Name: Analisi quantitativa di espressione della proteina per studiare Lineage specifica nel topo preimpianto embrioni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Impara l'analisi quantitativa in situ dell'espressione proteica a risoluzione singola cellula nei blastocisti di topo. Questo metodo di microscopia confocale ad alto rendimento consente di studiare l'eterogeneità cellulare e la specificazione del lineage nello sviluppo embrionale precoce.

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Gli autori desiderano ringraziare Stefano Di Talia, Alberto Puliafito, Venkatraman Seshan e Panagiotis Xenopoulos, per il contributo sulla gestione, l'analisi e la rappresentazione dei dati, Berenika Plusa per l'assistenza nella progettazione del protocollo di immunofluorescenza e dei test anticorpali e i membri del laboratorio Hadjantonakis per i commenti sul manoscritto e sullo sviluppo di questo protocollo. Il lavoro nel nostro laboratorio è supportato dal National Institutes of Health R01-HD052115 e R01-DK084391 e da NYSTEM N13G-236.

<ol><li>Saiz, N., Plusa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cell+fate+decisions+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Early cell fate decisions in the mouse embryo.</a> Reproduction. 145 (3), R65-R80 (2013).</li>
<li>Schrode, N., Xenopoulos, P., Piliszek, A., Frankenberg, S., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+a+blastocyst%3A+cell+behaviors+driving+cell+fate+choice+and+morphogenesis+in+the+early+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Anatomy of a blastocyst: cell behaviors driving cell fate choice and morphogenesis in the early mouse embryo.</a> Genesis. 51 (4), 219-233 (2013).</li>
<li>Saiz, N., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cells+get+together%3A+High-resolution+approaches+to+study+the+dynamics+of+early+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Single cells get together: High-resolution approaches to study the dynamics of early mouse development.</a> Seminars in cell & developmental biology. , (2015).</li>
<li>Lou, X., Kang, M., Xenopoulos, P., Muñoz-Descalzo, S., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+and+Efficient+2D%2F3D+Nuclear+Segmentation+Method+for+Analysis+of+Early+Mouse+Embryo+and+Stem+Cell+Image+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Rapid and Efficient 2D/3D Nuclear Segmentation Method for Analysis of Early Mouse Embryo and Stem Cell Image Data.</a> Stem Cell Reports. 2 (3), 382-397 (2014).</li>
<li>Le Bin, G. C., Muñoz-Descalzo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oct4+is+required+for+lineage+priming+in+the+developing+inner+cell+mass+of+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Oct4 is required for lineage priming in the developing inner cell mass of the mouse blastocyst.</a> Development. 141 (5), 1001-1010 (2014).</li>
<li>Schrode, N., Saiz, N., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA6+Levels+Modulate+Primitive+Endoderm+Cell+Fate+Choice+and+Timing+in+the+Mouse+Blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">GATA6 Levels Modulate Primitive Endoderm Cell Fate Choice and Timing in the Mouse Blastocyst.</a> Developmental Cell. 29 (4), 454-467 (2014).</li>
<li>Xenopoulos, P., Kang, M., Puliafito, A., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneities+in+Nanog+Expression+Drive+Stable+Commitment+to+Pluripotency+in+the+Mouse+Blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Heterogeneities in Nanog Expression Drive Stable Commitment to Pluripotency in the Mouse Blastocyst.</a> Cell Reports. 10 (9), 1508-1520 (2015).</li>
<li>Saiz, N., Kang, M., et al. Quantitative analyses for elucidating mechanisms of cell fate commitment in the mouse blastocyst. Proceedings of SPIE. Optical Methods in Developmental Biology III, 9334, (2015).</li>
<li>Fleming, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+of+cell+allocation+to+trophectoderm+and+inner+cell+mass+in+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis of cell allocation to trophectoderm and inner cell mass in the mouse blastocyst.</a> Developmental biology. 119 (2), 520-531 (1987).</li>
<li>Dietrich, J. -E., Hiiragi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+patterning+in+the+mouse+pre-implantation+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stochastic patterning in the mouse pre-implantation embryo.</a> Development. 134 (23), 4219-4231 (2007).</li>
<li>Plusa, B., Piliszek, A., Frankenberg, S., Artus, J., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+sequential+cell+behaviours+direct+primitive+endoderm+formation+in+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct sequential cell behaviours direct primitive endoderm formation in the mouse blastocyst.</a> Development. 135 (18), 3081-3091 (2008).</li>
<li>Gerbe, F., Cox, B., Rossant, J., Chazaud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+expression+of+Lrp2+pathway+members+reveals+progressive+epithelial+differentiation+of+primitive+endoderm+in+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic expression of Lrp2 pathway members reveals progressive epithelial differentiation of primitive endoderm in mouse blastocyst.</a> Developmental biology. 313 (2), 594-602 (2008).</li>
<li>Nichols, J., Silva, J., Roode, M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Erk+signalling+promotes+ground+state+pluripotency+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Suppression of Erk signalling promotes ground state pluripotency in the mouse embryo.</a> Development. 136 (19), 3215-3222 (2009).</li>
<li>Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signal-dependent+segregation+of+primitive+endoderm+and+epiblast+in+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst.</a> Development. 137 (5), 715-724 (2010).</li>
<li>Morris, S. A., Teo, R. T. Y., Li, H., Robson, P., Glover, D. M., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+formation+of+the+first+two+distinct+cell+types+of+the+inner+cell+mass+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Origin and formation of the first two distinct cell types of the inner cell mass in the mouse embryo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6364-6369 (2010).</li>
<li>Artus, J., Panthier, J. -J., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+PDGF+signaling+in+expansion+of+the+extra-embryonic+endoderm+lineage+of+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for PDGF signaling in expansion of the extra-embryonic endoderm lineage of the mouse blastocyst.</a> Development. 137 (20), 3361-3372 (2010).</li>
<li>Artus, J., Piliszek, A., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primitive+endoderm+lineage+of+the+mouse+blastocyst%3A+Sequential+transcription+factor+activation+and+regulation+of+differentiation+by+Sox17%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">The primitive endoderm lineage of the mouse blastocyst: Sequential transcription factor activation and regulation of differentiation by Sox17.</a> Developmental biology. 350 (2), 393-404 (2011).</li>
<li>Kang, M., Piliszek, A., Artus, J., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF4+is+required+for+lineage+restriction+and+salt-and-pepper+distribution+of+primitive+endoderm+factors+but+not+their+initial+expression+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF4 is required for lineage restriction and salt-and-pepper distribution of primitive endoderm factors but not their initial expression in the mouse.</a> Development. 140 (2), 267-279 (2013).</li>
<li>Bessonnard, S., De Mot, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata6%2C+Nanog+and+Erk+signaling+control+cell+fate+in+the+inner+cell+mass+through+a+tristable+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gata6, Nanog and Erk signaling control cell fate in the inner cell mass through a tristable regulatory network.</a> Development. 141 (19), 3637-3648 (2014).</li>
<li>Behringer, R. R., Gertsenstein, M., Vintersten Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+RR+%22Manipulating+the+mouse+embryo%3A+a+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2014).</li>
<li>Czechanski, A., Byers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+characterization+of+mouse+embryonic+stem+cells+from+permissive+and+nonpermissive+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains.</a> Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).</li>
<li>Frankenberg, S., Shaw, G., Freyer, C., Pask, A. J., Renfree, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cell+lineage+specification+in+a+marsupial%3A+a+case+for+diverse+mechanisms+among+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Early cell lineage specification in a marsupial: a case for diverse mechanisms among mammals.</a> Development. 140, 965-975 (2013).</li>
<li>Artus, J., Vandormael-Pournin, S., Frödin, M., Nacerddine, K., Babinet, C., Cohen-Tannoudji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+mitotic+progression+and+preimplantation+lethality+in+mice+lacking+OMCG1%2C+a+new+evolutionarily+conserved+nuclear+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Impaired mitotic progression and preimplantation lethality in mice lacking OMCG1, a new evolutionarily conserved nuclear protein.</a> Molecular and cellular biology. 25 (14), 6289-6302 (2005).</li>
<li>Saiz, N., Grabarek, J. B., Sabherwal, N., Papalopulu, N., Plusa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+protein+kinase+C+couples+cell+sorting+with+primitive+endoderm+maturation+in+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Atypical protein kinase C couples cell sorting with primitive endoderm maturation in the mouse blastocyst.</a> Development. 140 (21), 4311-4322 (2013).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Il presente protocollo descrive un metodo per eseguire un&#39;analisi quantitativa di tutto il montaggio immunofluorescenza su preimpianto degli embrioni palco del mouse. Un robusto protocollo di immunofluorescenza 22 è seguito da ad alta risoluzione, tutto il montaggio confocale e dalla segmentazione delle immagini utilizzando un pezzo su misura del software 4. Mentre la scelta del protocollo immunofluorescenza non è critica, troviamo quello qui presentato 22 per essere veloce, affidabi...

L&#39;embrione di topo preimpianto è un paradigma per studiare la formazione e il mantenimento della pluripotenza in vivo, così come un modello per lo studio della determinazione del fato cellulare e de novo epitelizzazione nei mammiferi. Le fasi preimpianto dello sviluppo dei mammiferi sono dedicati alla creazione di tre linee cellulari che compongono la blastocisti, vale a dire la epiblasto pluripotente - che dà luogo alla maggior parte dei tessuti somatici e le cellule germinali - e due linee extraembrionali, il trophectoderm (TE) e la endoderma primitivo (PRE) (Figura 1A) 1,2. Questo protocollo descrive le procedure per (1) embrioni raccolta e fissare fase preimpianto del mouse, (2) eseguire immunofluorescenza per etichettare le proteine ​​di interesse, (3) effettuare tutto il montaggio di immagini utilizzando un microscopio confocale con funzionalità di z-sezionamento e (4) eseguire la segmentazione nucleare di immagini confocale e analisi successive immagine quantitativa. Questo gasdotto permette tegli imparziali misurazione dei livelli di proteine ​​per l&#39;assegnazione delle identità cellulari per caratterizzare le sottopopolazioni di cellule in situ. Questo protocollo può essere eseguito in meno di 3 - 4 giorni per una singola cucciolata (generalmente fino a 10 embrioni di topo), dalla raccolta embrione per l&#39;analisi dei dati (Figura 1B). L&#39;analisi simultanea di più cucciolate aumenterebbe l&#39;imaging e analisi di dati in tempo onere, estendendo così la lunghezza complessiva del protocollo. L&#39;embrione preimpianto fase del mouse è un sistema sperimentale trattabili che, data la sua piccola dimensione e morfologia stereotipata 3, è adatto per l&#39;imaging in toto di processi cellulari con risoluzione di una singola cellula. Per effettuare un imparziale, analisi a livello di sistema di un numero statisticamente rilevante di embrioni, un sistema automatico, pipeline di analisi quantitativa è desiderabile. Tuttavia, a causa della elevata densità nucleare della massa cellulare interna (ICM) della blastocisti ( <strong&gt; Figura 1A, 2D), piattaforme immagine segmentazione convenzionali non riescono a fornire una sufficiente precisione per stabilire un flusso di lavoro automatizzato o semi-automatizzato. D&#39;altra parte, la segmentazione manuale, mentre accurate, non consente l&#39;elaborazione di grandi coorti di cellule ed embrioni, né è adeguato riproducibile, determinazione imparziale delle identità cellulari - che è particolarmente importante quando si studiano stadi di sviluppo in cui i modelli di marcatore espressione non ha completamente risolto (ad esempio, non presentano una distribuzione binaria in una popolazione). Abbiamo recentemente sviluppato e validato un metodo di segmentazione delle immagini su misura per gli embrioni palco del mouse preimpianto e per le cellule staminali embrionali di topo (CES), che raggiunge un&#39;elevata accuratezza, mentre richiede un input minimo dell&#39;utente 4-8. Il gasdotto analisi presentata qui ruota attorno lo strumento segmentazione delle immagini MATLAB a base modulare interattivo Segmentazione Nucleare (minuti) 4. MIN performs segmentazione nucleare senza supervisione su grandi lotti di confocale Z-stack dopo che l&#39;utente ha stabilito un numero minimo di proprietà dell&#39;immagine, utilizzando un&#39;interfaccia utente grafica (GUI) (Tabella 1) 4. Questo oleodotto si è dimostrato efficace per la generazione di dati ad alto rendimento sulla espressione di proteine ​​e localizzazione cellulare in entrambi wild-type, sperimentalmente trattati e gli embrioni e CES 5-7 geneticamente modificati. Nel presente protocollo, si descrive l&#39;applicazione di minuti alla segmentazione di immagini dell&#39;embrione preimpianto stadio. Per esempi di prestazioni minuti sul CES si rimanda al 4,7. La fase di segmentazione nucleare automatizzato riduce notevolmente l&#39;onere tempo del processo di identificazione delle cellule, mentre le misure di intensità spaziale e fluorescenza consentono una determinazione imparziale delle identità delle cellule e la generazione di mappe tridimensionali di domini di espressione genica e la posizione delle cellule nell&#39;embrione (Figura 1C </strong&gt;). Inoltre, la scalabilità di questo flusso di lavoro rende applicabile all&#39;analisi dei singoli cucciolate attraverso grandi coorti di embrioni trattati sperimentalmente, o embrioni di diverso background genetico 5,6. Minuti è liberamente disponibile presso http://katlab-tools.org (il software richiede una licenza MATLAB). Nessun approccio sviluppato fino ad oggi consente la generazione di tali dati in modo approfondito l&#39;espressione proteica e la localizzazione delle cellule in embrioni di topo preimpianto. Tutti i tentativi finora a quantificare questi tipi di dati sono stati limitati alla determinazione manuale e quantificare la presenza di numeri di cellulare per le diverse popolazioni nell&#39;embrione (o interamente a mano, o software-assistita) 9-19. Questo approccio (che incorpora il software minuti) è stata adattata per e testato su embrioni preimpianto mouse e CES; tuttavia la sua prestazione su altri sistemi con elevata densità nucleare, anche se ancora sottoposti a verifica, dovrebbe essere equivalente.

<table><tbody><tr><td>Raccolta embrioni</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonda smussata per il controllo dell'otturatore</td><td>Roboz</td><td>Pinze RS-9580</td><td></td></tr><tr><td>Roboz</td><td></td><td>RS-4978</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td></td></tr><tr><td>Pipette in vetro Pasteur</td><td>Fisher</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Tubo aspiratore preassemblato e bocchino</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in gomma più lungo</td><td>Fisher</td><td>14-178-2AA&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>M2</td><td>Millipore</td><td>MR-015-D</td><td></td></tr><tr><td>FHM</td><td>Millipore</td><td>MR-024-D</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di Tyrode acido</td><td>Millipore</td><td>MR-004-D</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino Albumina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>piastre a 4 pozzetti</td><td>Nunc/Thermo-Fisher</td><td>12-566-300&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Immunofluorescenza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastre con fondo a U a 96 pozzetti</td><td>Fisher</td><td>14-245-73</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7403</td><td></td></tr><tr><td>Siero di cavallo</td><td>Sigma</td><td>H0146</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi primari</td><td></td><td></td><td><forte>Concentrazione</forte></td></tr><tr><td>CDX2</td><td>Biogenex</td><td>AM392-5M</td><td>1:200</td></tr><tr><td>GATA6</td><td>R& D</td><td>AF1700</td><td>1:100</td></tr><tr><td>GATA4</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9053</td><td>1:100, fissazione 10 min</td></tr><tr><td>GATA4</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-1237</td><td>1:100, fissazione O/N</td></tr><tr><td>SOX17</td><td>R& D</td><td>AF1924</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Nanog</td><td>ReproCELL</td><td>RCAB0002P-F</td><td>1:500</td></tr><tr><td>OCT4</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td>1:100, 10 min a fissazione O/N</td></tr><tr><td>DAB2</td><td>BD</td><td>BD-610464</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Anticorpi secondari</td><td>Life</td><td>Technologies Vari</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm con fondo in vetro</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Segmentation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer con sistema operativo</td><td></td> Windows a 64 bit <td>n/a</td><td>Verificare i requisiti minimi di sistema presso http://katlab-tools.org e in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports</td></tr><tr><td>MATLAB (software)</td><td>Mathworks</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>MINS (software)</td><td>Gratuito</td><td>n/a</td><td>http://katlab-tools.org</td></tr></tbody></table>

analisi quantitativa di espressione della proteina per studiare lineage specifica nel topo preimpianto embrioni

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Questo protocollo presenta un metodo per eseguire quantitativa, monocellulari in situ analisi dell&#39;espressione della proteina per studiare specifica lineage in embrioni di topo preimpianto. sono descritte le procedure necessarie per la raccolta degli embrioni, immunofluorescenza, imaging su un microscopio confocale, e la segmentazione di immagine e di analisi. Questo metodo consente la quantificazione dell&#39;espressione dei diversi marcatori nucleari e spaziali (XYZ) coordina tutte le cellule nell&#39;embrione. Si avvale di minuti, uno strumento software per la segmentazione di immagini appositamente sviluppato per l&#39;analisi di immagini confocale di embrioni preimpianto e colonie di cellule staminali embrionali (ESC). MINS svolge segmentazione nucleare senza supervisione di tutti i X, Y e Z dimensioni, e produce le informazioni sulla posizione della cella in uno spazio tridimensionale, così come i livelli di fluorescenza nucleari per tutti i canali con input dell&#39;utente minima. Mentre questo protocollo è stato ottimizzato per l&#39;analisi di immaginidi preimpianto embrioni fase di topo, può essere facilmente adattato per l&#39;analisi di altri campioni che presentano un buon rapporto segnale-rumore e dove ad alta densità nucleare pone un ostacolo alla segmentazione dell&#39;immagine (ad es., analisi di espressione di cellule staminali embrionali (ESC ) colonie, differenziando cellule in coltura, gli embrioni di altre specie o stadi, ecc.)

Per facilitare l&#39;interpretazione e la presentazione dei dati, si deve prestare attenzione a non danneggiare gli embrioni durante la raccolta e la manipolazione, in modo che tutte le cellule e la loro posizione relativa possono essere analizzati Figura 2A -. D mostra esempi di blastocisti intatti in diverse fasi, con una cavità estesa. In caso di danni, la cura dovrebbe essere presa quando l&#39;analisi e l&#39;interpretazione dei risultati. <p class="jove_content...

Questo protocollo presenta un metodo per eseguire quantitativa, cella singola analisi in situ di espressione della proteina per studiare specifiche lignaggio in embrioni di topo preimpianto. Le procedure necessarie per la raccolta di blastocisti, tutto il montaggio di rilevamento di immunofluorescenza di proteine, l&#39;imaging di campioni su un microscopio confocale, e la segmentazione nucleare e l&#39;analisi delle immagini sono descritte.

Analisi quantitativa di espressione della proteina per studiare Lineage specifica nel topo preimpianto embrioni

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quantificare i livelli di proteine in situ negli embrioni preimpianto di topo. Questo metodo ci consente quindi di eseguire analisi ad alto rendimento di immagini di microscopia confocale con risoluzione di una singola cellula in modo semi-automatizzato. Questo metodo può essere utilizzato per quantificare le concentrazioni proteiche su immagini confocali dove c'è un'alta densità nucleare e quando si desidera studiare le eterogeneità all'interno delle popolazioni cellulari.Per iniziare, usa una fiamma libera su una pipetta pasteur di vetro per disegnare un'estremità capillare sulla punta. Strofinare delicatamente l'estremità più lontana della pipetta contro il capillare, per romperla e creare un'estremità smussata. Dopo aver sacrificato una femmina di topo incinta nel giorno di sviluppo embrionale desiderato, esporre i visceri addominali secondo il protocollo di testo e localizzare l'utero.Tenere l'estremità cervicale, tagliare la cervice e tirare delicatamente verso l'alto per allungare entrambe le corna uterine. Elimina il grasso, facendo attenzione a non perforare la parete uterina. Tagliare sopra gli ovidotti, sotto le ovaie, per rila

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Biologia dello sviluppo

Ci mostrano una immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) metodo per identificare interazioni tra fattori di geni tessuto-specifici durante o dopo l'insorgenza di tessuto-specifica dell'espressione genica nei tessuti embrionali di topo. Questo protocollo dovrebbe essere ampiamente applicabile per lo studio di tessuto-specifica l'attivazione del gene, come si verifica durante il normale sviluppo embrionale.

Saggio di immunoprecipitazione della cromatina per geni tessuto-specifici utilizzando nella fase iniziale di embrioni di topo

L'analisi dell'espressione proteica nelle giovani valvole embrionali di topo è stata ostacolata dal limitato tessuto disponibile. Questo manoscritto fornisce un protocollo per la preparazione di proteine da regioni valvolari embrionali di topo in via di sviluppo per l'analisi del western blot.

Proteine ​​Isolamento dal Sviluppare embrionali di topo Cuore Valve Regione

L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere un in perdita e guadagno-di metodo di funzione che è applicabile per identificare neogenin come un recettore specifico stadio che porta a trophectoderm e la differenziazione massa cellulare interna di embrioni preimpianto mouse.

Loss e approccio guadagno-di-funzione per indagare cellulare precoce Fate Determinanti in preimpianto embrioni di topo

L'orologio di segmentazione guida l'espressione genica oscillatoria attraverso il mesoderma pre-somitico (PSM). L'attività Dynamic Notch è fondamentale per questo processo. Utilizziamo l'imaging e le analisi computazionali per estrarre la dinamica temporale dai dati di espressione spaziale per dimostrare che l'espressione del ligando Delta e del recettore Notch oscilla nel PSM dei vertebrati.

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Questo lavoro descrive un protocollo semi-alto-velocità che consente l'imaging simultaneo 3D time-lapse di embriogenesi in 80-100 C. elegans embrioni in un singolo periodo notturno. Inoltre, sono inclusi strumenti di elaborazione e visualizzazione delle immagini per semplificare l'analisi dei dati. La combinazione di questi metodi con ceppi di reporter personalizzati consente un monitoraggio dettagliato dell'embriogenesi.

Un metodo di imaging semi-alto e un toolkit di visualizzazione dei dati per analizzare lo sviluppo embrionale C. elegans

Qui abbiamo presentato un metodo di sequenziamento dell'mRNA a singola cellula multiplexed per profilare l'espressione genica nei tessuti embrionali del topo. Il metodo di sequenziamento dell'mRNA a singola cellula (scRNA-Seq) basato su droplet in combinazione con strategie di multiplexing può profilare singole cellule da più campioni contemporaneamente, riducendo significativamente i costi del reagente e riducendo al minimo gli effetti batch sperimentali.

Analisi del sequenziamento dell'mRNA a cella singola multiplexed delle cellule embrionali del topo

Descriviamo una tecnica per profilare i microRNA nei primi embrioni di topo. Questo protocollo supera la sfida dell'input a bassa cellula e del piccolo arricchimento dell'RNA. Questo saggio può essere utilizzato per analizzare i cambiamenti nell'espressione del miRNA nel tempo in diversi lignaggi cellulari dell'embrione del topo precoce.

Preparazione di piccole librerie di RNA per il sequenziamento da embrioni di topo precoce

Qui descriviamo una caratterizzazione proteomica basata sulla spettrometria di massa di linee cellulari con destini tissutali noti nell'embrione vertebrato di Xenopus laevis .

Proteomica della spettrometria di massa guidata da livrea cellulare nell'embrione in via di sviluppo (rana)

Questo articolo stabilisce una pipeline per sospensioni di singole cellule e nuclei di alta qualità di embrioni di topo gastrulanti per il sequenziamento di singole cellule e nuclei.

Sequenziamento dell'RNA a singola cellula di embrioni interi di topo mutanti: dall'epiblasto alla fine della gastrulazione

Questo protocollo fornisce una pipeline computazionale semplificata per quantificare le trascrizioni dei potenziatori nascenti. Integrando l'accessibilità della cromatina, le caratteristiche della cromatina e i dati trascrizionali, consente un rilevamento accurato e un'analisi specifica del filamento dell'attività dell'enhancer in regioni intrageniche complesse, pur rimanendo accessibile ai ricercatori senza un'ampia formazione in bioinformatica.

Una pipeline computazionale per la quantificazione dell'RNA dell'enhancer intergenico/intragenico nelle cellule staminali embrionali di topo

Impara l'analisi quantitativa in situ dell'espressione proteica a risoluzione singola cellula nei blastocisti di topo. Questo metodo di microscopia confocale ad alto rendimento consente di studiare l'eterogeneità cellulare e la specificazione del lineage nello sviluppo embrionale precoce.

Analisi quantitativa di espressione della proteina per studiare Lineage specifica nel topo preimpianto embrioni

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