Imaging tridimensionale e l'analisi dei mitocondri all'interno di fibre nervose umane Intraepidermal

L'obiettivo generale di questa tecnica di imaging e analisi è isolare informazioni specifiche da un segnale complesso. In particolare, questo protocollo descrive come visualizzare e quantificare i mitocondri specifici dei nervi insieme ad altri mitocondri all'interno dell'epidermide. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della neurologia, ad esempio come i mitocondri presenti nelle fibre nervose intraepidermiche di individui sani si confrontano con i mitocondri specifici dei nervi di pazienti con complicanze neurologiche.

Il principale vantaggio di questa tecnica è che permette di prendere un segnale complesso ed estrarre informazioni specifiche da esso. Questo protocollo ci aiuta a isolare un segnale specifico, come il segnale presente in queste pagliuzze, dai segnali circostanti. Prepararsi alla colorazione di immunofluorescenza per istochimica su biopsie cutanee etichettando innanzitutto una piastra a 96 pozzetti secondo lo schema indicato.

Quindi pipettare 150 microlitri di soluzione stock di potenziatore del segnale per ridurre il legame non specifico degli anticorpi secondari in ciascun pozzetto della prima riga. Preparare i pozzetti di risciacquo aggiungendo 150 microlitri di soluzione salina fosfato 1x tamponata in ciascun pozzetto delle righe due e tre della piastra a 96 pozzetti. Successivamente, aggiungere 150 microlitri di soluzione bloccante BSA al 5% nei pozzetti della riga quattro.

Diluire gli anticorpi primari PGP9.5 e PDH in 1.500 microlitri di soluzione di risciacquo contenente 1% di BSA e aggiungere 150 microlitri in ciascun pozzetto della riga cinque. Utilizzare un’ansa di inoculazione per trasferire le sezioni nella soluzione di potenziamento del segnale presente nella riga uno. Una volta che le sezioni si trovano nella soluzione con anticorpo primario nella riga cinque, avvolgere accuratamente la piastra con pellicola da laboratorio per prevenire l'evaporazione, quindi agitare i campioni su un agitatore orizzontale a temperatura ambiente per un'ora.

Incubare con agitazione durante la notte a quattro gradi Celsius. Iniziare il secondo giorno della procedura pipettando 150 microlitri di soluzione di lavaggio al 1% di BSA nei pozzetti delle righe sei, sette e otto della piastra a 96 pozzetti. Aggiungere gli anticorpi secondari marcati con fluorocromo a 1.500 microlitri di BSA al 1%.

Quindi pipettare 150 microlitri di soluzione di anticorpo secondario in ciascun pozzetto della riga nove. Lavare i campioni passandoli attraverso i pozzetti sei, sette e otto. Una volta che i campioni si trovano nella soluzione di anticorpo secondario nella riga nove, avvolgere la piastra con parafilm e coprirla con carta d'alluminio per proteggere i segnali di fluorescenza.

Incubare con agitazione come in precedenza. Al terzo giorno, pipettare 150 microlitri di PBS 1x sterile filtrato nelle righe 10, 11 e 12. Trasferire i campioni nella riga 10, quindi coprire la piastra con pellicola di alluminio.

Risciacquare per un'ora a temperatura ambiente con movimento oscillante. Successivamente, preparare un vetrino per il montaggio delle sezioni pipettando 50 microlitri di PBS 1x filtrato sul vetrino. Al termine dei risciacqui, trasferire una sezione dalla riga 12 sul vetrino, quindi aggiungere una o due gocce di reagente di montaggio contenente DAPI direttamente sopra la sezione.

Posizionare delicatamente un coprioggetto di vetro microscopico 1.5 di 50 millimetri per 24 millimetri sulla sezione. Lasciare le preparazioni in oscurità tutta la notte a temperatura ambiente per far indurire il mezzo di montaggio prima di conservarle o acquisirne le immagini. Selezionare l'obiettivo ad immersione in olio da 40X su un microscopio confocale a scansione laser invertito.

Selezionare i laser e i rivelatori appropriati per l'immagine dei nuclei, delle fibre nervose e dei mitocondri. Inserire i seguenti parametri di scansione nel software del microscopio: risoluzione di intensità a 12 bit, velocità di scansione di 500 Hertz con media su due fotogrammi e ingrandimento di 2,2. Impostare il software del microscopio per una risoluzione laterale ottimizzata selezionando una risoluzione di scansione di 1024 per 1024.

Ottimizzare la risoluzione assiale e la sezione ottica selezionando un'apertura confocale di un'unità d'aria con un passo Z di 210 nanometri. Scansionare ciascun segnale separatamente e regolare la tensione e l'offset del rivelatore per eliminare eventuali pixel sovra- o sotto-saturi. Attivare una scansione in tempo reale per il segnale del nervo e regolare il controllo dello fuoco Z per individuare e impostare i piani focali superiore e inferiore nel software del microscopio, in modo da comprendere il segnale del nervo all'interno della sezione di tessuto.

Scansionare la serie Z finale con scansione sequenziale per eliminare il crosstalk del segnale di fluorescenza. Isolare l'epidermide dallo strato corneo e dal derma disegnando una regione attorno all'epidermide utilizzando uno strumento di selezione su un'immagine duplicata dell'immagine originale. Quindi ritagliare l'immagine in base alla selezione.

Calcolare le funzioni di dispersione del punto per i segnali confocali della fluorescenza verde e rossa utilizzando la funzione calcola funzione di dispersione. Impostare quindi i parametri per l'indice di rifrazione del mezzo per l'olio a 1,515 e l'apertura numerica per l'obiettivo a olio 40X a 1,25. Impostare il pinhole del rivelatore a un'unità aria e scegliere la lunghezza d'onda di eccitazione del laser.

Utilizzare il ripristino iterativo impostato al 100% di confidenza, con un limite di iterazione di 10 cicli, e le PSF verdi e rosse per la deconvoluzione dei segnali di fluorescenza verde e rosso. Utilizzare lo strumento di creazione superficie per generare una superficie intorno ai segnali nervosi deconvoluti, selezionando l'opzione di non levigare la caratteristica, intensità assoluta per la soglia, una soglia inferiore di 3.000 e una soglia superiore di 65.535. Mantenere le superfici superiori a 10 voxel.

Rimuovere le superfici non nervose utilizzando la scheda modifica nella superficie nervosa per selezionare singole superfici non nervose oppure tenere premuto il tasto Control per selezionarne più di una. Eliminare le superfici non nervose selezionate premendo il pulsante Cancella. Utilizzare la scheda modifica nella superficie nervosa e premere il pulsante maschera tutto nelle proprietà della maschera.

Nella nuova finestra, selezionare il canale cinque dei mitocondri deconvoluti nella selezione del canale, quindi selezionare la duplicazione del canale prima di applicare la maschera. Premere il pulsante radio per costante interno/esterno e selezionare l'opzione imposta i voxel all'esterno della superficie a 0,0, quindi premere il pulsante OK. Infine, creare superfici specifiche per i mitocondri utilizzando lo strumento di creazione superficie, generando una superficie attorno ai segnali mitocondriali deconvoluti e mascherati, deselezionando la funzione di levigatura e utilizzando la sottrazione del fondo per la soglia.

Impostare il diametro della sfera più grande a 1,50 micrometri, la soglia inferiore a 2.000 e la soglia superiore al valore massimo di 65.535. Assicurarsi di mantenere le superfici superiori a 1,0 voxel. Questa immagine rappresentativa di microscopia confocale 3D illustra il segnale di fluorescenza verde specifico per il nervo.

Viene creata una superficie 3D mostrata in ciano per il segnale nervoso. Successivamente, il segnale mitocondriale specifico per il nervo viene isolato dal resto dei segnali mitocondriali epidermici utilizzando la superficie del nervo come strumento di mascheratura. Il segnale di fluorescenza rosso mitocondriale specifico per il nervo risultante viene utilizzato per creare superfici mostrate in magenta attorno ai mitocondri all'interno della superficie nervosa, che è mostrata in ciano.

Questo permette di visualizzare in dettaglio i mitocondri nelle fibre nervose. Qui, i dati sulla superficie mitocondriale sono presentati come un istogramma di frequenza dimensionale per mostrare la percentuale di mitocondri presenti in ciascuna delle diverse curvature in base al loro volume. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale prestare attenzione al tessuto durante il processo di colorazione, assicurandosi che il tessuto sia completamente immerso nelle soluzioni per garantire una colorazione uniforme e costante in tutte le sezioni.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare e quantificare i mitocondri all'interno delle fibre nervose intraepidermiche umane. Il nostro protocollo dettagliato è stato progettato per insegnare ad altri ricercatori come colorare, acquisire immagini, elaborare e analizzare biopsie cutanee umane con l'obiettivo di comprendere i meccanismi alla base della patogenesi delle malattie neurologiche mitocondriali, come la neuropatia.