Analisi delle sospensioni cellulari isolate da tessuti solidi da Spectral citometria a flusso

L'obiettivo generale di questa tecnica di citometria spettrale è quello di distinguere i diversi fluorocromi utilizzando i loro interi spettri di emissione. Inoltre, questo protocollo consente l'implementazione dell'autofluorescenza come parametro indipendente, consentendo una corretta analisi delle cellule isolate dagli organi solidi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi dell'immunologia e dello sviluppo della biologia delle cellule staminali, come ad esempio come identificare le popolazioni di cellule rare.

Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua capacità unica di analizzare simultaneamente un gran numero di parametri e di gestire l'autofluorescenza dei tessuti solidi. Sebbene questo metodo venga utilizzato per la preparazione di una sospensione di una singola cellula derivata dall'intestino e dal cuore, può essere applicato anche ad altri organi, come polmone, scheletrico, muscolo, fegato, grasso e rene. Per iniziare, isolare e lavare l'intestino tenue da un topo adulto.

Quindi, posiziona il fazzoletto su un tovagliolo di carta e, usando le forbici affilate, rimuovi con cura le toppe di Peyer. Aprite l'intestino tagliandolo longitudinalmente e dividetelo in pezzi di un centimetro. Quindi, trasferire il tessuto in un becher riempito con 30 millilitri di HBSS integrato con il dieci percento di FCS e incubarlo a 37 gradi Celsius mescolando costantemente per 30 minuti.

Una volta completata l'incubazione, trasferire la sospensione cellulare in una provetta di plastica da 15 millilitri e agitarla energicamente per cinque minuti. Quindi, incubare la sospensione su ghiaccio per dieci minuti per consentire ai frammenti grandi e non dissociati di sedimentare. Successivamente, trasferire il surnatante in una nuova provetta e far girare le cellule a 120 volte G per sette minuti.

Una volta pellettate, sospendiamo le celle in dieci millilitri di FCS all'uno per cento in HBSS e le contiamo utilizzando una camera Neubauer. Prima della colorazione cellulare, trasferire una volta dieci alla sesta cellula intestinale in una provetta da cinque millilitri per preparare un controllo negativo. Per preparare un campione, aggiungere una volta dieci al sesto di cellule intestinali, seguito da due millilitri di HBSS con l'1% di FCS in una nuova provetta da cinque millilitri e centrifugare la sospensione a 120 volte G, a quattro gradi Celsius, per cinque minuti.

Dopo aver scartato il surnatante, sospendiamo le cellule in 50 microlitri della soluzione di anticorpi. Avvolgere il foglio di alluminio della provetta e incubare le cellule a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Una volta completata l'incubazione, aggiungere due millilitri di FCS all'uno per cento in HBSS al campione e centrifugarlo a 120 volte G, quattro gradi Celsius, per cinque minuti.

Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 200 microlitri di soluzione di ioduro di propidio da 0,5 microgrammi per millilitri. Dopo aver decapitato un embrione di topo, immergere il suo corpo in una capsula di Petri, foderata con un tovagliolo di carta pre-bagnato e riempita con 50 millilitri di FCS all'1% in HBSS. Sotto uno stereomicroscopio praticare un'incisione sul lato destro del torace dell'embrione e aprire con cura il torace, evitando di danneggiare il cuore.

Afferra i grandi vasi ed estrai il cuore collegato ai polmoni e al timo. Trasferire gli organi in una capsula di Petri da 35 millilitri riempita con due millilitri di FCS all'uno per cento in HBSS. Quindi, isolare il cuore dagli organi circostanti e dal tessuto connettivo.

Dopo aver lavato il cuore, immergerlo in un millilitro di soluzione enzimatica preriscaldata e, usando una pinza fine e un bisturi, tritare l'organo in pezzi di un millimetro cubo sotto uno stereomicroscopio. Aggiungere un ulteriore millilitro di soluzione enzimatica preriscaldata e trasferire il tessuto frammentato in una provetta da cinque millilitri chiusa. Incubare il campione in posizione orizzontale a 37 gradi Celsius per 15 minuti.

Una volta completata l'incubazione, omogeneizzare il tessuto mediante pipettaggio ripetitivo della sospensione con una pipetta P1000. Quindi, mettere da parte i campioni, posizionati verticalmente, fino a quando i frammenti dei tessuti non digeriti non si sedimentano. Trasferire il surnatante in una provetta da 50 millilitri.

Aggiungere due millilitri di FCS al dieci percento in HBSS e mantenere le cellule isolate sul ghiaccio. Successivamente, aggiungere due millilitri di soluzione enzimatica preriscaldata alla provetta da cinque millilitri contenente il sedimento tissutale non digerito e continuare a digerire il tessuto come mostrato in precedenza fino a quando non si osserva più alcun tessuto rimanente. Centrifugare la sospensione cellulare ottenuta a 120 volte G per dieci minuti.

Quindi, scartare il surnatante e risospendere le cellule in un millilitro di FCS all'1% in HBSS, prive di cationi di calcio e magnesio. Per colorare le cellule cardiache, trasferire 200 microlitri di sospensione cellulare nei pozzetti di una piastra a fondo rotondo da 96 pozzetti. Centrifugare la piastra a 480 volte G per un minuto ed eliminare il surnatante.

Successivamente, risospendere le cellule cardiache in 100 microlitri della soluzione anticorpale. Avvolgere la piastra in un foglio di alluminio e incubarla a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Una volta completata l'incubazione, lavare le cellule cardiache con 200 microlitri di FCS all'uno per cento in HBSS privo di calcio e magnesio e centrifugare la sospensione a 480 volte G per un minuto.

Quindi, risospendere le cellule in 200 microlitri di FCS all'uno per cento in HBSS privo di ioni calcio e magnesio e trasferire la sospensione in una provetta da cinque millilitri preriempita con 200 microlitri di FCS all'uno per cento in HBSS privo di calcio e magnesio. Infine, aggiungere 400 microlitri di FCS all'1% in HBSS privo di cationi di calcio e magnesio, contenenti 0,5 microgrammi per millilitro di ioduro di propidio e filtrare la sospensione cellulare attraverso una rete di nylon 70 micro. Per visualizzare le cellule, caricare il campione colorato in una citometria a flusso e fare clic su anteprima, quindi registrare fino a due volte dieci al sesto evento nel campione facendo clic su acquisisci.

Nella scheda di analisi, aprire la finestra della tavolozza dei colori e registrare tutti i parametri studiati aggiungendo il fluorocromo insieme al marcatore corrispondente. Assicurati di includere i parametri di autofluorescenza e vitalità. Nella finestra di controllo, all'interno dell'elenco delle provette, analizzare il primo campione colorato contenente le perle di compensazione.

Quindi, nel foglio di lavoro, fare clic sullo strumento di progettazione poligonale e inserire la popolazione di perline nel grafico FSC SSC. Fare doppio clic sul cancello per creare un grafico figlio delle perline gated. E poi le perline positive e negative del gate separatamente.

Verificare la popolazione figlia selezionata mediante gating successivo ed eliminazione dei valori anomali in ogni frazione positiva e negativa. Quindi, carica i gate negativi e positivi nella finestra di un-mixing. Quindi, selezionare il campione di cellule non colorate nell'elenco delle provette e progettare cancelli separati per celle autofluorescenti e non autofluorescenti.

Una volta definite le porte negative e positive per tutti i parametri, tra cui l'autofluorescenza e la vitalità, fare clic su calcola. Quindi, applicare l'un-mixing ai campioni analizzati. Per analizzare i dati, è necessario inserire le cellule in un grafico di SSC rispetto a FSC ed escludere le cellule morte colorate con ioduro di propidio.

Infine, determina i cancelli per tutte le popolazioni di interesse. Qui vengono presentati i risultati della citometria a flusso e delle analisi di citometria spettrale delle cellule isolate dal cuore fetale e colorate con anticorpi anti-TER119, anti-CD45 e anti-Sca-1. Un sottogruppo di cellule in autofluorescenza è stato rilevato da due citometri convenzionali, mentre in citometria spettrale queste cellule non sono state definite autofluorescenti ed erano comprese nella popolazione CD45 TER119 negativa.

Le cellule identificate dalla citometria a flusso convenzionale come autofluorescenti, ma non le cellule CD31 positive, sono state quindi analizzate per l'espressione dei trascritti specifici dei cardiomiociti. Alti livelli di troponina cardiaca e miociti atriali come i trascritti dei treni sono stati trovati nella popolazione di cellule autofluorescenti, confermando che un ampio sottogruppo di cardiomiociti non è presente nella citometria a flusso convenzionale. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa otto ore, se preformata correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che tutti i passaggi devono essere eseguiti sul ghiaccio e in modo tempestivo per garantire che le cellule rimangano vitali. Seguendo questa procedura, le proteine intracellulari e l'analisi di ulteriori marcatori di superficie possono essere preformate per rispondere a domande riguardanti specifiche vie molecolari. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia e della biologia dello sviluppo o delle cellule staminali per esplorare e isolare popolazioni rare da diversi organi.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come isolare e colorare le cellule dai tessuti cellulari e di come analizzare l'espressione dei marcatori di superficie mediante citometria a flusso spettrale che supera le limitazioni derivanti dall'autofluorescenza cellulare. Non dimenticare che lavorare con lo ioduro di propidio può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come l'uso di DPI.