Name: Visualizzazione del endosome Dynamics in Vivere terminazioni nervose con quattro-dimensionale imaging di fluorescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-16T16:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Scopri la dinamica degli endosomi nelle terminazioni nervose viventi utilizzando l'imaging a fluorescenza tridimensionale nel tempo. Questo metodo consente di osservare fusione ed esocitosi endosomiale.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health di Grant NS-024572 (da RSW).

1. Colorare la preparazione con sopravitale Coloranti <ol><li> Per il protocollo dissezione serpente giarrettiera vedere Stewart et al. 5 e Teng et al. 6 tessuto Reptilian resta fisiologica per tempi più lunghi, e con meno contaminazione batterica, conservato a basse temperature (vedi sotto). Tessuti di mammiferi, di solito è mantenuta a temperatura ambiente o superiore. </li><li> Per lisosomiale colorante vitale colorazione, sciogliere il colorante in rettili freddi 1:5.000 soluzione Ringers (0,2 micron). Incubare a 4 ° C per 15 min. Lavare più volte con Ringers freddi. Immagine appena possibile. </li><li> Per FM1-43 colorazione utilizzando la stimolazione KCl, diluire il colorante in alto KCl Ringers 1:500 (7 micron). Incubare a 4 ° C per 30-60 sec massimo. Lavare rapidamente tre volte con Ringers fredde, ~ 1 min / risciacquo. Immagine appena possibile. </li><li> Per FM1-43 colorazione utilizzando la stimolazione ipertonica (saccarosio), diluire il colorante in 0,5 M Ringers saccarosio come sopra. Incubare a 4 &amp; #176, C per 2-5 min. Lavare come al punto 1.3 con Ringers freddi. Immagine appena possibile. </li><li> Per FM1-43 colorazione tramite stimolazione elettrica, vedere Teng et al. 6 Brevemente, la preparazione è posto un recipiente contenente soluzione salina fisiologica e il colorante. Il nervo viene stimolato con un treno programmato di 200 msec impulsi rettangolari (~ 7 V, 30 Hz, 18 msec). Lavare come al punto 1.3 con Ringers freddi. Immagine appena possibile. </li></ol> 2. Configurare la preparazione di Imaging <ol><li> Orientare la preparazione in modo che le strutture di interesse siano il più vicino possibile all&#39;obiettivo microscopio. </li><li> Se viene utilizzato un microscopio invertito, utilizzare una camera il cui fondo contiene un sottile giro copertura di slittamento. Tipicamente, la camera di imaging dovrebbe avere un fondo sottile in acciaio inossidabile con un diametro # 1 vetro spessore copertura antiscivolo 25 mm a centro. Se viene utilizzato un microscopio verticale, un coprioggetto inferiore non è necessaria ma è utileper consentire di imaging con luce trasmessa (ad esempio il contrasto di interferenza differenziale, DIC) per orientare il campione e localizzare oggetti di interesse. </li><li> Scegliere un obiettivo appropriato per ottenere la massima risoluzione 3D possibile. Ci sono dei compromessi tra apertura numerica (na), distanza di funzionamento, l&#39;ingrandimento e il tipo di lente (a secco, ad immersione in olio-acqua). Per i preparati sottili come colture di tessuti, gli obiettivi del petrolio sono i migliori. Utilizzando un microscopio verticale, mobile un vetrino sul bagno acquoso, e utilizzare olio per immersione tra la parte superiore del vetrino e l&#39;obiettivo. </li><li> Se si utilizza il software di deconvoluzione, il venditore potrebbe fornire funzioni di punto di spread predeterminati (PSF) per determinati obiettivi. Se tale informazione è fornita, o se si sceglie un obiettivo non supportato determinare il PSF da imaging di micropunti fluorescenti o oggetti di diffrazione limitata analoghi 7,8. </li></ol> 3. Stabilire la profondità di campo desiderata e numero di Images desiderati per Time-lapse con cornice <ol><li> Selezionare la profondità totale del campo in modo che lo spostamento o interagendo strutture di interesse non scompaiono o andare fuori fuoco, come si muovono nella direzione z. La z-campo dovrebbe superare leggermente la dimensione verticale del processo cellulare o la cellula viene esposta. Per i terminali del motore vertebrati, 15-20 micron è tipico. </li><li> Calcolare il passo asse z necessaria per ogni incremento di messa a fuoco. Risoluzione lungo l&#39;asse z varia a seconda proprietà del obiettivo; è circa un quarto della risoluzione piano xy. Se viene utilizzato sia confocale o software di deconvoluzione, risoluzione z è migliorata. Migliorare la risoluzione finale oversampling deliberata nella direzione z 5, ma si veda anche passo 3.3. Un intervallo tipico passo è nell&#39;intervallo da 400-1,500 nm per obiettivi 40-100X. Luce dovrebbe essere coperto off tra ogni immagine z-step. </li><li> Selezionare il numero di immagini per z-stack, cioè la profondità di campo desiderata divisodall&#39;intervallo passo. Tempo per completare una tipica z-stack è 1-10 sec. Oggetti in rapido movimento (100 nm / sec) possono apparire sfocata in una pila di immagini 3D perché ogni piano dell&#39;immagine corrisponde ad un punto temporale leggermente diverso. Inoltre, ogni immagine aggiuntiva contribuisce al photobleaching e fototossicità possibile (vedi discussione). Se una situazione riguarda, sceglierebbe una più grande z-passo per raccogliere un minor numero di immagini per stack. Compensare successivamente utilizzando il software di interpolazione dell&#39;immagine (fase 6.3). </li></ol> 4. Selezionare il Frame Rate Time-lapse Scegli sperimentazione un tasso che è appena sufficiente per risolvere agevolmente cambia con il tempo come il movimento, interazioni o eventi di fusione 9. Sotto il campionamento può produrre artefatti da movimento (errori di campionamento), mentre sovracampionamento aumenta inutilmente l&#39;esposizione alla luce. Raccogliere una singola sequenza lunga o più sequenze ripetute della stessa preparazione, ciascuno con un intervallo relativamente piccolo tempo totale ( <em&gt; eg 10 punti temporali x 30 sec intervallo = 5 min). Se possibile, vista la preparazione con la continua illuminazione epifluorescenza a circa stima velocità del movimento, tra cui deriva l&#39;intera preparazione, se presente. 5. Completa tutte le immagini dal vivo per una preparazione particolare Preparazioni Rettiliani in genere rimangono robusto per ~ 1-2 ore, più a lungo se raffreddato. 6. Analizzare i dati in base all&#39;uso desiderato <ol><li> Conservare tutti i file di dati grezzi. Mentre memorizzazione digitale di solito non è un problema, tempo di elaborazione è significativo anche con personal computer o workstation veloci. Per questo motivo, ritagliare le immagini in una regione di interesse [ROI]. Assicurare che l&#39;intera regione di interesse nella finestra ritagliata durante l&#39;intero corso del tempo. </li><li> Deconvolve immagine pile utilizzando il software appropriato e la funzione di punto di diffusione corretta. Verificare che la risoluzione è migliorata e che nessun manufatto è stato generato dallaalgoritmo di deconvoluzione. Figura 3 mostra immagini di esempio. </li><li> Utilizzare un algoritmo di interpolazione per espandere z risoluzione apparente. Un&#39;espansione 6X da un immagine reale di 1,5 micron piano di separazione di un apparente separazione 0,25 micron è suggerito. In alternativa, utilizzare una combinazione di sovracampionamento (punto 3.2) e l&#39;interpolazione. </li><li> Eseguire il contrasto, la luminosità, il filtraggio del rumore, fotoscolorimento e altre regolazioni tipiche di elaborazione delle immagini, se lo desideri. Norme di manipolazione della fotografia impongono che per la maggior parte lavoro scientifico, è opportuno che le stesse correzioni da applicare a tutte le immagini, sia all&#39;interno di uno stack e in diversi momenti. La conseguenza di una rettifica specifica dovrebbe essere valutata fra tutte le immagini 9. </li><li> Selezionare una modalità di visualizzazione particolare per l&#39;esportazione dei dati. Il display più semplice è video stereo utilizzando sia anaglifi rosso-verde o rosso-blu (esempi in figura 3), coppie stereo, o alternando sinistra / right occhio fotogrammi con occhiali. Anaglifi sono limitati a un solo colore. Migliorare la profondità dell&#39;immagine evidente se lo si desidera migliorare z risoluzione visiva. </li><li> Esperimento con varie filtraggio e di immagine tecniche di miglioramento. Ad esempio, il filtro laplaciano è utile per aumentare il contrasto di piccole strutture sopra sfondo. La luminosità del pixel al centro di una finestra di esecuzione è migliorata mentre la luminosità delle zone circostanti è ridotto. Nota che alcuni metodi di filtraggio non funzionano bene in combinazione. </li><li> Applicare correzione della deriva se vi è sostanziale movimento della preparazione nel tempo. Tale movimento è comune nel muscolo vivente, anche con farmaci aggiunti per sopprimere potenziali d&#39;azione e potenziali sinaptici. Un algoritmo di registrazione pixel (ad es. Imaris, Adobe AfterEffects, plug TurboReg per ImageJ) allinea le immagini time-lapse e può ridurre, ma di solito non eliminare completamente, tale movimento. </li></ol>

<ol><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+microscopy-tips+and+tools%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Live-cell microscopy-tips and tools.</a> J. Cell Sci. 122 (6), 753-767 (2009).</li>
<li>Tinevez, J. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+method+for+measuring+phototoxicity+of+a+live+cell+imaging+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">A quantitative method for measuring phototoxicity of a live cell imaging microscope.</a> Meth. Enzymol. 506, 291-309 (2012).</li>
<li>Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+evaluating+colocalization+in+biological+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, (2011).</li>
<li>Snapp, E. L., Hegde, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+and+evaluation+of+FRETexperiments+to+measure+proteinproximities+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rational design and evaluation of FRETexperiments to measure proteinproximities in cells.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. 17, (2006).</li>
<li>Stewart, R. S., Teng, H., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late%22+macroendosomes+and+acidic+endosomes+in+vertebrate+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Late" macroendosomes and acidic endosomes in vertebrate motor nerve terminals.</a> J. Comp. Neurol. 520, 4275-4293 (2012).</li>
<li>Teng, H., Lin, M. Y., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroendocytosis+and+endosome+processing+in+snake+motor+boutons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Macroendocytosis and endosome processing in snake motor boutons.</a> J. Physiol. 582, 243-262 (2007).</li>
<li>McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+by+deconvolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy.</a> Methods. 19, 373-385 (1999).</li>
<li>Swedlow, J. R., Platani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+using+wide-field+microscopy+and+deconvolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Struct.+Funct%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution.</a> Cell Struct. Funct. 27, 335-341 (2002).</li>
<li>Cromey, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+images+are+data%3A+and+should+be+treated+as+such%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Digital images are data: and should be treated as such.</a> Methods Mol. Biol. Taatjes, D. J., Roth, J. 931, 1-27 (2013).</li>
<li>Teng, H., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-mediated+endocytosis+near+active+zones+in+snake+motor+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Clathrin-mediated endocytosis near active zones in snake motor terminals.</a> J. Neurosci. 20 (21), 7986-7993 (2000).</li>
<li>Teng, H., Cole, J. C., Roberts, R. L., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+active+zones%3A+hot+spots+for+endocytosis+in+vertebrate+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Endocytic active zones: hot spots for endocytosis in vertebrate nerve terminals.</a> J. Neurosci. 19 (12), 4855-4866 (1999).</li>
<li>Tan, T. T. T., Khaw, C., Ng, M. M. L. Challenges and recent advances in live cell bioimaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTan%2C+TTT+%22Microscopy%3A+Science%2C+Technology%2C+Applications+and+Education%22">Microscopy: Science, Technology, Applications and Education</a>. Mendez-Vilas, A., Diaz, J. , 1495-1505 (2010).</li>
<li>Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+C.+elegans+embryos+using+an+epifluorescent+microscope+and+open+source+software%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging C. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software.</a> J. Vis. Exp. (49), (2011).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

L&#39;aspetto più critico dell&#39;imaging 4D è la gestione della durata e intensità di esposizione alla luce. Fotoscolorimento diminuisce immagine rapporto segnale-rumore e può essere problematico o meno a seconda di vari fattori, tra cui la scelta di fluorofori. Danni aspecifica di tessuto vivente (fototossicità) è legato alla photobleaching, e talvolta può essere identificato utilizzando sonde fluorescenti progettati per lo scopo 2,12 o di un esame della morfologia con opportune ottiche chiaro, come il con...

Time-lapse imaging di tessuto vivente fornisce l&#39;accesso visivo dinamici relazioni struttura-funzione che non può essere apprezzato in preparazioni fissi o che vivono impressi in un unico punto nel tempo. Spesso, tuttavia, il compromesso per l&#39;accesso alle informazioni temporali è una diminuzione della risoluzione ottica. Obiettivi ad immersione in olio ad alta apertura numerica sono impraticabili nel tessuto vivo a causa della loro ristretta gamma di messa a fuoco, lasciando immersione in acqua o obiettivi a secco come le uniche alternative. Inoltre, la maggiore risoluzione ottenibile con ottica confocale non può essere utilizzato in alcune preparazioni vivere a causa della fototossicità dai livelli relativamente alti di illuminazione richiesti 1,2. Infine, mentre diverse real-time o time-lapse tecniche ottiche sono disponibili che offrono una maggiore risoluzione, la loro applicabilità è limitata a preparazioni in cui le strutture di interesse possono essere posizionati a poche centinaia di nanometri dell&#39;obiettivo 1. Il metodo descritto, a strumenti relativamente a basso costo, è versatile, ma offre una migliore risoluzione rispetto alle tecniche time lapse più comunemente usati. Esso è destinato all&#39;uso nei laboratori individuali nonché strutture di imaging. Il metodo utilizza epifluorescenza convenzionale, combinato con una fotocamera digitale sensibile e con hardware progettato per acquisire rapidamente gruppi di immagini a leggermente differenti piani focali (Z-stack). Ogni z-stack è digitalmente deconvolved per aumentare la risoluzione. Una caratteristica del 3D time-lapse (4D) imaging è tracciamento preciso di organelli o altre strutture in movimento. Se correttamente impostato, strutture impressi non vanno fuori fuoco, e il movimento in tutte e tre le direzioni possono essere osservati e quantificati. Così è impossibile per una struttura macchiato eliminata nell&#39;arco di uno o più frame time lapse semplicemente alla deriva sopra o al di sotto di un piano focale stretta. Il metodo serve anche come strumento sensibile per valutare le interazioni e possibile fusione di piccole strutture. Epifluorescenza convenzionale o immagini confocali di strutture in prossimità del limite di diffrazione (a poche centinaia di nm) non confermano la fusione anche se le immagini mostrano unite sovrapposizione delle rispettive etichette 3. Fusion è suggerito, ma rimane la possibilità che gli oggetti sono separati orizzontalmente o verticalmente da una distanza che è inferiore al limite di diffrazione. Tre o immagini quadridimensionale, al contrario, consente la visualizzazione degli oggetti in ciascuna delle tre direzioni ortogonali. L&#39;aspetto della fusione in tutte e tre le viste aumenta il livello di certezza. E, in alcune preparazioni viventi, diretto o moto browniano di oggetti ipoteticamente fuse fornisce un&#39;ulteriore prova quando entrambi i marchi si muovono insieme nel tempo. Naturalmente, quando in prossimità del limite di diffrazione il livello di certezza in strutture esigenti da sfondo, o mostrando che esse contengono due coloranti (fusione), non è assoluto. Se, tecniche specializzate, ad esempio la risonanza di fluorescenza trasferimento di energia (FRET)4, sono più appropriato.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SGC5</td><td>Biotium, Hayward, CA</td><td>70057</td><td>Conc. finale: 10 mM</td></tr><tr><td>FM1-43FX</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>F35335</td><td>Conc. finale: 7 mM</td></tr><tr><td>LysoTracker Red</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>L7528</td><td>Conc. finale: 0,2 mM</td></tr><tr><td>Ringers per rettili pH 7,2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>145 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>2,5 mM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td>3,6 mM</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td></td><td></td><td>1,8 mM</td></tr><tr><td>KH2PO4 (Dibasic)</td><td></td><td></td><td>1,0 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td>5,0 mM</td></tr><tr><td>Alto KCl Rettiliano Ringer pH 7,2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>86 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>60 mM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td>3,6 mM</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td></td><td></td><td>1,8 mM</td></tr><tr><td>KH2PO4 (Dibasic)</td><td></td><td></td><td>1,0 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td>5,0 mM</td></tr><tr><td>Anelli ad alto contenuto di saccarosio pH 7,2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>145 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>2,5 mM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td>3,6 mM</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td></td><td></td><td>1,8 mM</td></tr><tr><td>KH2PO4 (Dibasico)</td><td></td><td></td><td>1,0 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td>5,0 mM</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td></td><td></td><td>0,5 M (17,1 g/50 ml)</td></tr><tr><td>Microscopio invertito Axioplan 200</td><td>Carl Zeiss, Thornwood, NY</td><td></td><<td>a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td></tr><tr><td>N-Achroplan 63X obiettivo per acqua; n.a.=0,9; Distanza di lavoro=2,4 mm&nbsp;</td><td>Carl Zeiss, Thornwood, NY</td><td></td><<td>a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td></tr><tr><td>DG4 commutatore combinato sorgente luminosa/ruota portafiltri di eccitazione</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>Lampada ad arco allo xeno da 175 W</td><td><a href="http://www.sutter.com/">www.sutter.com</a></td></tr><tr><td>Lambda 10-2&nbsp; commutatore a ruota portafiltri di emissione</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td></td><td><a href="http://www.sutter.com/">www.sutter.com</a></td></tr><tr><td>Telecamera CCD Sensicam</td><td>Cooke Instruments, Tonawanda, NY</td><td></td><<td>a href="http://www.cookecorp.com/">www.cookecorp.com</a></td></tr><tr><td>Telecamera CCD Cascade 512</td><td>Photometrics, Tucson, AZ</td><td></td><td><a href="http://www.photometrics.com/">www.photometrics.com</a></td></tr><tr><td>Dischi per immagini- realizzati internamente-diametro 11 cm; Vetrino coprioggetti Ø 25 mm #1 incorporato; pin magnetici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 5.0</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO</td><td>Deconvoluzione; Correzione della deriva; Presentazione dati 3D e 4D</td><td><a href="http://www.intelligent-imaging.com/">www.intelligent-imaging.com</a></td></tr><tr><td>IMARIS 7.5.2</td><td>Bitplane, South Windsor,</td><td>CT Drift correction; Presentazione dati 3D e 4D<</td><td>a href="http://www.bitplane.com/">www.bitplane.com</a></td></tr><tr><td>AfterEffects CS6</td><td>Adobe, San Jose, CA</td><td>Correzione</td> <td>della deriva<a href="http://www.adobe.com/">www.adobe.com</a></td></tr><tr><td>ImageJ 1.46</td><td>National Institutes of Health, Bethesda, MD</td><td>Plugin multipli disponibili; Costruzione di coppie stereo</td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij">http://rsbweb.nih.gov/ij</a></td></tr><tr><td>Zeiss LSM</td><td>Carl Zeiss, Thornwood, NY</td><td>Costruzione di coppie stereo</td><td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td></tr></tbody></table>

visualizzazione del endosome dynamics in vivere terminazioni nervose con quattro-dimensionale imaging di fluorescenza

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Quadridimensionale (4D) immagini poco è stato utilizzato per studiare il comportamento di piccole strutture nel raggio di terminali dei nervi motori del sottile trasverso dell&#39;addome muscolo del serpente giarrettiera. I dati grezzi comprende sequenze time-lapse di 3D z-stack. Ogni stack contiene 4-20 immagini acquisite con ottica epifluorescenza a piani focali separati da 400-1,500 nm. Passi nella acquisizione di pile di immagini, quali la regolazione della messa a fuoco, la commutazione di lunghezze d&#39;onda di eccitazione, e il funzionamento della fotocamera digitale, sono automatizzate per quanto possibile per massimizzare la velocità di immagine e minimizzare danni ai tessuti da esposizione alla luce. Dopo l&#39;acquisizione, una serie di pile di immagini è deconvolved per migliorare la risoluzione spaziale, convertito nel formato 3D desiderato, e utilizzato per creare un &quot;film&quot; 4D che è adatto per diverse analisi basati su computer, a seconda dei dati sperimentali richiesti. Una applicazione è lo studio del comportamento dinamico di due classi di endosomi trovati in terminali nervosi-macroendosomes (MES)e endosomi acidi (AES)-le cui dimensioni (200-800 nm per entrambi i tipi) sono in prossimità o al limite di diffrazione. L&#39;accesso alle informazioni 3D in ogni tempo offre diversi vantaggi rispetto ai tradizionali time-lapse imaging. In particolare, le dimensioni e la velocità di movimento delle strutture possono essere quantificati nel tempo senza perdita di fuoco. Esempi di dati di immagini 4D rivelano che ME avvicinano alla membrana plasmatica e scompaiono, suggerendo che essi sono exocytosed piuttosto che semplicemente spostando verticalmente distanti un unico piano di messa a fuoco. Ha anche rivelato è la fusione putativo di ME e AES, attraverso la visualizzazione di sovrapposizione tra i due strutture colorante contenente come visto in ogni tre proiezioni ortogonali.

I dati riportati sono da terminali serpente neuromuscolari (vedi visite basse e alte ingrandimento nella figura 3, il colorante endocitica (FM1-43) assorbimento crea una nebbia che riempie ogni bouton) e, in particolare, macroendosomes (MES) e endosomi acidi (AES) all&#39;interno di questi terminali 5. ME sono creati da endocitosi massa durante l&#39;attività neuronale 10 e il loro numero declina esponenzialmente con il tempo dopo l&#39;attività è cessata 6. L&#39;uso di...

Quadridimensionale (4D) di imaging viene utilizzato per studiare il comportamento e le interazioni tra i due tipi di endosomi a vivere terminazioni nervose vertebrati. Movimento di queste piccole strutture è caratterizzata in tre dimensioni, permettendo conferma di eventi come endosomi fusione ed esocitosi.

Visualizzazione del endosome Dynamics in Vivere terminazioni nervose con quattro-dimensionale imaging di fluorescenza

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere immagini accurate degli endosomi nello spazio tridimensionale nel tempo, ovvero in quattro dimensioni. Questo risultato si ottiene innanzitutto dissezionando i muscoli del serpente e disponendo il tessuto nella piastra per l'analisi microscopica. Il secondo passaggio consiste nell'incubare il tessuto con coloranti vitali per indurre la formazione di endosomi.Successivamente, il preparato viene acquisito in quattro dimensioni per uno o più giunzioni neuromuscolari. L'ultimo passaggio consiste in un'accurata analisi dei dati per caratterizzare il comportamento dei macroendosomi. In definitiva, la presenza e il movimento degli endosomi nel tempo all'interno dello spazio presinaptico possono essere dimostrati mediante imaging fluorescente in quattro dimensioni.Il vantaggio principale di questa tecnica è che il muscolo addominale del serpente ha uno spessore di una sola fibra, il che permette di ottenere immagini di alta qualità mediante microscopia a fluorescenza episcopica. In questo protocollo verranno utilizzate preparazioni di tessuto provenienti da serpenti natrici. I tessuti rettiliani devono essere mantenuti a basse temperature

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Questo protocollo descrive l'analisi dei compartimenti intracellulari etichettati fluorescentmente in lievito in erba utilizzando la microscopia confocale 4D (time-lapse 3D). I parametri di imaging vengono scelti per catturare segnali adeguati limitando i fotodanni. I plug-in Custom ImageJ consentono di tenere traccia delle strutture etichettate e di analizzarle quantitativamente.

Microscopia 4D del lievito

I metodi attuali descrivono un approccio non raziometrico per l'imaging subcompartimentale del calcio ad alta risoluzione in vivo in Caenorhabditis elegans utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati prontamente disponibili.

Imaging subcellulare della manipolazione neuronale del calcio in vivo

L'articolo descrive l'ottimizzazione dei parametri di acquisizione al microscopio a fluorescenza per visualizzare il trasporto assonale di carichi marcati endogeni con risoluzione di un singolo neurone in un nematode vivente.

Ottimizzazione della visualizzazione del trasporto assonale del carico endogeno mediante microscopia a fluorescenza in Caenorhabditis elegans vivente

Scopri la dinamica degli endosomi nelle terminazioni nervose viventi utilizzando l'imaging a fluorescenza tridimensionale nel tempo. Questo metodo consente di osservare fusione ed esocitosi endosomiale.

Visualizzazione del endosome Dynamics in Vivere terminazioni nervose con quattro-dimensionale imaging di fluorescenza

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