Tecniche per l'Analisi dei extracellulare vescicole citometria a flusso

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare e analizzare la circolazione delle vescicole extracellulari nel sangue con due metodi diversi. Per il metodo di rilevamento delle vescicole extracellulari individuali. Il plasma povero di piastrine o PPP viene prima isolato da un campione di sangue.

La PPP viene quindi colorata con gli anticorpi coniugati al fluorocromo di interesse. Per il metodo di rilevamento basato su microsfere, le vescicole extracellulari vengono incubate con perline, quindi le vescicole legate a perline vengono colorate con i relativi anticorpi coniugati con fluorocromo. In definitiva, il contenuto di vescicole extracellulari circolanti può essere determinato mediante analisi dei campioni mediante citometria a flusso.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la microscopia elettronica o la separazione con biglie magnetiche, è che è molto più veloce e consente la valutazione della popolazione totale di escal extracellulari piuttosto che essere limitata a sottopopolazioni specifiche. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà poiché il successo di questo metodo richiede una stretta aderenza alle manovre dimostrate e ai parametri di configurazione del citometro Al fine di produrre dati di alta qualità con una variazione giornaliera minima, iniziare centrifugando campioni di sangue intero per separare il plasma dal rivestimento di Buffy e dai globuli rossi. Quindi, trasferire 1,2 millilitri di aliquote del surnatante plasmatico in provette da centrifuga da 1,5 millilitri, facendo attenzione a non disturbare gli strati inferiori contenenti il buffy coat e i globuli rossi, quindi centrifugare nuovamente il surnatante per rimuovere eventuali piastrine e frammenti cellulari di grandi dimensioni.

Al termine della centrifuga, trasferire con cura tutti i campioni di PPP, tranne gli ultimi 200 microlitri, in nuove provette, facendo attenzione a non disturbare i pellet. Quindi mescolare il plasma su e giù più volte e trasferire 320 microlitri di ciascun campione nella fila superiore di una piastra a 96 pozzetti. Per colorare i campioni, combinare gli anticorpi di interesse per ciascuno dei tre pannelli in provette filtranti centrifughe individuali da 22 micrometri a punto zero e far girare gli anticorpi utilizzando una centrifuga a velocità singola ad angolo fisso.

Quando tutto l'anticorpo è passato attraverso il filtro, aggiungere la quantità appropriata di miscela a ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti, come illustrato in figura. Successivamente, utilizzare una pipetta multicanale per miscelare i campioni PPP e quindi trasferire 100 microlitri di ciascun campione agli anticorpi nella seconda fila. Quindi mescolare nuovamente i campioni, cambiare le punte e trasferire 100 microlitri di campione in ciascuna delle due file successive di anticorpi, a seconda dei casi.

Per l'esperimento. Incubare la piastra a quattro gradi Celsius dopo 30 minuti a 220 microlitri di PBS per pozzetto per remare da sei a otto all'interno di una cappa di sicurezza biologica. Quindi, utilizzando una pipetta multicanale regolabile in larghezza, trasferire il contenuto di ciascun pozzetto nella provetta del filtro centrifugo corrispondente senza cambiare i puntali.

Utilizzare 200 microlitri di PBS da una delle file di lavaggio per risciacquare i pozzetti da cui sono stati appena rimossi i campioni. Trasferire quindi la soluzione di risciacquo negli stessi filtri a cui sono stati precedentemente aggiunti i campioni di PPP e chiudere i filtri centrifughi. Una volta che tutti i campioni PPP colorati sono stati trasferiti insieme alle loro soluzioni di risciacquo, centrifugare i campioni in una centrifuga a rotore fisso.

Dopo la centrifuga, assicurarsi che non rimanga liquido sopra i filtri. Quindi risospendere la parte superiore dei filtri in 300 microlitri di PBS e trasferire il contenuto risospeso in provette pre-marcate per l'analisi citofluorimetrica immediata. Il lavaggio dei campioni colorati con filtri centrifughi migliora la separazione tra il fondo e i segnali dei marcatori positivi.

È importante notare, tuttavia, che alcune delle vescicole extracellulari più piccole, compresi gli esosomi, possono essere perse attraverso le porte del filtro Per analizzare i campioni, in primo luogo, impostare i parametri di tensione di dispersione diretta e laterale su una scala logaritmica e selezionare le soglie più basse consentite dal citometro per ciascun parametro. Quindi, durante l'esecuzione di un tubo di punto zero da 22 micrometri, il PBS filtrato regola queste tensioni ai valori più alti che escludono la maggior parte del rumore di fondo. Quindi, fai scorrere un tubo contenente una miscela di perline, un micrometro e più piccolo, e disegna un cancello attorno alla popolazione di perline in un grafico a dispersione laterale in avanti per catturare tutti gli eventi sotto le perline di un micrometro.

Ora impostare la portata del citometro su un valore basso e utilizzare le perline per regolare la manopola della portata sul citometro sulla frequenza di evento desiderata. Quindi, utilizzando un tubo di particelle fluorescenti arcobaleno diluite in PBS, acquisisci 5.000 eventi, registrando l'intensità media dei valori per la diffusione diretta e per ciascun canale di colore. Quando tutti i parametri sono stati impostati, eseguire ogni campione per esattamente uno o due minuti Dopo che la prima lettura per ciascuna provetta è stata completata, mescolare 20 microlitri di 10% MP 40 in ciascun campione e rileggere le provette per lo stesso periodo di tempo per consentire la sottrazione degli eventi positivi rilevati nel campione lisato per un periodo di tempo uguale.

Per rilevare le vescicole extracellulari mediante cattura basata su perline, iniziare lavando due volte le perle di polistirene da sei micrometri non rivestite con mezzi RPMI, quindi con Resus in due millilitri dello stesso. Quindi, aggiungere 6.000 perline a ciascuna nuova provetta fax alla provetta di controllo negativo a 400 microlitri di terreno a tutte le altre provette a 200 microlitri di PPP o vescicole extracellulari ultracentrifugate, a seconda dei casi, e 200 microlitri di terreno. Regolare il volume finale in ogni tubo a 400 microlitri.

Con più media. Incubare le provette per una notte a quattro gradi Celsius su uno shaker. La mattina dopo, lavare le perline con due millilitri di supporto.

Aspirare il surnatante e bloccare qualsiasi legame aspecifico con 400 microlitri di albumina sierica bovina al 5% posta su uno shaker a quattro gradi Celsius per tre ore. Dopo tre ore, lavare le perle in altri due millilitri di terreno e risospendere i pellet in 100 microlitri di terreno fresco. Ora filtra gli anticorpi e aggiungi il volume appropriato di cocktail di anticorpi filtrati a ciascun tubo, quindi dopo 30 minuti a quattro gradi Celsius, lava le perle in altri due millilitri di terreno.

Questa volta risospendere i pellet in 400 microlitri di terreno e analizzare immediatamente i campioni mediante citometria a flusso, regolando i parametri di dispersione interna in avanti alla soglia più bassa consentita dal citometro a flusso, come appena dimostrato. Infine, fare il gate sulla popolazione di perle singoletto e acquisire 2000 eventi per campione. Sia il metodo di rilevamento individuale che quello basato su microsfere possono essere utilizzati per rilevare la presenza di vescicole extracellulari nei campioni di PPP, come illustrato da questi grafici a punti. Per il test di rilevamento individuale, il controllo lised viene utilizzato per impostare i gate per il corrispondente campione non elencato.

La maggior parte degli eventi dovrebbe rientrare nella porta delle vescicole extracellulari. Ad esempio, in questa figura, questi grafici dei parametri bi hanno mostrato il rilevamento dei marcatori, CD 1 0 8 A e CD 2 35 A, che sono due marcatori di globuli rossi noti per coesistere sulle cellule. Come previsto, oltre la metà degli eventi positivi sulle vescicole extracellulari sono positivi per entrambi i marcatori, mentre in questi grafici per parametri, l'espressione delle vescicole extracellulari di due marcatori che notoriamente non coesistono sulle cellule mostra popolazioni positive distinte e separate utilizzando il metodo di rilevamento basato su microsfere.

Non esiste alcuna separazione tra le popolazioni positive e negative e gli eventi compaiono nei doppi quadranti positivi, anche se normalmente non si trovano sugli stessi tipi di cellule a causa del fatto che entrambi i tipi di vescicole extracellulari si legano a una singola perlina. Pertanto, i dati di questo metodo vengono analizzati al meglio utilizzando istogrammi sovrapposti ai dati di controllo negativi, con un apparente spostamento dell'espressione del marcatore osservato nei campioni perlati rispetto ai controlli Una volta padroneggiati. Questa tecnica può essere utilizzata per analizzare 12 campioni di sangue con tre pannelli di anticorpi in tre o quattro ore con il metodo di rilevamento individuale o in un giorno e mezzo con il metodo delle microsfere se viene eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di essere coerenti nel trattamento di ciascun campione, assicurarsi che la velocità di flusso del citometro e l'intensità della fluorescenza siano state regolate correttamente all'inizio di ogni esperimento in modo che corrispondano alle impostazioni sperimentali del giorno precedente, soprattutto quando si eseguono più campioni in più giorni.