Tecniche per l'Analisi dei extracellulare vescicole citometria a flusso

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare e analizzare la circolazione delle vescicole extracellulari nel sangue mediante due metodi diversi. Per il metodo di rilevamento delle singole vescicole extracellulari, il plasma povero di piastrine o PPP viene inizialmente isolato da un campione di sangue.

Il PPP viene quindi colorato con gli anticorpi coniugati a fluorocromi di interesse. Per il metodo di rilevamento basato su microsfera, le vescicole extracellulari vengono incubate con microsfere e successivamente le vescicole legate alle microsfere vengono colorate con gli specifici anticorpi coniugati a fluorocromi. Alla fine, il contenuto di vescicole extracellulari circolanti può essere determinato analizzando i campioni mediante citometria a flusso.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la microscopia elettronica o la separazione con microsferette magnetiche è che è molto più rapida e consente la valutazione dell'intera popolazione extracellulare di escal, anziché essere limitata a specifiche sottopopolazioni. In generale, chi si approccia per la prima volta a questo metodo potrebbe incontrare difficoltà, poiché il successo della procedura richiede un rigoroso rispetto delle manovre dimostrate e dei parametri di impostazione del citometro. Per ottenere dati di alta qualità con minime variazioni da un giorno all'altro, iniziare centrifugando campioni di sangue intero per separare il plasma dal buffy coat e dai globuli rossi. Successivamente, trasferire aliquote di 1,2 millilitri del soprannatante plasmatico in provette da centrifuga da 1,5 millilitri, avendo cura di non disturbare gli strati inferiori contenenti il buffy coat e i globuli rossi; quindi centrifugare nuovamente il soprannatante per rimuovere eventuali piastrine e frammenti cellulari di grandi dimensioni.

Al termine della centrifugazione, trasferire con attenzione tutto tranne gli ultimi 200 microlitri dei campioni di PPP in nuove provette, avendo cura di non disturbare i pellet. Successivamente, miscelare il plasma su e giù per diverse volte e trasferire 320 microlitri di ciascun campione nella fila superiore di una piastra a 96 pozzetti. Per colorare i campioni, combinare gli anticorpi di interesse per ciascuno dei tre pannelli in singole provette centrifughe con filtro da zero virgola 22 micrometri e centrifugare gli anticorpi utilizzando una centrifuga a angolo fisso e velocità singola.

Una volta che tutto l'anticorpo è passato attraverso il filtro, aggiungere la quantità appropriata della miscela in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti come illustrato nella figura. Successivamente, utilizzare una pipetta multicanale per mescolare i campioni di PPP, quindi trasferire 100 microlitri di ciascun campione negli anticorpi della riga due. Mescolare nuovamente i campioni, cambiare le punte e trasferire 100 microlitri di campione in ciascuna delle successive due righe di anticorpi secondo necessità.

Per l'esperimento, dopo 30 minuti, incubare la piastra a quattro gradi Celsius aggiungendo 220 microlitri di PBS per pozzetto dalle righe sei a otto all'interno di una cappa biologica. Quindi, utilizzando una pipetta multicanale con larghezza regolabile, trasferire il contenuto di ogni pozzetto nel corrispondente tubo filtro centrifugo senza cambiare i puntali.

Utilizzare 200 microlitri di PBS da una delle righe di lavaggio per risciacquare le pozzette da cui i campioni sono stati appena rimossi. Successivamente, trasferire la soluzione di risciacquo sugli stessi filtri ai quali i campioni di PPP sono stati precedentemente aggiunti e chiudere i filtri centrifughi. Una volta che tutti i campioni di PPP colorati sono stati trasferiti insieme alle rispettive soluzioni di risciacquo, centrifugare i campioni in una centrifuga con rotore fisso.

Dopo la centrifugazione, assicurarsi che nessun liquido rimanga sulla parte superiore dei filtri. Quindi risospendere le parti superiori dei filtri in 300 microlitri di PBS e trasferire il contenuto risospeso in provette pre-etichettate per un'immediata analisi mediante citometria a flusso. Il lavaggio dei campioni colorati mediante filtri centrifughi migliora la separazione tra il segnale di fondo e quello dei marcatori positivi.

È importante notare, tuttavia, che alcune delle vescicole extracellulari più piccole, inclusi gli esosomi, possono essere perse attraverso i pori del filtro. Per analizzare i campioni, impostare innanzitutto i parametri di tensione dello scattering anteriore e laterale su scala logaritmica e selezionare le soglie più basse consentite dal citometro per ciascun parametro. Successivamente, durante l'analisi di un tubo contenente PBS filtrato con particelle da zero virgola 22 micrometri, regolare queste tensioni ai valori più alti che escludono la maggior parte del rumore di fondo. Quindi, analizzare un tubo contenente una miscela di microsfere di un micrometro e di dimensioni inferiori e tracciare una finestra intorno alla popolazione di microsfere in un grafico di scattering anteriore rispetto a quello laterale, in modo da includere tutti gli eventi al di sotto delle microsfere da un micrometro.

Ora impostare la portata del citometro su bassa e utilizzare le perle per regolare la manopola della portata del citometro alla frequenza di eventi desiderata. Successivamente, utilizzando un tubo di particelle fluorescenti multicolore diluite in PBS, acquisire 5.000 eventi, registrando l'intensità media dei valori dello scatter anteriore, dello scatter laterale e di ogni canale cromatico. Quando tutti i parametri sono stati impostati, eseguire ogni campione per esattamente uno o due minuti. Dopo aver completato la prima lettura per ogni tubo, aggiungere 20 microlitri di MP 40 al 10% in ciascun campione e rileggere i tubi per lo stesso intervallo di tempo, in modo da permettere la sottrazione degli eventi positivi rilevati nel campione lisato su un periodo di tempo equivalente.

Per rilevare le vescicole extracellulari mediante cattura su microsfera, iniziare lavando due volte le microsfere di polistirene non rivestite di sei micrometri con mezzo RPMI, seguito da risospensione in due millilitri dello stesso mezzo. Successivamente, aggiungere 6.000 microsfere a ciascun nuovo tubo FACS: al tubo di controllo negativo aggiungere 400 microlitri di mezzo, a tutti gli altri tubi aggiungere 200 microlitri di PPP o di vescicole extracellulari ottenute per ultracentrifugazione, come appropriato, e 200 microlitri di mezzo. Regolare il volume finale di ciascun tubo a 400 microlitri.

Con più mezzo. Incubare le provette tutta la notte a quattro gradi Celsius in agitazione. La mattina seguente, lavare le perle con due millilitri di mezzo.

Aspirare il soprannatante e bloccare qualsiasi legame non specifico con 400 microlitri di albumina sierica bovina al 5%, ponendo su agitatore a quattro gradi Celsius per tre ore. Dopo tre ore, lavare le perle con altri due millilitri di mezzo e risospendere i pellet in 100 microlitri di mezzo fresco. Filtrare ora gli anticorpi e aggiungere il volume appropriato di cocktail di anticorpi filtrato a ciascuna provetta; dopo 30 minuti a quattro gradi Celsius, lavare le perle con altri due millilitri di mezzo.

In questo momento risospendere i pellet in 400 microlitri di mezzo e analizzare immediatamente i campioni mediante citometria a flusso, regolando i parametri di diffusione anterograda interna alla soglia più bassa consentita dal citofluorimetro, come appena dimostrato. Infine, impostare il gate sulla popolazione di microsfere singole e acquisire 2000 eventi per campione. Sia i metodi di rilevamento individuali che quelli basati su microsfere possono essere utilizzati per rilevare la presenza di vescicole extracellulari nei campioni di PPP, come illustrato da questi grafici a dispersione. Per il saggio di rilevamento individuale, il controllo lisato viene utilizzato per impostare i gate per il corrispondente campione non elencato.

La maggior parte degli eventi dovrebbe rientrare nel gate dei vesicoli extracellulari. Ad esempio, in questa figura, questi grafici biparametrici mostrano il rilevamento dei marcatori CD108A e CD235A, due marcatori dei globuli rossi noti per coesistere sulle cellule. Come previsto, oltre la metà degli eventi positivi sui vesicoli extracellulari è positiva per entrambi i marcatori, mentre in questi grafici biparametrici, l'espressione dei due marcatori sui vesicoli extracellulari, noti per non coesistere sulle cellule, mostra popolazioni positive distinte e separate mediante il metodo di rilevamento basato su microsfere.

Non esiste separazione tra le popolazioni positive e negative e gli eventi compaiono nei quadranti doppiamente positivi, anche se normalmente non si trovano sullo stesso tipo di cellule, poiché entrambi i tipi di vescicole extracellulari si legano a una singola perla. Pertanto, i dati ottenuti con questo metodo vanno analizzati meglio utilizzando istogrammi sovrapposti ai dati del controllo negativo, osservando uno spostamento apparente nell'espressione del marcatore nei campioni con perle rispetto ai controlli, una volta acquisita padronanza della tecnica. Questa metodica può essere utilizzata per analizzare 12 campioni di sangue con tre pannelli di anticorpi in tre o quattro ore con il metodo di rilevamento individuale oppure in un giorno e mezzo con il metodo delle perle, se eseguita correttamente.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di essere coerenti nel trattamento di ogni campione, assicurandosi che la portata del citometro e le intensità fluorescenti siano state regolate correttamente all'inizio di ogni esperimento in modo da corrispondere alle impostazioni sperimentali del giorno precedente, specialmente quando si analizzano più campioni in diversi giorni.