Name: Tecniche per lAnalisi dei extracellulare vescicole citometria a flusso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Impara due metodi per analizzare le vescicole extracellulari nel sangue mediante citometria a flusso: rilevamento individuale e approccio a basi di microsfere. Queste tecniche permettono di isolare e caratterizzare le EV con alta sensibilità.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Gli autori desiderano ringraziare Dale Hirschkorn da sistemi Sangue Research Institute per il suo aiuto con citofluorimetro impostazioni dello strumento. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concede HL095470 e U01 HL072268 e contratti DoD W81XWH-10-1-0023 e W81XWH-2-0028.

NOTA: I seguenti protocolli sono stati eseguiti in conformità a tutte le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano. Tutti i campioni soggetti umani sono stati testati in un comitato di revisione istituzionale (IRB) Protocollo -approvato e con il consenso informato dei soggetti. 1. METODO A: Individual Metodo di rilevazione 1.1) Elaborazione di Campione di sangue / isolamento dei veicoli elettrici <ol><li> Disegnare sangue dal donatore / paziente in due tubi di vetro da 10 ml contenente 1,5 ml di ACD-A o altra soluzione adatta anticoagulante e processo immediatamente (entro 30 min max) utilizzando il seguente protocollo centrifugazione differenziale 2-step. NOTA: Questo protocollo produrrà circa 10 ml di plasma povero di piastrine (PPP) dalle combinate ~ 17 ml di sangue disegnate. Se è necessaria più o meno PPP, il numero di tubi di sangue raccolto può essere regolata di conseguenza. </li><li> Centrifugare i campioni a 1.500 xg per 10 min a RTper separare il plasma dal buffy coat e globuli rossi. Trasferire 1,2 ml aliquote del surnatante del plasma di 1,5 ml provette, facendo attenzione a non disturbare gli strati inferiori contenenti il ​​buffy coat e globuli rossi. </li><li> Spin a 13.000 xg per 10 min a RT per rimuovere le piastrine e frammenti di cellule di grandi dimensioni. Trasferire con cura il PPP, lasciando dietro di sé 200 microlitri per non disturbare il pellet e aggiungere il PPP ad un nuovo tubo. </li><li> A questo punto, utilizzare PPP immediatamente per l&#39;analisi o il trasferimento in 1,0 ml aliquote di nuovi 1,5 ml provette e conservare a -80 ° C per un massimo di due anni per una successiva analisi (fare riferimento alla figura 1A per una panoramica). </li><li> Se sono necessarie EV purificate per esperimenti funzionali, di trasferimento di 6 ml di PPP per un tubo ultracentrifuga e aggiungere 28 ml di 0,2 tampone fosfato micron filtrata (PBS). Spin per 60 min a 100.000 xg a temperatura ambiente usando una un&#39;ultracentrifuga dotato di un rotore oscillante secchio. Aspirare il surnatante e risospendere EV pellasciate in 1,5 ml media. NOTA: Per la massima riproducibilità, i campioni di sangue devono essere trattati nel modo più coerente possibile dal donatore al donatore. Ogni variazione nel metodo di isolamento EV potrebbe avere un impatto significativo il numero e il tipo di veicoli elettrici rilevati. </li></ol> 1.2) la preparazione dei campioni per l&#39;analisi NOTA: Da questo punto in poi, i passaggi spiegare un protocollo ad alta produttività per analizzare 12 campioni per 14 marcatori in 3 pannelli. Tuttavia, altre combinazioni di anticorpi possono essere usati qui; il protocollo può essere adattato per studiare altre popolazioni EV sostituendo i marcatori suggeriti per quelli di interesse. <ol><li> Rimuovere 12 campioni dal congelatore (se conservato a -80 ° C) e scongelare a 37 ° C. </li><li> Contenuti pipetta su e giù più volte per mescolare. Togliere 320 ml da ogni campione e aggiungere alla riga superiore di una piastra ben 96. NOTA: Un multi-ben pipetta larghezza regolabile è estremamente utile per questo e molti altri passi in tutto il culoay, soprattutto quando si analizzano più campioni contemporaneamente. </li></ol> 1.3) colorazione EV Campioni <ol><li> Prima della colorazione, filtrare tutti gli anticorpi (Abs) per rimuovere gli aggregati, che può causare segnali positivi. <ol><li> Anticorpi combinano per essere utilizzati in ciascuno dei 3 pannelli in 0,22 micron tubi filtranti centrifughi separati e centrifugare utilizzando un angolo fisso centrifuga singola velocità (~ 750 xg) a temperatura ambiente per 2 minuti, o fino a quando tutta la miscela Ab è passato attraverso il filtro e nessun liquido anticorpi rimane sulla superficie del filtro. Conservare cocktail Ab in frigorifero per un massimo di due settimane, ma ri-filtro ogni volta prima dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Aggiungere la quantità appropriata di miscela Ab filtrato ad ogni pozzetto nella fila 2 (ad esempio, i campioni in Pannello I sono colorate con 2 ml di ogni Ab, così si aggiunge un totale di 12 ml di cocktail Ab filtrato per bene remare 2). Fare riferimento alla Figura 1B per un contorno di mappa piatto suggerito. Ripetere questi aggiuntas per le righe sotto se più pannelli vengono eseguiti (qui, aggiungere 8 ml / pozzetto del cocktail Panel II alla riga 3 e 11 ml / pozzetto del cocktail Panel III a remare 4; fare riferimento a Materiali Lista per informazioni specifiche del pannello). </li><li> Utilizzando la pipetta multicanale, miscelare i campioni PPP in riga 1 su e giù e trasferire 100 ul dai pozzi in riga 1 per i pozzi in fila 2. Mescolare su e giù. Cambia suggerimenti e ripetere, trasferendo 100 ml dalla fila 1 alla fila 3 e 4. Incubare a 4 ° C per 30 minuti. </li></ol> 1.4) lavaggio MT Campioni <ol><li> Rimuovere la piastra a 96 pozzetti da 4 ° C e trasferimento in cella di sicurezza biologica. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 220 ml di PBS / bene alle righe 6-8 (da utilizzare per il risciacquo / lavaggio dei pozzetti contenenti macchiato PPP). </li><li> Trasferire il contenuto di ogni ben di tubi filtranti centrifughe pre-etichettati con la pipetta multicanale larghezza regolabile (per 12 campioni, con 3 pannelli di anticorpi, 12 x 3 = 36 tubi filtroessere necessario). Utilizzando gli stessi suggerimenti, togliere 200 ml di PBS dai filari di lavaggio e aggiungere ai pozzetti da cui PPP è stato appena rimosso. </li><li> Mescolare su e giù per sciacquare i pozzi e trasferire la soluzione di risciacquo per gli stessi filtri a cui il PPP è stato precedentemente aggiunto. Chiudi cime di filtri centrifughi. Cambia suggerimenti. </li><li> Ripetere questa operazione con i restanti campioni macchiati fino a quando tutti i campioni di PPP colorati sono stati trasferiti con le loro soluzioni di risciacquo ai filtri centrifughi. </li><li> Trasferire i filtri centrifughi ad una centrifuga rotore fisso e centrifugare a 850 xg per 3 min a RT. NOTA: Assicurarsi che rimanga liquido sulle cime del filtro. Dopo centrifugazione, il filtro deve apparire &quot;secco&quot; senza strato fluido rimanente visibile sulla parte superiore. Sebbene improbabile, alcuni campioni PPP possono richiedere un tempo più lungo per centrifugazione spostare efficacemente attraverso il filtro. </li><li> Rimuovere i tubi filtranti centrifughe e tornare alla cappa di sicurezza biologica.Utilizzando la pipetta multicanale, sospendere nuovamente le cime dei filtri in 300 ml di PBS. Trasferire il contenuto in sospensione al tubi pre-etichettati per l&#39;immediata analisi FCM. NOTA: E &#39;molto importante mantenere la forza e il numero di depressioni pipetta stantuffo coerenti tra campioni per evitare variazioni campione a campione. Questo dovrebbe idealmente essere fatto utilizzando una pipetta elettronico che è stato programmato per pipettare su e giù un volume specifico (ad esempio, 280 microlitri) un numero esatto di volte (ad esempio, 8 volte) per ogni campione. </li></ol> 1.5) Citometro Setup <ol><li> Aprire il software FCM. Prima di sperimentare l&#39;installazione, eseguire la calibrazione dello strumento quotidiano e configurazione utilizzando perline di impostazione strumento (seguendo le istruzioni del produttore). </li><li> Se i campioni EV sono state colorate con più di un anticorpo e molteplici fluorocromi sono da misurare contemporaneamente, calcolare valori di compensazione come segue: <ol><li> Aggiungere 2 gocce di sfere di compensazione di preTubi -labeled (1 tubo per ogni anticorpi coniugati a fluorocromi) e aggiungere la quantità raccomandata di anticorpi. Aggiungere 2 gocce di sfere di compensazione negativi a un altro tubo da utilizzare come il controllo di compensazione senza macchia. </li><li> Incubare a 4 ° C per 30 minuti, lavare con PBS e risospendere in 400 ml di PBS. </li><li> Utilizzando il citofluorimetro software fornito con lo strumento, eseguire ogni tubo di compensazione e regolare tensioni fluorescenti per posizionare ogni picco di circa 10 4 su una scala logaritmica 5-decade. Assicurarsi che il picco di fluorescenza è più elevata (più luminoso) in un proprio canale fluorescente rispetto a tutti gli altri canali, e regolare le tensioni di parametri fluorescenti di nuovo se necessario. Eseguire ogni tubo bozzetto singolarmente macchiato e catturare almeno 5.000 eventi per il tubo. </li><li> Selezionare &quot;Experiment&quot;, scheda e selezionare &quot;compensazione&quot;, quindi selezionare &quot;Calcola compensazione&quot; per applicare valori di compensazione per tutti i campioni. </li></ol></li><li&gt; Impostare la dispersione in avanti (FSC) e side scatter (SSC) parametri di tensione per accedere scala e selezionare le soglie più basse consentite dal citometro (FSC = 200 e SSC = 200) per ciascuna. </li><li> Durante l&#39;esecuzione di un tubo di 0,22 micron filtrata PBS, regolare le tensioni FSC e SSC per i valori più alti che escludono la maggior parte del rumore di fondo (cioè, appena sotto la soglia di tensione a cui tasso di eventi supera 5 eventi / sec). </li><li> Successivamente, eseguire una provetta contenente 0,2 micron - 1,0 micron perline, diluito in PBS, se necessario. In un FCS e SSC plot, disegnare un cancello intorno popolazione tallone per acquisire gli eventi tra 0,2 micron e 1,0 micron. In alternativa, in un istogramma SSC-H, disegnare un cancello per includere tutti gli eventi più piccoli rispetto ai 1,0 micron perline. </li><li> Impostare la portata del citometro a &quot;Lo&quot; (circa 8-12 ml / min). Usando il tubo perline (o altro tubo contenente una concentrazione nota di perline) regolare il selettore portata sul citometro fino alla vigiliatasso nt raggiunge circa 200 eventi / sec. Leggi tutte le provette dei campioni alla stessa velocità di flusso e utilizzare la stessa concentrazione tallone in esperimenti futuri per garantire che i flussi restano coerenti tra le esecuzioni. </li><li> Eseguire un tubo di particelle fluorescenti arcobaleno diluito in PBS. Acquisire 5.000 eventi. Registrare i valori di intensità media per FSC, SSC, e ciascun canale di colore. Utilizzare questi valori per regolare tensioni in esperimenti futuri per garantire che intensità di fluorescenza restano coerenti tra esperimenti. </li></ol> 1.6) lettura del campione <ol><li> Impostare la portata del citometro a &quot;Lo&quot; (circa 8-12 ml / min) ed eseguire ogni campione per esattamente 1 o 2 minuti. </li><li> Dopo la prima lettura, aggiungere 20 ml di 10% NP-40 per ciascun campione, pipetta su e giù, e rileggere per la stessa quantità di tempo (1 o 2 min) per consentire la sottrazione di eventi positivi rilevati in il campione lisato su un lasso di tempo uguali. NOTA: E &#39;estremamente important che i campioni essere miscelati utilizzando una pipetta piuttosto che un vortice. Nella nostra esperienza, vortex può provocare auto-aggregazione di alcuni anticorpi, portando a eventi positivi-EV imitando. </li><li> Una volta che tutti i campioni sono stati letti, esportare tutti i file .fcs in un file separato da utilizzare per ulteriori analisi utilizzando il software di analisi FCM. </li></ol> 1.7) Analisi dei dati <ol><li> Aprire il software di analisi FCM. Importare tutti i file .fcs in un nuovo file esperimento. </li><li> Aprire il perline solo tubo. Nel FSC-A vs SSC-A plot, disegnare un cancello intorno a tutte le perle di dimensioni tra 0,2 micron e 1,0 micron. Questa è la porta EV. Trascinate da aggiungere a tutti i campioni. </li><li> Utilizzando i campioni lisati come controlli negativi, elaborare porte sul bordo della fluorescenza di fondo in ciascun canale fluorescenza utilizzato. Trascinare cancelli fluorescenti nella gate EV di ogni campione non lisato corrispondente. NOTA: A questo punto è anche utile esaminare dual fluorescenti trame bi-parametri. Forme Rocket inil quadrante a doppio positivo (vedi figura 8), in particolare se i marcatori sono noti a risiedere in tipi di cellule indipendenti, possono essere indicativi di artefatto da aggregazione o altri eventi-vescicole imitando. </li><li> Per ciascun marcatore fluorescente, sottrarre il numero di eventi nel campione lisato dal numero di eventi nel campione non lisato. Facoltativamente, dividere questo numero per il numero totale di veicoli elettrici all&#39;interno del cancello non lisati EV per ottenere valori positivi%. </li></ol> 2. METODO B: Metodo Beads 2.1) Elaborazione di Campione di sangue / isolamento dei veicoli elettrici <ol><li> Fare riferimento al metodo di lavorazione del sangue descritto nel metodo A (sezione 1.1). </li></ol> 2.2) la preparazione dei campioni per l&#39;analisi <ol><li> Se lo si desidera, frazionare PPP o EV ultracentrifugato in esosomi e microvescicole. Aggiungere 250 ml di PPP o EV ultracentrifugato a 0.22 micron filtri centrifughi e trasferimento in una centrifuga del rotore fisso e far girare a 750 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. NOTA: Assicurarsi che rimanga liquido sulle cime del filtro. Dopo centrifugazione, il filtro deve apparire &quot;secco&quot; senza strato fluido rimanente visibile sulla parte superiore. Sebbene improbabile, alcuni campioni possono richiedere un tempo di centrifugazione leggermente più lungo per il fluido di muoversi efficacemente attraverso il filtro. </li><li> Lavare patinati 6 micron perle di polistirene (per esempio, perle negative ABC) 2x con i media RPMI e risospendere in 2 ml. Aggiungi 6.000 perline per ogni provetta FACS. Per la provetta di controllo negativo, aggiungere 400 ml di RPMI supporto solo ai talloni. Per tutti gli altri tubi, aggiungere 200 ml di PPP o di veicoli elettrici ultracentrifugato (o loro frazioni) e 200 ml di RPMI media. </li><li> Regolare il volume finale di tutte le provette a 400 microlitri con media e incubare una notte a 4 ° C su un agitatore. </li><li> La mattina dopo, lavare perline con 2 ml di media. Aspirare il surnatante. </li><li> Blocco con 5% di siero albumina bovina (BSA) in mezzi (400 ml) per 3 ore a 4 &amp;# 176; C su un agitatore. </li><li> Lavare perline con 2 ml di media. Aspirare e risospendere pellet in 100 ml di media. </li></ol> 2.3) I campioni di colorazione EV <ol><li> Filtrare tutti gli anticorpi. Utilizzare gli stessi pannelli di anticorpi utilizzati nel metodo A, o se desiderato, creare una diversa combinazione di anticorpi finché loro fluorocromi sono compatibili tra loro. </li><li> Combinare tutti gli anticorpi da utilizzare in un unico pannello in un tubo filtro centrifugo 0,22 micron. Centrifugare utilizzando un angolo fisso centrifuga singola velocità per 2 minuti o fino a quando tutta la miscela Ab è passato attraverso il filtro e nessun liquido anticorpi rimane sulla superficie del filtro. </li><li> Aggiungere il volume appropriato di cocktail di anticorpi filtrato a tutte le provette e incubare per 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Lavare perline con 2 ml di mezzi, risospendere in 400 ml di mezzi ed eseguire immediatamente (o entro il giorno stesso) sul citofluorimetro. </li></ol> 2.4) Cytometer Setup e Sample Reading<ol><li> Aprire il software FCM. Prima di sperimentare l&#39;installazione, eseguire la calibrazione dello strumento quotidiano e configurazione utilizzando perline di impostazione strumento (seguendo le istruzioni del produttore). </li><li> Se i campioni EV sono state colorate con più di un anticorpo e molteplici fluorocromi sono da misurare contemporaneamente, calcolare valori di compensazione come segue: <ol><li> Aggiungere 2 gocce di sfere di compensazione per i tubi pre-etichettati (1 tubo per ogni anticorpi coniugati a fluorocromi) e aggiungere la quantità raccomandata di anticorpi. Aggiungere 2 gocce di sfere di compensazione negativi a un altro tubo da utilizzare come il controllo di compensazione senza macchia. Incubare a 4 ° C per 30 minuti, lavare con PBS e risospendere in 400 ml di PBS. </li><li> Utilizzando il software FCM, eseguire ogni tubo di compensazione e regolare tensioni fluorescenti per posizionare ogni picco di circa 10 4 su una scala logaritmica 5-decade. Assicurarsi che il picco di fluorescenza è più elevata (più luminoso) in un proprio canale fluorescente rispetto a tutti gli altri canali, eregolare le tensioni di parametri fluorescenti nuovo se necessario. Eseguire ogni tubo bozzetto singolarmente macchiato e catturare almeno 5.000 eventi per il tubo. </li><li> Selezionare la scheda &quot;Experiment&quot;, quindi &quot;Compensation&quot;, poi &quot;Calcola compensazione&quot; per applicare valori di compensazione per tutti i campioni. </li></ol></li><li> Cambiare la FSC e parametri di tensione SSC per accedere scala e selezionare le soglie più basse consentite dal citometro (FSC = 200 e SSC = 200) per ogni. </li><li> Campioni Run, porta sulla popolazione perline singoletto e acquisire 2.000 eventi in questa porta. File di esportazione .fcs. </li><li> Utilizzare software di analisi FCM per analizzare .fcs file. Gate perline singoletto. Calcolare l&#39;intensità geometrica fluorescenza media (MFI) per ogni fluorocromo e confrontare con la MFI del controllo negativo. </li></ol>

<ol><li>Andaloussi, S., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).</li>
<li>Sugawara, A., Nollet, K. E., Yajima, K., Saito, S., Ohto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+platelet-derived+microparticle+formation--and+possible+side+effects-with+prestorage+leukofiltration+of+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Preventing platelet-derived microparticle formation--and possible side effects-with prestorage leukofiltration of whole blood.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 134 (5), 771-775 (2010).</li>
<li>Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (8), 581-593 (2009).</li>
<li>Mause, S. F., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microparticles+Protagonists+of+a+Novel+Communication+Network+for+Intercellular+Information+Exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Microparticles Protagonists of a Novel Communication Network for Intercellular Information Exchange.</a> Circulation Research. 107 (9), 1047-1057 (2010).</li>
<li>Bouvy, C., Gheldof, D., Chatelain, C., Mullier, F., Dogne, J. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributing+role+of+extracellular+vesicles+on+vascular+endothelium+haemostatic+balance+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Contributing role of extracellular vesicles on vascular endothelium haemostatic balance in cancer.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li>
<li>Hood, J. L., San, R. S., Wickline, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+Released+by+Melanoma+Cells+Prepare+Sentinel+Lymph+Nodes+for+Tumor+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Exosomes Released by Melanoma Cells Prepare Sentinel Lymph Nodes for Tumor Metastasis.</a> Cancer Research. 71 (11), 3792-3801 (2011).</li>
<li>Gatti, S., Bruno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvesicles+derived+from+human+adult+mesenchymal+stem+cells+protect+against+ischaemia-reperfusion-induced+acute+and+chronic+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology+Dialysis+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury.</a> Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).</li>
<li>Barteneva, N. S., Fasler-Kan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microparticles%3A+square+the+circle%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Circulating microparticles: square the circle.</a> BMC Cell Biology. 14 (1), 23(2013).</li>
<li>Van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+functions%2C+and+clinical+relevance+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Classification functions, and clinical relevance of extracellular vesicles.</a> Pharmacological Reviews. 64 (3), 676-705 (2012).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
<li>Dinkla, S., Brock, R., Joosten, I., Bosman, G. J. C. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway+to+understanding+microparticles%3A+standardized+isolation+and+identification+of+plasma+membrane-derived+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28London%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Gateway to understanding microparticles: standardized isolation and identification of plasma membrane-derived vesicles.</a> Nanomedicine (London, England). 8 (10), (2013).</li>
<li>Witwer, K. W., Buzas, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+sample+collection%2C+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li>
<li>Shah, M. D., Bergeron, A. L., Dong, J. -F., López, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+measurement+of+microparticles%3A+Pitfalls+and+protocol+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric measurement of microparticles: Pitfalls and protocol modifications.</a> Platelets. 19 (5), 365-372 (2008).</li>
<li>Dey-Hazra, E., Hertel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+circulating+microparticles+by+flow+cytometry%3A+influence+of+centrifugation%2C+filtration+of+buffer%2C+and+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+Health+and+Risk+Management%22%5BJournal%5D)">Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing.</a> Vascular Health and Risk Management. 6, 1125-1133 (2010).</li>
<li>Lacroix, R., Judicone, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+pre-analytical+variables+in+plasma+microparticle+determination%3A+results+of+the+International+Society+on+Thrombosis+and+Haemostasis+SSC+Collaborative+workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Standardization of pre-analytical variables in plasma microparticle determination: results of the International Society on Thrombosis and Haemostasis SSC Collaborative workshop.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (6), 1190-1193 (2013).</li>
<li>Mullier, F., Bailly, N., Chatelain, C., Chatelain, B., Dogné, J. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-analytical+issues+in+the+measurement+of+circulating+microparticles%3A+current+recommendations+and+pending+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Pre-analytical issues in the measurement of circulating microparticles: current recommendations and pending questions.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 693-696 (2013).</li>
<li>Peramo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+Characterization+of+Mouse+Deep+Vein+Thrombosis+Derived+Microparticles+by+Differential+Filtration+with+Nanopore+Filters%5BTitle%5D)+AND+%22Membranes%22%5BJournal%5D)">Physical Characterization of Mouse Deep Vein Thrombosis Derived Microparticles by Differential Filtration with Nanopore Filters.</a> Membranes. 2 (1), 1-15 (2012).</li>
<li>Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Factor+Activity+is+Increased+in+a+Combined+Platelet+and+Microparticle+Sample+from+Cancer+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+research%22%5BJournal%5D)">Tissue Factor Activity is Increased in a Combined Platelet and Microparticle Sample from Cancer Patients.</a> Thrombosis research. 122 (5), 604-609 (2008).</li>
<li>Rood, I. M., Deegens, J. K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+methods+for+isolation+of+urinary+microvesicles+to+identify+biomarkers+of+nephrotic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+international%22%5BJournal%5D)">Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome.</a> Kidney international. 78 (8), 810-816 (2010).</li>
<li>Van der Pol, E., Hoekstra, A. G., Sturk, A., Otto, C., van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+and+non-optical+methods+for+detection+and+characterization+of+microparticles+and+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+And+Haemostasis%3A+JTH%22%5BJournal%5D)">Optical and non-optical methods for detection and characterization of microparticles and exosomes.</a> Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 8 (12), 2596-2607 (2010).</li>
<li>György, B., Szabó, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles%2C+current+state-of-the-art%3A+emerging+role+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).</li>
<li>Miguet, L., Béchade, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Analysis+of+Malignant+B-Cell+Derived+Microparticles+Reveals+CD148+as+a+Potentially+Useful+Antigenic+Biomarker+for+Mantle+Cell+Lymphoma+Diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Proteomic Analysis of Malignant B-Cell Derived Microparticles Reveals CD148 as a Potentially Useful Antigenic Biomarker for Mantle Cell Lymphoma Diagnosis.</a> Journal of Proteome Research. 8 (7), 3346-3354 (2009).</li>
<li>Smalley, D. M., Root, K. E., Cho, H., Ross, M. M., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+discovery+of+21+proteins+expressed+in+human+plasma-derived+but+not+platelet-derived+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Proteomic discovery of 21 proteins expressed in human plasma-derived but not platelet-derived microparticles.</a> Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 67-80 (2007).</li>
<li>Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+Limitations+of+Microparticle+Measurement+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Thrombosis+and+Hemostasis%22%5BJournal%5D)">Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (08), 807-818 (2010).</li>
<li>Mobarrez, F., Antovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicolor+flow+cytometric+assay+for+measurement+of+platelet-derived+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">A multicolor flow cytometric assay for measurement of platelet-derived microparticles.</a> Thrombosis Research. 125 (3), e110-e116 (2010).</li>
<li>Van der Pol, E., van Gemert, M. J. C., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+vs.+swarm+detection+of+microparticles+and+exosomes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+And+Haemostasis%3A+JTH%22%5BJournal%5D)">Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry.</a> Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 10 (5), 919-930 (2012).</li>
<li>György, B., Szabó, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Flow+Cytometric+Assessment+Reveals+Distinct+Microvesicle+%28Cell-Derived+Microparticle%29+Signatures+in+Joint+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases.</a> PLoS ONE. 7 (11), e49726(2012).</li>
<li>György, B., Módos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+isolation+of+cell-derived+microparticles+are+compromised+by+protein+complexes+resulting+from+shared+biophysical+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Detection and isolation of cell-derived microparticles are compromised by protein complexes resulting from shared biophysical parameters.</a> Blood. 117 (4), e39-e48 (2011).</li>
<li>György, B., Pasztoi, M., Buzas, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response%3A+systematic+use+of+Triton+lysis+as+a+control+for+microvesicle+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Response: systematic use of Triton lysis as a control for microvesicle labeling.</a> Blood. 119 (9), 2175-2176 (2012).</li>
<li>Trummer, A., De Rop, C., Tiede, A., Ganser, A., Eisert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotype+controls+in+phenotyping+and+quantification+of+microparticles%3A+a+major+source+of+error+and+how+to+evade+it%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Isotype controls in phenotyping and quantification of microparticles: a major source of error and how to evade it.</a> Thrombosis Research. 122 (5), 691-700 (2008).</li>
<li>Shet, A. S., Aras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sickle+blood+contains+tissue+factor-positive+microparticles+derived+from+endothelial+cells+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes.</a> Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).</li>
<li>Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D. F., Joseph, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+majority+of+circulating+platelet-derived+microparticles+fail+to+bind+annexin+V%2C+lack+phospholipid-dependent+procoagulant+activity+and+demonstrate+greater+expression+of+glycoprotein+Ib%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib.</a> Thrombosis and Haemostasis. 103 (5), 1044-1052 (2010).</li>
<li>Nolte-’t Hoen, E. N. M., van der Vlist, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+flow+cytometric+analysis+of+nanosized+cell-derived+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology%2C+And+Medicine%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, And Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).</li>
<li>Van der Vlist, E. J., Nolte-’t Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li>
<li>Orozco, A. F., Lewis, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+circulating+microparticles+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A.+77+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma.</a> Cytometry Part A. 77 A. 77A (6), 502-514 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno alcun conflitto di interesse a divulgare.

Sono stati presentati due diversi protocolli per l&#39;isolamento, il trattamento e l&#39;analisi dei veicoli elettrici, utilizzando un rilevamento individuo o approccio basato bead-. Selezione del metodo più appropriato utilizzare non è sempre agevole e richiede una comprensione del campione in prova nonché le singole sottopopolazioni di interesse. Inoltre, la sensibilità del citometro utilizzato per l&#39;acquisizione deve essere considerato nella scelta del metodo più appropriato. Spesso non c&#39;è miglior protocoll...

Extracellulare vescicole (EV) sono piccoli, vescicole membrana derivata presenti nei fluidi corporei che sono altamente coinvolti nella comunicazione cellula-cellula e aiutano a regolare una vasta gamma di processi biologici. Analisi dei veicoli elettrici che utilizzano citometria a flusso (FCM) è notoriamente difficile a causa delle loro piccole dimensioni e la mancanza di popolazioni distinte positive per i marcatori di interesse. Metodi di analisi EV, mentre notevolmente migliorato nel corso dell&#39;ultimo decennio, sono ancora un work in progress. Purtroppo, non vi è alcun one-size-fits-all protocollo, e molti aspetti devono essere considerati nella determinazione del metodo più appropriato da utilizzare. Presentato qui sono diverse tecniche per i veicoli elettrici di trasformazione e di due protocolli per l&#39;analisi i veicoli elettrici utilizzando il rilevamento individuo o di un approccio basato tallone-. I metodi descritti qui assisterà con eliminando gli aggregati anticorpali trovano comunemente in preparazioni commerciali, aumentando il rapporto segnale-rumore, e cancelli impostazione in un f razionaleashion che riduce al minimo il rilevamento della fluorescenza di fondo. Il primo protocollo utilizza un metodo di rilevamento individuo che è particolarmente adatto per l&#39;analisi di un elevato volume di campioni clinici, mentre il secondo protocollo utilizza un approccio basato tallone a catturare e rilevare EVs piccole e exosomes. EV, noto anche come microparticelle, sono piccoli, vescicole membrana derivata presenti nei fluidi corporei che sono coinvolti nella comunicazione cellula-cellula e aiutano a regolare una vasta gamma di processi biologici 1. Attraverso l&#39;espressione di diversi marcatori di superficie e / o il trasferimento diretto di materiale biologico, i veicoli elettrici sono in grado di alterare la funzione delle cellule riceventi di giocare sia attivare o sopprimere ruoli nella comunicazione intercellulare 2-4. Clinicamente, veicoli elettrici di derivazione piastrinica sono noti per avere una forte attività anticoagulante 5, mentre altri hanno dimostrato di contribuire a una vasta gamma di condizioni, dalla promozione del tumore metastasis 6 per la protezione contro le malattie 7. Veicoli elettrici possono essere classificati in categorie più piccole di vescicole cellulari di derivazione, come esosomi e microvescicole (MV), a seconda delle loro dimensioni e il meccanismo di generazione 8. La nomenclatura di sottopopolazioni vescicole cellule derivate continua ad essere un argomento di dibattito in corso 8,9, tuttavia, esosomi sono generalmente descritti come piccoli, 40 a 100 particelle nm derivati ​​da fusione endosomal con la membrana plasmatica, mentre MV sono più grandi da 100 a 1.000 particelle nm formate versando della membrana plasmatica 10. Qui, il termine generico &quot;EV&quot; verrà utilizzato per riferirsi a tutti i tipi di vescicole biologici extracellulari rilasciate dalle cellule. Isolamento dei veicoli elettrici da sangue intero è una procedura a più fasi e molte variabili di elaborazione diversi hanno dimostrato di influenzare il contenuto EV, tra cui temperatura di conservazione e la durata 11,12, anticoagulante / conservante usato 13 eMetodo di centrifugazione utilizzato 14. La necessità di standardizzazione di queste variabili ha portato a raccomandazioni della Società Internazionale sulla Trombosi e lavorazione del sangue e isolamento EV comitato di normalizzazione (ISTH SSC) per la corretta Emostasi scientifici e le procedure di 15,16, ma non esiste alcun consenso tra i ricercatori sul protocollo ottimale utilizzare 12. La maggior parte d&#39;accordo, tuttavia, che le variabili pre-analitiche strettamente controllate sono cruciali per dati accurati e riproducibili. Per analizzare i veicoli elettrici, i ricercatori hanno utilizzato vari metodi, tra cui microscopia elettronica a trasmissione 17, microscopia elettronica a scansione 18,19, microscopia a forza atomica, luce dinamica spargendo 20,21 e occidentale blotting 22,23. Mentre FCM è il metodo di scelta per molti ricercatori 9,24 - 26 grazie alle sue elevate capacità di throughput, l&#39;analisi dei veicoli elettrici che utilizzano FCM è statonotoriamente difficile a causa delle loro dimensioni e la mancanza di discrete popolazioni positive 27-32. Rispetto alle analisi di cellule, la piccola dimensione delle EVs risultati in 1) meno fluorescenza emessa a causa del minor numero di antigeni per particella e 2) la fattibilità limitato di post-macchia di lavaggio, che è necessaria per ridurre fluorescenza di fondo. Sfide comuni tra i ricercatori sono i segnali derivanti da aggregati di immunoglobuline 27,28 e di auto-aggregazione di anticorpi 29. Inoltre, i lunghi tempi di lavorazione e lunghe procedure di lavaggio / isolamento utilizzati da molti dei protocolli attuali 33,34 richiedono impegni di tempo più giorni per analizzare un piccolo numero di campioni, rendendoli meno che ideale per applicazioni ad alta produttività. Alcuni ricercatori rinunciano una fase di lavaggio del tutto, rendendo utilizzati tradizionalmente controlli negativi FCM, come una fluorescenza meno (FMO) e isotipi anticorpali inutile per valutare con precisione bacfluorescenza kground 30. I nostri protocolli affrontano tre problemi comuni che possono impedire la corretta analisi FCM dei veicoli elettrici: segnali derivanti da aggregati di anticorpi e altri non-vescicole, difficoltà nel rimuovere l&#39;anticorpo non legato, e la mancanza di popolazioni positive distinguibili. Le tecniche qui descritte assisterà con eliminando gli aggregati anticorpali trovano comunemente in preparazioni commerciali, aumentando il rapporto segnale-rumore, e impostando cancelli in modo razionale che minimizza rilevamento di fluorescenza di fondo. Due diversi metodi di rilevamento sono presentati qui: il primo protocollo utilizza un metodo di rilevamento individuo che è particolarmente adatto per l&#39;analisi di un elevato volume di campioni clinici, mentre il secondo protocollo utilizza un approccio basato perline per catturare e rilevare EVs piccole e exosomes.

<table><tbody><tr><td>Citometro a flusso da banco LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>3-laser (20 mW Zaffiro coerente 488 nm blu, 25 mW Vioflame coerente 405 nm viola e 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm rosso)</td></tr><tr><td>Software FACS Diva&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>PC versione 6.0</td></tr><tr><td>FlowJo software&nbsp;</td><td>Treestar US</td><td></td><td>Mac versione 9.6.1 o PC versione 7.6.5</td></tr><tr><td>Sphero Rainbow particelle fluorescenti</td><td>BD Biosciences</td><td>556298</td><td>utilizzato per regolare tutte le tensioni dei canali per mantenere la coerenza dell'intensità della fluorescenza.</td></tr><tr><td>Particelle fluorescenti Ultra Rainbow&nbsp;</td><td>Spherotech</td><td>URFP-10-5</td><td>utilizzato in aggiunta alle perle Megamix-Plus SSC per garantire la coerenza del gating EV da lotto a lotto</td></tr><tr><td>Megmix-Plus SSC perline</td><td>Biocytex</td><td>7803</td><td>utilizzato per regolare le tensioni FSC e SSC per mantenere la coerenza tra le corse. Può anche essere utilizzato per monitorare la portata e regolare il quadrante della portata al fine di garantire che la stessa portata venga utilizzata in tutte le corse</td></tr><tr><td>Kit di perline anti-topo AbC</td><td>Life Technologies</td><td>A-10344</td><td>utilizzato per i controlli di compensazione e le perle AbC negative utilizzate per il metodo basato sulle perline</td></tr><tr><td>Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9)</td><td>Santa Cruz&nbsp;</td><td>SC-281108</td><td>utilizzato nel metodo di rilevamento individuale solo per lisare i campioni dopo la lettura iniziale per l'uso come controlli negativi. Il brodo può essere diluito a 1:10 in PBS e conservato in frigorifero per un massimo di 1 mese.</td></tr><tr><td>Provette BD TruCOUNT BD</td><td>Biosciences</td><td>340334</td><td>utilizzato ogni volta che sono necessarie concentrazioni assolute di EV</td></tr><tr><td>Ultrafree-MC, GV 0,22 e micro; m Unità di filtraggio centrifughe</td><td>Millipore&nbsp;</td><td>UFC30GVNB</td><td>utilizzato per il lavaggio post-colorazione delle vescicole extracellulari e/o per il frazionamento delle vescicole extracellulari in base alle dimensioni</td></tr><tr><td>Provette per sangue intero in vetro Vacutainer ACD-A</td><td>BD Biosciences</td><td>364606</td><td></td></tr><tr><td>Provette Facs 12x75 polistrene</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Serbatoi confezionati singolarmente</td><td>Puntali per pipette Phenix</td><td>RR-50-1s</td><td></td></tr><tr><td>Green-Pak - 10 &; l</td>. <td>Puntali per pipette Rainin</td><td>GP-L10S</td><td></td></tr><tr><td>Green-Pak -200 &; l&nbsp;</td><td>Puntali</td> per pipette Rainin <td>GP-L250S</td><td></td></tr><tr><td>Green -Pak - 1.000 &; l&nbsp;</td><td>Puntali Rainin</td><td>GP-L1000S</td><td></td></tr><tr><td>Stable Stack L300 presterilizzati</td><td>Rainin</td><td>SS-L300S</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite&nbsp;XLS 8 canali LTS&nbsp; Regolabile&nbsp; Distanziatore&nbsp;</td>Piastre per coltura tissutale a 96 pozzetti <td>Rainin</td><td>LA8-300XLS</td><td></td></tr><tr><td></td><td>E& K Scientific</td><td>EK-20180</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Terreni (senza Hepes)</td><td>Impianto di coltura cellulare UCSF</td><td>CCFAE001</td><td>terreni utilizzati per il metodo di rilevamento basato su microsfere</td></tr><tr><td>Dulbeccos PBS D-PBS, senza CaMg, 0,2 e micro; m filtrato</td><td>UCSF Impianto di coltura cellulare</td><td>CCFAL003</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per ultracentrifuga, parete sottile, ultra-trasparente</td><td>BECKMAN COULTER INC</td><td></td><td></td></tr> 344058 <tr><td>PANEL I</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD3 PerCP-Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>344808</td><td>2 &; l</td></tr><tr><td>CD14 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>301820</td><td>2 &micro; l</td></tr><tr><td>CD16 V450</td><td>BD Biosciences</td><td>560474</td><td>2 &micro; l</td></tr><tr><td>CD28 FITC</td><td>biolegend</td><td>302906</td><td>2 &micro; l</td></tr><tr><td>CD152 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>555855</td><td>2 &micro; l</td></tr><tr><td>CD19 A700</td><td>Biolegend</td><td>302226</td><td>2 &micro; l</td></tr><tr><td>PANNELLO II</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD41a PerCP-Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>340930</td><td>2 &micro; l</td></tr><tr><td>CD62L APC</td><td>Biolegend</td><td>304810</td><td>2 & micro; l</td></tr><tr><td>CD108 PE&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>552830</td><td>2 &; l</td></tr><tr><td>CD235a FITC</td><td>biolegend</td><td>349104</td><td>2 &micro; l</td></tr><tr><td>PANNELLO III</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>301322</td><td>2 &micro; l</td></tr><tr><td>CD62p APC</td><td>Biolegend</td><td>304910</td><td>2 &; l</td></tr><tr><td>CD66b PE&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>305106</td><td>2 &micro; l</td></tr><tr><td>CD15 FITC</td><td>exalpha</td><td>X1496M</td><td>5 &micro; l</td></tr><tr><td>CD9 PE</td><td>Biolegend</td><td>555372</td><td></td></tr><tr><td>CD63 APC</td><td>Biolegend</td><td>353008</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 Ms IgG2a, &kappa;</td><td>Bioleggenda</td><td>400230</td><td></td></tr></tbody></table>

tecniche per l&#39;analisi dei extracellulare vescicole citometria a flusso

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellulare vescicole (EV) sono piccoli, vescicole membrana derivata presenti nei fluidi corporei che sono altamente coinvolti nella comunicazione cellula-cellula e aiutano a regolare una vasta gamma di processi biologici. Analisi dei veicoli elettrici che utilizzano citometria a flusso (FCM) è notoriamente difficile a causa delle loro piccole dimensioni e la mancanza di popolazioni distinte positive per i marcatori di interesse. Metodi di analisi EV, mentre notevolmente migliorato nel corso dell&#39;ultimo decennio, sono ancora un work in progress. Purtroppo, non vi è alcun one-size-fits-all protocollo, e molti aspetti devono essere considerati nella determinazione del metodo più appropriato da utilizzare. Presentato qui sono diverse tecniche per i veicoli elettrici di trasformazione e di due protocolli per l&#39;analisi i veicoli elettrici utilizzando il rilevamento individuo o di un approccio basato tallone-. I metodi descritti qui assisterà con eliminando gli aggregati anticorpali trovano comunemente in preparazioni commerciali, aumentando il rapporto segnale-rumore, e cancelli impostazione in un f razionaleashion che riduce al minimo il rilevamento della fluorescenza di fondo. Il primo protocollo utilizza un metodo di rilevamento individuo che è particolarmente adatto per l&#39;analisi di un elevato volume di campioni clinici, mentre il secondo protocollo utilizza un approccio basato tallone a catturare e rilevare EVs piccole e exosomes.

<html> Figura 1 illustra lo schema di elaborazione globale per l&#39;isolamento e la rilevazione dei veicoli elettrici utilizzando sia il metodo basato bead-o metodo di rilevamento individuale. Rilevazione individuale dei veicoli elettrici che utilizzano FCM funziona bene per l&#39;analisi dei veicoli elettrici più grandi, ma la maggior parte dei citometri non sono in grado di rilevare singolarmente particelle piccolo come esosomi. Un approccio basato branello-permette piccoli EVs da rilevare, però, ci s...

Esistono molti metodi diversi per la misurazione delle vescicole extracellulari (EV) con citometria a flusso (FCM). Molti aspetti devono essere considerati nella determinazione del metodo più appropriato da utilizzare. Due protocolli per i veicoli elettrici di misurazione sono presentate, utilizzando il rilevamento individuo o di un approccio basato tallone-.

Tecniche per l&#39;Analisi dei extracellulare vescicole citometria a flusso

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare e analizzare la circolazione delle vescicole extracellulari nel sangue mediante due metodi diversi. Per il metodo di rilevamento delle singole vescicole extracellulari, il plasma povero di piastrine o PPP viene inizialmente isolato da un campione di sangue.Il PPP viene quindi colorato con gli anticorpi coniugati a fluorocromi di interesse. Per il metodo di rilevamento basato su microsfera, le vescicole extracellulari vengono incubate con microsfere e successivamente le vescicole legate alle microsfere vengono colorate con gli specifici anticorpi coniugati a fluorocromi. Alla fine, il contenuto di vescicole extracellulari circolanti può essere determinato analizzando i campioni mediante citometria a flusso.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la microscopia elettronica o la separazione con microsferette magnetiche è che è molto più rapida e consente la valutazione dell'intera popolazione extracellulare di escal, anziché essere limitata a specifiche sottopopolazioni. In generale, chi si approccia per la prima volta a questo metodo potrebbe incontrare difficoltà, poiché il successo della procedur

techniques-for-analysis-extracellular-vesicles-using-flow

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo video dimostra l'immunocattura di vescicole extracellulari utilizzando coniugati di nanoparticelle magnetiche con anticorpo di cattura marcati in fluorescenza. Il processo prevede la formazione di complessi, la colorazione con anticorpi di rilevamento marcati in fluorescenza, la separazione magnetica e l'analisi citofluorimetrica per la caratterizzazione antigenica.

Immunocattura e citometria a flusso di vescicole extracellulari per la caratterizzazione antigenica

I virus o le vescicole extracellulari sono stati immunocatturati con nanoparticelle magnetiche da 15 nm accoppiate ad anticorpi che riconoscono gli antigeni di superficie. I virioni o le vescicole catturati sono stati marcati con anticorpi fluorescenti contro altri antigeni di superficie. I complessi risultanti sono stati separati in un campo magnetico elevato e analizzati con citometri a flusso convenzionali attivati a fluorescenza.

Flusso Virometry per analizzare antigenica spettri di virioni e extracellulare vescicole

In questo protocollo, descriviamo il flusso di lavoro completo per rapido isolamento delle vescicole extracellulari da sangue umano intero e la caratterizzazione di marcatori specifici di analisi di fluorescenza-basata nanoparticle tracking. I risultati presentati mostrano un elevato livello di riproducibilità e possono essere regolati per i surnatanti di coltura cellulare.

Rapida caratterizzazione basata sulla fluorescenza delle singole vescicole extracellulari nel sangue umano con analisi Nanoparticle tracking

Il protocollo descrive un metodo riproducibile progettato per l'utilizzo con i surnatanti di coltura cellulare per rilevare superfici epitopi sulle piccole vescicole extracellulari (EV). Utilizza specifici EV immunoprecipitazione usando i branelli accoppiati con gli anticorpi che riconoscono l'antigene di superficie CD9, CD63 e CD81. Il metodo è ottimizzato per l'analisi di citometria a flusso a valle.

Analisi citofluorimetrica delle vescicole extracellulari dal supporto di cella-condizionato

L'ultima generazione di strumenti di caratterizzazione dei veicoli elettrici è in grado di eseguire l'analisi di singoli veicoli elettrici su più parametri contemporaneamente. La citometria a nano-flusso misura tutte le particelle biologiche più grandi di 45 nm senza etichettatura e identifica le caratteristiche specifiche delle sottopopolazioni mediante una varietà di tecniche di etichettatura fluorescente.

Caratterizzazione di proteine transmembrana di vescicole extracellulari singole mediante citometria a nano-flusso

Questo protocollo fornisce un metodo di isolamento rapido e specifico per le dimensioni delle piccole vescicole extracellulari ottimizzando le dimensioni dell'ugello di nebulizzazione dell'aria, la pressione del fluido della guaina, la pressione del flusso del campione, la tensione, il guadagno e i parametri di soglia di attivazione.

Ottimizzazione dei parametri di selezione citometrica a flusso per l'isolamento e la purificazione ad alta produttività di piccole vescicole extracellulari

In questo articolo, descriviamo un protocollo semplice che consente la valutazione in vitro dell'abbondanza di microRNA marcati con fluorescenza per studiare le dinamiche dell'impacchettamento e dell'esportazione dei microRNA in vescicole extracellulari (EV).

Monitoraggio del rilascio di miRNA nelle vescicole extracellulari utilizzando la citometria a flusso

Qui, dimostriamo il metodo di caratterizzazione delle vescicole extracellulari (EV) raccolte da fluidi biologici, come lacrime e saliva, di soggetti umani. Lo scanner utilizzato in questo metodo è in grado di rilevare il fenotipo, le dimensioni e il conteggio totale delle particelle delle vescicole extracellulari a partire da 1 μL del campione.

Caratterizzazione delle vescicole extracellulari da fluidi biologici

Un metodo efficace per ottenere altamente purificato frazioni praticabile meiotica da mouse testicolo è descritto, che unisce un raffinato cellulare dissociazione protocollo con fluorescenti separazione delle cellule attivate (FACS). Questo metodo sfrutta le differenze nel contenuto di DNA nucleare e la densità di discreta frazioni meiotico.

Purificazione Citometria a flusso di cellule di topo Meiotic

Il successo delle tinture di tracciamento cellulari per monitorare la funzione immunitaria e la proliferazione cellulare coinvolge diversi passaggi critici. Si descrivono metodi per: 1) ottenendo luminoso, uniforme, riproducibile etichetta-re con coloranti membrana; 2) selezionando fluorocromi e condizioni di acquisizione dati, e 3) la scelta di un modello per quantificare la proliferazione cellulare basata sulla diluizione colorante.

Ottimizzato Metodi di modellazione e colorazione proliferazione per il monitoraggio divisione cellulare utilizzando coloranti Tracking Cellulari

Impara due metodi per analizzare le vescicole extracellulari nel sangue mediante citometria a flusso: rilevamento individuale e approccio a basi di microsfere. Queste tecniche permettono di isolare e caratterizzare le EV con alta sensibilità.

Tecniche per l'Analisi dei extracellulare vescicole citometria a flusso

Esplora altri video