Analisi delle sospensioni cellulari isolate da tessuti solidi da Spectral citometria a flusso

L'obiettivo generale di questa tecnica di citometria spettrale è distinguere diversi fluorocromi utilizzando i loro interi spettri di emissione. Inoltre, questo protocollo consente l'implementazione dell'autofluorescenza come parametro indipendente, permettendo un'analisi accurata delle cellule isolate da organi solidi. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi dell'immunologia e dello sviluppo della biologia delle cellule staminali, ad esempio su come identificare popolazioni cellulari rare.

Il principale vantaggio di questa tecnica è la sua capacità unica di analizzare contemporaneamente un elevato numero di parametri e di gestire l'autofluorescenza dei tessuti solidi. Sebbene questo metodo venga utilizzato per la preparazione di una sospensione di singole cellule derivata dall'intestino e dal cuore, può essere applicato anche ad altri organi, come polmone, muscolo scheletrico, fegato, tessuto adiposo e rene. Per iniziare, isolare e lavare l'intestino tenue di un topo adulto.

Quindi, posizionare il tessuto su un tovagliolo di carta e, utilizzando forbici affilate, rimuovere con attenzione le placche di Peyer. Aprire l'intestino praticando un'incisione longitudinale e dividerlo in pezzi di un centimetro. Successivamente, trasferire il tessuto in un becher contenente 30 millilitri di HBSS integrato con il 10 percento di FCS e incubare a 37 gradi Celsius con agitazione costante per 30 minuti.

Al termine dell'incubazione, trasferire la sospensione cellulare in un tubo di plastica da 15 millilitri e vorticare vigorosamente per cinque minuti. Successivamente, incubare la sospensione sul ghiaccio per dieci minuti per consentire la sedimentazione dei frammenti grandi e non dissociati. Dopodiché, trasferire il soprannatante in un nuovo tubo e centrifugare le cellule a 120 ×g per sette minuti.

Dopo la centrifugazione, sospendiamo le cellule in dieci millilitri di HBSS con FCS all'uno percento e le contiamo utilizzando una camera di Neubauer. Prima della colorazione cellulare, trasferire un milione di cellule intestinali in un tubo da cinque millilitri per preparare un controllo negativo. Per preparare un campione, aggiungere un milione di cellule intestinali, seguite da due millilitri di HBSS con FCS all'uno percento, in un nuovo tubo da cinque millilitri e centrifugare la sospensione a 120 ×g, a quattro gradi Celsius, per cinque minuti.

Dopo aver eliminato il soprannatante, sospendiamo le cellule in 50 microlitri di soluzione di anticorpi. Avvolgere il tubo con carta d'alluminio e incubare le cellule a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Al termine dell'incubazione, aggiungere due millilitri di FCS all'uno percento in HBSS al campione e centrifugare a 120 ×g, a quattro gradi Celsius, per cinque minuti.

Eliminare il soprannatante e risospendere il pellet in 200 microlitri di soluzione di ioduro di propidio a 0,5 microgrammi per millilitro. Dopo aver decapitato un embrione di topo, immergerne il corpo in una piastra di Petri, foderata con un tovagliolo di carta pre-umidificato e riempita con 50 millilitri di HBSS contenente l'uno percento di FCS. Al microscopio stereoscopico, praticare un'incisione sul lato destro del torace dell'embrione e aprire con cura la cavità toracica, evitando di danneggiare il cuore.

Agganciare i grossi vasi ed estrarre il cuore collegato ai polmoni e al timo. Trasferire gli organi in una piastra da 35 millilitri riempita con due millilitri di FCS all'uno percento in HBSS. Successivamente, isolare il cuore dagli organi circostanti e dal tessuto connettivo.

Dopo aver lavato il cuore, immergerlo in un millilitro di soluzione enzimatica preriscaldata e, utilizzando pinzette fini e un bisturi, tritare l'organo in pezzi di un millimetro cubo sotto un microscopio stereoscopico. Aggiungere un ulteriore millilitro di soluzione enzimatica preriscaldata e trasferire il tessuto frammentato in un tubo da cinque millilitri con tappo. Incubare il campione in posizione orizzontale a 37 gradi Celsius per 15 minuti.

Al termine dell'incubazione, omogeneizzare il tessuto eseguendo un'aspirazione e un'espulsione ripetuta della sospensione con una pipetta P1000. Successivamente, mettere da parte i campioni, posizionati verticalmente, fino a quando i frammenti di tessuto non digerito si saranno sedimentati. Trasferire il soprannatante in un tubo da 50 millilitri.

Aggiungere due millilitri di FCS al dieci percento in HBSS e mantenere le cellule isolate sul ghiaccio. Successivamente, aggiungere due millilitri di soluzione enzimatica preriscaldata al tubo da cinque millilitri contenente il sedimento del tessuto non digerito e continuare la digestione del tessuto come mostrato in precedenza fino a quando non si osserva più tessuto residuo. Centrifugare la sospensione cellulare ottenuta a 120 ×g per dieci minuti.

Quindi, eliminare il soprannatante e risospendere le cellule in un millilitro di FCS all'uno percento in HBSS, privo di cationi calcio e magnesio. Per colorare le cellule cardiache, trasferire 200 microlitri della sospensione cellulare in pozzetti di una piastra a 96 pozzetti con fondo rotondo. Centrifugare la piastra a 480 ×g per un minuto ed eliminare il soprannatante.

Successivamente, risospendere le cellule cardiache in 100 microlitri di soluzione anticorpale. Avvolgere la piastra in carta d'alluminio e incubare a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule cardiache con 200 microlitri di HBSS privo di calcio e magnesio contenente l'uno percento di FCS, quindi centrifugare la sospensione a 480 ×g per un minuto.

Quindi, risospendere le cellule in 200 microlitri di FCS all'uno percento in HBSS privo di ioni calcio e magnesio e trasferire la sospensione in una provetta da cinque millilitri precedentemente riempita con 200 microlitri di FCS all'uno percento in HBSS senza calcio e magnesio. Infine, aggiungere 400 microlitri di FCS all'uno percento in HBSS privo di cationi calcio e magnesio, contenente 0,5 microgrammi per millilitro di ioduro di propidio, e filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro in nylon da 70 micro. Per visualizzare le cellule, caricare il campione colorato su un citometro a flusso e fare clic su anteprima, quindi registrare fino a due volte dieci alla sesta eventi nel campione cliccando su acquisisci.

Nella scheda di analisi, aprire la finestra della tavolozza dei colori e registrare tutti i parametri studiati aggiungendo il fluorocromo insieme al relativo marcatore. Assicurarsi di includere i parametri di autofluorescenza e di vitalità. Nella finestra di controllo, all'interno dell'elenco dei tubi, analizzare il primo campione singolarmente marcato contenente perle per la compensazione.

Quindi, nel foglio di lavoro, fare clic sullo strumento di progettazione del poligono e delimitare la popolazione di microsfere nel grafico FSC SSC. Fare doppio clic sul cancello per creare un grafico figlio delle microsfere selezionate. Quindi, delimitare separatamente le microsfere positive e negative.

Verificare la popolazione figlia selezionata mediante un successivo gating ed eliminazione degli outlier in ciascuna frazione positiva e negativa. Successivamente, caricare i gate negativi e positivi nella finestra di separazione. Quindi, selezionare il campione di cellule non colorate nell'elenco dei tubi e creare gate separati per cellule autofluorescenti e non autofluorescenti.

Dopo aver definito le soglie negative e positive per tutti i parametri, inclusa l'autofluorescenza e la vitalità, fare clic su calcola. Quindi, applicare la separazione ai campioni analizzati. Per analizzare i dati, selezionare le cellule in un grafico di SSC rispetto a FSC ed escludere le cellule morte colorate con ioduro di propidio.

Infine, definire le finestre per tutte le popolazioni di interesse. Vengono qui presentati i risultati delle analisi di citometria a flusso e citometria spettrale delle cellule isolate dal cuore fetale e marcate con gli anticorpi anti-TER119, anti-CD45 e anti-Sca-1. Un sottogruppo di cellule autofluorescenti è stato rilevato da due citometri convenzionali, mentre nella citometria spettrale queste cellule non sono state definite come autofluorescenti e sono state incluse nella popolazione negativa per CD45 e TER119.

Le cellule identificate mediante citometria a flusso convenzionale come autofluorescenti, ma non positive per CD31, sono state successivamente analizzate per l'espressione dei trascritti specifici dei cardiomiociti. Sono stati riscontrati alti livelli di troponina cardiaca e di trascritti simili a quelli dei miociti atriali nella popolazione di cellule autofluorescenti, confermando che un'ampia sotto-popolazione di cardiomiociti viene trascurata nella citometria a flusso convenzionale. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa otto ore, se eseguita correttamente.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che tutti i passaggi devono essere effettuati sul ghiaccio e in modo tempestivo per garantire che le cellule rimangano vitali. Dopo questa procedura, è possibile eseguire analisi di proteine intracellulari e di ulteriori marcatori di superficie al fine di rispondere a domande relative a specifici percorsi molecolari. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia e della biologia dello sviluppo o delle cellule staminali, permettendo di esplorare e isolare popolazioni rare da diversi organi.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare e colorare cellule da tessuti cellulari e di come analizzare l'espressione dei marcatori di superficie mediante citometria a flusso spettrale, che supera le limitazioni derivanti dalla autofluorescenza cellulare. Non dimenticare che lavorare con ioduro di propidio può essere estremamente pericoloso e che precauzioni, come l'uso di dispositivi di protezione individuale (PPE), devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.