Visualizzazione del endosome Dynamics in Vivere terminazioni nervose con quattro-dimensionale imaging di fluorescenza

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare accuratamente gli endosomi nello spazio tridimensionale nel tempo o in quattro dimensioni. Ciò si ottiene sezionando prima i muscoli del serpente e sistemando il tessuto nel piatto di imaging. Il secondo passo consiste nel colorare il tessuto con coloranti vitali per stimolare la formazione di endosomi.

Successivamente, la preparazione viene visualizzata in quattro dimensioni per una o più giunzioni neuromuscolari. Il passo finale è un'attenta analisi dei dati per caratterizzare il comportamento dei macro endosomi. In definitiva, la presenza e il movimento degli endosomi nel tempo all'interno dello spazio presinaptico possono essere dimostrati mediante imaging a fluorescenza quadridimensionale.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che il muscolo addominale del serpente ha uno spessore di una sola fibra, il che consente di generare immagini di alta qualità utilizzando la microscopia a epifluorescenza standard. Il tessuto rettiliano deve essere mantenuto a basse temperature, in modo che rimanga fisiologico per tempi più lunghi e con una minore contaminazione batterica. Per la colorazione del colorante vitale lisosomiale, il colorante viene sciolto da uno a 5.000 in una soluzione fredda di ringers rettiliani.

Per ottenere una concentrazione finale di 0,2 micromolari, aggiungere il colorante al tessuto e incubare a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Dopo 15 minuti, lavare più volte il fazzoletto con suonerie fredde per tutte le colorazioni FM 1 43. Premontare il campione in una capsula di imaging con pin magnetici prima della colorazione.

Ai fini di questo video, verrà dimostrata solo la colorazione FM 1 43 mediante stimolazione con cloruro di potassio. Il colorante diluito da uno a 500 in ringer ad alto contenuto di cloruro di potassio per ottenere una concentrazione finale di sette micromolari viene aggiunto al tessuto, quindi il tessuto viene incubato a quattro gradi Celsius per un massimo di 30-60 secondi. Successivamente, lavare velocemente tre volte con suonerie fredde per circa un minuto per risciacquo.

Tutti i tessuti devono essere sottoposti a imaging il prima possibile dopo essere stati colorati e lavati con una soluzione di suoneria fredda. Se si utilizza un microscopio invertito, utilizzare una camera di imaging il cui fondo contiene un sottile vetrino coprioggetto rotondo. In genere, la camera di imaging dovrebbe avere un fondo sottile in acciaio inossidabile con un diametro di 25 millimetri.

Vetrino di vetro di spessore numero uno al centro per configurare la preparazione per l'imaging. Orientarlo utilizzando perni magnetici in modo che il muscolo sia centrato il più possibile all'interno del piatto di imaging e sdraiato il più piatto possibile. Coprire la preparazione con un piccolo volume di soluzione di suoneria.

Montare il piatto, posizionandolo il più vicino possibile al centro del palco. Scegli un obiettivo appropriato per ottenere la massima risoluzione 3D possibile. Un obiettivo d'acqua 63 x sarà utilizzato per tutti gli esperimenti di questa dimostrazione.

Per iniziare questa procedura, aprire la finestra di imaging nel Catalogo 5.0. Diversi menu sono contenuti qui in schede. Scegli l'obiettivo 63 x acqua utilizzando la seconda scheda Z.Imposta l'intervallo di impilamento Z.

In questo esempio, per l'imaging dal vivo viene utilizzato un passo Z di 1,5 micron. Seleziona la frequenza dei fotogrammi time-lapse. Una velocità ottimale è quella che è appena sufficiente a risolvere senza problemi i cambiamenti nel tempo, come le interazioni di movimento o gli eventi di fusione.

Ad esempio, 10 punti temporali a intervalli di 32 per un intervallo di tempo totale di cinque minuti. Quindi, seleziona la profondità di campo totale mentre visualizzi il terminale con messa a fuoco manuale in tempo reale nella parte superiore del fuoco di interesse, quindi vai un po' al di sopra di essa. Seleziona set top.

Metti a fuoco lentamente il campione fino a quando tutto non è sfocato. Anche in questo caso, il numero di aerei e i valori di corsa totali visualizzati indicheranno la profondità di campo selezionata nella finestra di acquisizione. Selezionare il pulsante di opzione utilizzato in alto e in basso per trasferire i parametri appena selezionati Per l'acquisizione dell'immagine, avviare l'acquisizione dell'immagine.

Completa tutte le immagini dal vivo per una particolare preparazione. Conserva tutti i file di dati grezzi mentre l'archiviazione digitale di solito non è un problema. Il tempo di elaborazione è significativo anche con personal computer o workstation veloci.

Per questo motivo, il ritaglio delle immagini in un'area di interesse garantisce che l'intera area di interesse si trovi nella finestra ritagliata per tutto il tempo. Il corso D può coinvolgere pile di immagini utilizzando software appropriati e la corretta funzione di diffusione dei punti, confermare che la risoluzione è migliorata e che nessun artefatto è stato generato dall'algoritmo di deconvoluzione. Utilizzare un algoritmo di interpolazione per espandere l'asse Z.

Risoluzione apparente, si suggerisce un'espansione di sei volte da una separazione del piano dell'immagine di 1,5 micron a una separazione apparente di 0,25 micron. Esegui la luminosità del contrasto, il filtro del rumore, lo sbiancamento delle foto e altre regolazioni tipiche dell'elaborazione delle immagini. Se lo si desidera.

Gli standard di manipolazione delle immagini impongono che per la maggior parte del lavoro scientifico, sia appropriato che le stesse correzioni vengano applicate a tutte le immagini sia all'interno di una pila che in momenti diversi. La conseguenza di una particolare regolazione dovrebbe essere valutata tra tutte le immagini. Sperimenta varie tecniche di filtraggio e miglioramento delle immagini.

Ad esempio, lelos e il filtraggio sono utili per aumentare il contrasto di piccole strutture sopra lo sfondo. La luminosità dei pixel al centro di una finestra in esecuzione viene migliorata, mentre la luminosità delle aree circostanti viene ridotta. Si noti che alcuni metodi di filtraggio non funzionano bene in combinazione.

Applicare la correzione della deriva se si verifica un movimento sostanziale della preparazione nel tempo. Tale movimento è comune nel muscolo vivente, anche con l'aggiunta di farmaci per sopprimere i potenziali d'azione e i potenziali sinaptici. Un algoritmo di registrazione dei pixel allinea le immagini time lapse e può ridurre, ma di solito non eliminare completamente tale movimento.

In questo studio, è stata utilizzata l'imaging dal vivo di quattro D dei terminali neuromuscolari del serpente per determinare se i macro endosomi o me si spostano verso la membrana plasmatica e scompaiono rapidamente, suggerendo che il loro numero diminuisce perché alcuni di essi accedono al cito. I dati vengono visualizzati come viste volumetriche 3D in sei punti temporali con un intervallo di fotogrammi di 60 secondi. Per illustrare la profondità Z di un singolo butone, si può osservare un me che si allontana dall'asse Y indicato dalla linea tratteggiata rossa su diversi fotogrammi prima di scomparire tra i punti temporali cinque e sei, che il tempo richiesto per la scomparsa era inferiore all'intervallo di fotogrammi è coerente con l'esocitosi appena prima della scomparsa.

La ME sembra essere localizzata sulla membrana plasmatica dei bastoni. Lo stesso set di dati non elaborato viene mostrato successivamente come un filmato a un ingrandimento inferiore. La sequenza viene brevemente messa in pausa all'inizio di ogni 24 passaggi di rotazione 3D attorno all'asse Y per attirare l'attenzione sulla me che presto scomparirà indicata dalla freccia rossa.

Si noti che il ME è visibile, si avvicina al bordo del buton scompare e non ritorna in tutte le prospettive di visualizzazione. A causa della risoluzione dell'asse Z inferiore rispetto alla risoluzione XY, la forma del ME sembra allungarsi e accorciarsi a seconda della prospettiva di visione. Gli studi di microscopia elettronica hanno dimostrato che gli endosomi nei terminali dei motori sono di piccole dimensioni vicino al limite di diffrazione della luce.

Quindi, la fusione di questi endosomi non può essere assolutamente distinta da una stretta associazione spaziale a livello di luce. In questo studio, i Mee sono stati marcati con FM 1 43 indicato in verde e gli endosomi acidi o AE sono stati marcati con un lisosomia. I coloranti vitali indicati in rosso i dati da un punto temporale di un filmato a quattro D vengono visualizzati come viste del volume 3D in tre orientamenti.

I pannelli superiori da uno a tre mostrano la vista convenzionale dall'alto del piano XY. I pannelli centrali da quattro a sei mostrano una vista perpendicolare al piano XY e nella direzione della grande freccia rossa. I pannelli inferiori da sette a nove mostrano una vista reciprocamente perpendicolare a entrambe le viste superiori nella direzione della grande freccia blu.

Un me è contrassegnato da una freccia verde e due AE sono contrassegnati da frecce rosse. Le strutture che apparivano fluorescenti in entrambi i colori gialli sono state occasionalmente notate in quattro registrazioni di immagini D. In questo esempio, un endosoma contenente entrambi i coloranti è contrassegnato da una freccia gialla nei pannelli tre, sei e nove.

La sovrapposizione di rosso e verde è ugualmente completa in tutte e tre le proiezioni ortogonali che indicano un putativo em me ae fuso. Questo filmato mostra lo stesso set di dati configurato per ruotare sull'asse Y a un fotogramma al secondo. La putativa MEAE fusa rimane gialla da tutte le prospettive.

La deconvoluzione digitale è uno strumento utile per migliorare la risoluzione delle immagini 3D e quattro D. Di seguito viene mostrato un confronto tra i dati grezzi e i dati decentrati. Per un tipico terminale nervoso di serpente colorato durante la stimolazione con FM 1 43 Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 30-60 minuti se eseguita correttamente.

A seguito di questa procedura, possono essere eseguite altre metodiche come l'immunoistochimica per rispondere a ulteriori domande, come la colocalizzazione dei macro endosomi con i marcatori presinaptici.