Imaging tridimensionale e l'analisi dei mitocondri all'interno di fibre nervose umane Intraepidermal

L'obiettivo generale di questa tecnica di imaging e analisi è isolare informazioni specifiche da un segnale complesso. In particolare, questo protocollo descrive come visualizzare e quantificare i mitocondri nervo-specifici con altri mitocondri all'interno dell'epidermide. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurologia, ad esempio come si confrontano i mitocondri all'interno delle fibre nervose intraepidermiche di individui sani con i mitocondri nervo-specifici di pazienti con complicanze neurologiche.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che prendiamo un segnale complesso e ne estraiamo informazioni specifiche. Questo protocollo ci aiuta a isolare un segnale specifico, come il segnale in queste cannucce, dai segnali che le circondano. Prepararsi per la colorazione immunoistochimica a fluorescenza delle biopsie cutanee etichettando prima una piastra a 96 pozzetti secondo questo schema.

Quindi pipettare 150 microlitri di soluzione di potenziamento del segnale di riserva per ridurre il legame aspecifico degli anticorpi secondari in ciascun pozzetto della fila superiore. Preparare i pozzetti di risciacquo aggiungendo 150 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato 1x in ciascun pozzetto nelle file due e tre della piastra da 96 pozzetti. Quindi aggiungere 150 microlitri di soluzione bloccante al 5% di BSA nei pozzetti della quarta fila.

Diluire gli anticorpi primari PGP9.5 e PDH in 1.500 microlitri di soluzione di risciacquo all'1% di BSA e aggiungere 150 microlitri a ciascun pozzetto della quinta fila. Utilizzare un circuito di inoculazione per trasferire le sezioni nella soluzione di potenziamento del segnale nella prima riga. Una volta che le sezioni si trovano nella soluzione di anticorpi primari nella quinta fila, avvolgere strettamente la piastra con una pellicola di laboratorio per evitare l'evaporazione, quindi agitare i campioni su un bilanciere piatto a temperatura ambiente per un'ora.

Incubare con dondolo per una notte a quattro gradi Celsius. Iniziare il secondo giorno della procedura pipettando 150 microlitri di soluzione di risciacquo all'1% di BSA nei pozzetti nelle file sei, sette e otto della piastra a 96 pozzetti. Aggiungere gli anticorpi secondari coniugati con fluorofori a 1.500 microlitri di BSA all'1%.

Quindi pipettare 150 microlitri della soluzione di anticorpi secondari in ciascun pozzetto della fila nove. Sciacquare le sezioni passando attraverso i pozzi sei, sette e otto. Una volta che le sezioni si trovano nella soluzione di anticorpi secondari nella fila nove, avvolgere la piastra in parafilm e coprire con un foglio di alluminio per proteggere i segnali di fluorescenza.

Incubare con dondolo come prima. Il terzo giorno, pipettare 150 microlitri di PBS filtrato sterile nelle file 10, 11 e 12. Trasferire i campioni nella riga 10, quindi coprire la piastra con un foglio di alluminio.

Risciacquare per un'ora a temperatura ambiente con dondolo. Successivamente, preparare un vetrino da microscopio per il montaggio delle sezioni pipettando 50 microlitri di 1x PBS filtrato sul vetrino. Una volta completati i risciacqui, trasferire una sezione dalla fila 12 sul vetrino, quindi aggiungere una o due gocce di reagente di montaggio contenente DAPI direttamente sulla parte superiore della sezione.

Posizionare delicatamente un vetrino coprioggetto da microscopio da 50 mm x 24 millimetri 1,5 sulla sezione. Posizionare i vetrini al buio per una notte a temperatura ambiente per polimerizzare il supporto di montaggio prima di riporre o acquisire l'immagine dei vetrini. Scegliete l'obiettivo a immersione in olio 40X su un microscopio confocale a scansione laser invertita.

Seleziona i laser e i rilevatori appropriati per l'imaging dei nuclei, delle fibre nervose e dei mitocondri. Inserire i seguenti parametri di scansione nel software del microscopio, risoluzione dell'intensità a 12 bit, velocità di scansione di 500 Hertz con media di due fotogrammi e zoom di 2,2. Impostare il software del microscopio per ottimizzare la risoluzione laterale selezionando una risoluzione di scansione di 1024 per 1024.

Ottimizza la risoluzione assiale e il sezionamento ottico selezionando un'apertura confocale di un'unità d'aria con una dimensione del passo Z di 210 nanometri. Scansiona ogni segnale separatamente e regola la tensione e l'offset del rilevatore per rimuovere eventuali pixel sovra e sottosaturi. Attiva una scansione in tempo reale per il segnale nervoso e regola il controllo della messa a fuoco Z per trovare e impostare i piani focali superiore e inferiore nel software del microscopio che racchiudono il segnale nervoso all'interno della sezione di tessuto.

Scansiona l'ultima serie Z con la scansione sequenziale per eliminare la diafonia del segnale di fluorescenza. Isolare l'epidermide dallo strato corneo e dal derma disegnando una regione attorno all'epidermide utilizzando uno strumento di selezione su un'immagine duplicata dell'immagine originale. Quindi ritaglia l'immagine in base alla selezione.

Calcola le funzioni di diffusione dei punti per i segnali confocali a fluorescenza verde e rossa utilizzando la funzione di calcolo della funzione di diffusione. Quindi impostare i parametri per l'indice di rifrazione medio per l'olio a 1,515 e l'apertura numerica per l'obiettivo dell'olio 40X a 1,25. Imposta il foro stenopeico del rivelatore su un'unità d'aria e scegli una lunghezza d'onda di eccitazione laser.

Utilizzare il ripristino iterativo impostato su 100% di confidenza, il limite di iterazione di 10 cicli e le PSF verdi e rosse per la deconvulazione dei segnali di fluorescenza verde e rosso. Utilizzare lo strumento Crea superficie per creare una superficie attorno ai segnali nervosi deconvoluti selezionando deseleziona la funzione liscia, l'intensità assoluta per la soglia, una soglia inferiore di 3.000 e una soglia superiore di 65.535. Mantieni le superfici sopra i 10 voxel.

Rimuovere le superfici non nervose utilizzando la scheda di modifica nella superficie nervosa per selezionare singole superfici non nervose oppure tenere premuto il tasto Ctrl per selezionare più superfici non nervose. Eliminate le superfici non nervose selezionate premendo il pulsante Elimina. Utilizzare la scheda di modifica nella superficie nervosa e premere il pulsante maschera tutto nelle proprietà della maschera.

Nella nuova finestra, selezionare i mitocondri del canale cinque deconvoluti sotto la selezione del canale e quindi selezionare il canale duplicato prima di applicare la maschera. Premere il pulsante di opzione per costante interno/esterno e controllare la superficie esterna dei voxel impostata su 0.0 e premere il pulsante OK. Infine, crea superfici specifiche per i mitocondri utilizzando lo strumento Crea superficie per creare una superficie attorno ai segnali mitocondriali deconvoluti mascherati selezionando Deseleziona funzione liscia e utilizzando la sottrazione dello sfondo per la soglia.

Impostare il diametro della sfera più grande a 1,50 micrometri, la soglia inferiore a 2.000 e la soglia superiore a un massimo di 65.535. Assicurati di mantenere le superfici al di sopra di 1,0 voxel. Questa immagine rappresentativa al microscopio confocale 3D illustra il segnale di fluorescenza verde specifico del nervo.

Viene creata una superficie 3D mostrata in ciano per il segnale nervoso. Quindi il segnale mitocondriale specifico del nervo viene isolato dal resto dei segnali mitocondriali epidermici utilizzando la superficie nervosa come strumento di mascheramento. Il segnale di fluorescenza rosso mitocondriale specifico per il nervo viene utilizzato per creare superfici mostrate come magenta attorno ai mitocondri all'interno della superficie nervosa che è mostrata in ciano.

Ciò consente di vedere in dettaglio i mitocondri nelle fibre nervose. Qui, i dati della superficie mitocondriale sono presentati come un istogramma della frequenza dimensionale per visualizzare la percentuale di mitocondri presenti in ciascuna delle varie curve in base al loro volume. Durante il tentativo di questa procedura, è importante prendersi cura del tessuto durante il processo di colorazione per assicurarsi che il tessuto sia completamente immerso nelle soluzioni per fornire una colorazione uniforme e coerente in tutte le sezioni.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare e quantificare i mitocondri all'interno delle fibre nervose intraepidermiche umane. Il nostro protocollo dettagliato è stato progettato per insegnare ad altri ricercatori come colorare, visualizzare, elaborare e analizzare le biopsie cutanee umane con l'obiettivo di comprendere i meccanismi alla base della patogenesi delle malattie neurologiche su base mitocondriale come la neuropatia.