analisi, aprire la finestra della tavolozza dei colori e registrare tutti i parametri studiati aggiungendo il fluorocromo insieme al relativo marcatore. Assicurarsi di includere i parametri di autofluorescenza e di vitalità. Nella finestra di controllo, all'interno dell'elenco dei tubi, analizzare il primo campione singolarmente marcato contenente perle per la compensazione.Quindi, nel foglio di lavoro, fare clic sullo strumento di progettazione del poligono e delimitare la popolazione di microsfere nel grafico FSC SSC. Fare doppio clic sul cancello per creare un grafico figlio delle microsfere selezionate. Quindi, delimitare separatamente le microsfere positive e negative.Verificare la popolazione figlia selezionata mediante un successivo gating ed eliminazione degli outlier in ciascuna frazione positiva e negativa. Successivamente, caricare i gate negativi e positivi nella finestra di separazione. Quindi, selezionare il campione di cellule non colorate nell'elenco dei tubi e creare gate separati per cellule autofluorescenti e non autofluorescenti.Dopo aver definito le soglie negative e positive per tutti i parametri, inclusa l'autofluorescenza e la vitalità, fare clic su calcola. Quindi, applicare la separazione ai campioni analizzati. Per analizzare i dati, selezionare le cellule in un grafico di SSC rispetto a FSC ed escludere le cellule morte colorate con ioduro di propidio.Infine, definire le finestre per tutte le popolazioni di interesse. Vengono qui presentati i risultati delle analisi di citometria a flusso e citometria spettrale delle cellule isolate dal cuore fetale e marcate con gli anticorpi anti-TER119, anti-CD45 e anti-Sca-1. Un sottogruppo di cellule autofluorescenti è stato rilevato da due citometri convenzionali, mentre nella citometria spettrale queste cellule non sono state definite come autofluorescenti e sono state incluse nella popolazione negativa per CD45 e TER119.Le cellule identificate mediante citometria a flusso convenzionale come autofluorescenti, ma non positive per CD31, sono state successivamente analizzate per l'espressione dei trascritti specifici dei cardiomiociti. Sono stati riscontrati alti livelli di troponina cardiaca e di trascritti simili a quelli dei miociti atriali nella popolazione di cellule autofluorescenti, confermando che un'ampia sotto-popolazione di cardiomiociti viene trascurata nella citometria a flusso convenzionale. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa otto ore, se eseguita correttamente.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che tutti i passaggi devono essere effettuati sul ghiaccio e in modo tempestivo per garantire che le cellule rimangano vitali. Dopo questa procedura, è possibile eseguire analisi di proteine intracellulari e di ulteriori marcatori di superficie al fine di rispondere a domande relative a specifici percorsi molecolari. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia e della biologia dello sviluppo o delle cellule staminali, permettendo di esplorare e isolare popolazioni rare da diversi organi.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare e colorare cellule da tessuti cellulari e di come analizzare l'espressione dei marcatori di superficie mediante citometria a flusso spettrale, che supera le limitazioni derivanti dalla autofluorescenza cellulare. Non dimenticare che lavorare con ioduro di propidio può essere estremamente pericoloso e che precauzioni, come l'uso di dispositivi di protezione individuale (PPE), devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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