Analisi quantitativa di espressione della proteina per studiare Lineage specifica nel topo preimpianto embrioni

L'obiettivo generale di questo protocollo è quantificare i livelli di proteine in situ negli embrioni preimpianto di topo. Questo metodo ci consente quindi di eseguire analisi ad alto rendimento di immagini di microscopia confocale con risoluzione di una singola cellula in modo semi-automatizzato. Questo metodo può essere utilizzato per quantificare le concentrazioni proteiche su immagini confocali dove c'è un'alta densità nucleare e quando si desidera studiare le eterogeneità all'interno delle popolazioni cellulari.

Per iniziare, usa una fiamma libera su una pipetta pasteur di vetro per disegnare un'estremità capillare sulla punta. Strofinare delicatamente l'estremità più lontana della pipetta contro il capillare, per romperla e creare un'estremità smussata. Dopo aver sacrificato una femmina di topo incinta nel giorno di sviluppo embrionale desiderato, esporre i visceri addominali secondo il protocollo di testo e localizzare l'utero.

Tenere l'estremità cervicale, tagliare la cervice e tirare delicatamente verso l'alto per allungare entrambe le corna uterine. Elimina il grasso, facendo attenzione a non perforare la parete uterina. Tagliare sopra gli ovidotti, sotto le ovaie, per rilasciare l'intero utero e posizionarlo su una capsula di Petri.

Quindi, copri l'utero con PBS e separa entrambe le corna uterine tagliando l'estremità prossimale su entrambi i lati della cervice. Quindi separare ogni ovidotto dall'utero tagliando sotto l'istmo che li collega. Sotto un microscopio da dissezione, utilizzare una siringa da un ml con un ago ipodermico per espellere le blastocisti dall'utero e nel mezzo di manipolazione, forzando 0,5-1 ml di terreno attraverso ciascun corno dall'apertura cervicale.

Attendere fino a uno o due minuti affinché le blastocisti affondino sul fondo del piatto dopo il risciacquo. Quindi individuare le blastocisti e, utilizzando la pipetta pasteur in vetro controllata a bocca con un'estremità capillare, raccogliere le blastocisti e trasferirle in una goccia fresca di terreno. Dopo aver risciacquato le blastocisti, rimuovere la zona pellucida utilizzando la soluzione acida di Tyrode per lavare brevemente gli embrioni.

Non appena la zona non è più visibile, trasferire nuovamente le blastocisti nel mezzo di manipolazione. Lavare le blastocisti in PBS a temperatura ambiente e fissarle trasferendole al 4% di PFA in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo la fissazione, trasferire nuovamente le blastocisti in PBS per la conservazione a quattro gradi Celsius.

Dopo aver eseguito l'imunofluorescenza secondo il protocollo di testo, utilizzare una pipetta a bocca fine per fare microgocce di PBS o soluzione di colorante nucleare sulla superficie di vetro di un piatto con fondo di vetro da 35 mm e coprirle con olio minerale. Posizionare gli embrioni nelle microgocce e disporgli in modo coerente, preferibilmente con l'accesso alla cavità ICM parallelo alla superficie del vetro, quindi posizionare il piatto sul supporto del microscopio. Per eseguire l'imaging confocale, utilizzare la potenza laser più bassa che fornisce un forte rapporto segnale/rumore senza sbiancare i fluorofori.

Regola il guadagno e l'offset per ottenere la gamma dinamica più ampia senza sovraesporre il campione. L'acquisizione della maggior parte o dell'intera gamma della scala di grigi faciliterà il rilevamento di piccole differenze di intensità tra le immagini. Segui i dettagli aggiuntivi delineati nel protocollo di testo per visualizzare gli embrioni lungo l'intero asse Z.

Segui l'interfaccia utente grafica dello strumento di segmentazione basato su MATLAB Modular Interactive Nuclear Segmentation, o MINS, per caricare un'immagine confocale o un intero stack Z di dati grezzi generati dal microscopio. Per visualizzare l'esito di ogni passaggio, fare clic sul pulsante Visualizza corrispondente. Un tag giallo sopra il pulsante indica l'operazione in corso.

Un tag verde indica che l'operazione è stata completata. Valutare l'esito della fase di rilevamento prima di procedere alla segmentazione. Se non è soddisfacente, modificare i parametri di rilevamento ed eseguirlo nuovamente.

Dal menu di esecuzione della modalità batch, fare clic su Aggiungi filee caricare tutti i file da elaborare contemporaneamente. Fare clic su Avvia modalità batch"e attendere il tempo al software di elaborare i file. L'output della segmentazione verrà salvato nella stessa directory dei file originali.

Identificare i falsi positivi come vescicole apoptotiche o altri elementi che non sono nuclei intatti ma che potrebbero essere stati identificati come tali dal MINS. Elimina i record corrispondenti per i falsi positivi da starstatistics. file csv.

Conservare il file starstatistics. csv originale per riferimento futuro e modificarne solo una copia. Se un nucleo è stato sovrasegmentato e presentato come due o più nuclei, unire i record facendo la media del loro livello di intensità, oppure mantenere uno dei record per quella cellula e scartare il resto.

Per risolvere il problema della segmentazione, identificare gli eventi in cui MINS non è riuscito a rilevare il confine tra due o più nuclei e li ha segmentati come uno solo, o in cui non è riuscito a rilevare un nucleo del tutto. Utilizzare ImageJ per misurare il livello medio di grigio per ciascun canale nelle celle inferiori o non segmentate. Successivamente, trova una sezione mediale del nucleo inferiore o non segmentato sul canale del DNA, utilizzando lo strumento di selezione a mano libera, delinea il perimetro del nucleo inferiore o non segmentato.

Quindi, premi Ctrl M"o vai al menu Analizza"e seleziona Misura"Questo registrerà il valore medio di grigio per l'area delineata e lo visualizzerà in una nuova finestra. Utilizzando la stessa area delineata appena selezionata nel canale del DNA, ripetere la misurazione di ciascuno dei canali di fluorescenza di interesse. I risultati verranno capovolti a quelli precedenti nella finestra dei risultati delle misurazioni.

Quindi utilizzare le misurazioni ottenute per sostituire i record errati nel file starstatistics. csv. Se il nucleo è stato sottosegmentato, duplicare la sua riga, assegnare ID di cella diversi a ciascuna nuova cella e introdurre i valori ottenuti in ImageJ nella colonna corrispondente.

In questo caso, entrambe le celle condivideranno le coordinate spaziali. Quando i nuclei mitotici devono essere considerati separatamente nell'analisi, valutarli manualmente e aggiungere le informazioni al file di dati. Fare riferimento al protocollo di testo per ulteriori istruzioni sull'elaborazione delle immagini.

Questa figura mostra esempi di blastocisti intatte in diversi stadi con una cavità espansa. Qui sono mostrati esempi di buoni anticorpi per un certo numero di proteine nucleari, tra cui CDX2, GATA4, GATA6, NANOG e OCT4. Questo campione è stato marcato con la proteina citoplasmatica DAB2 che fornisce un elevato rapporto segnale/rumore.

In questo pannello, vengono mostrati esempi di una cattiva colorazione per GATA4 con un basso rapporto segnale/rumore, in cui i campioni sono stati fissati solo per 10 minuti. Questo particolare anticorpo anti-GATA4 richiede una fissazione notturna per fornire un segnale forte. Questi embrioni sono stati ripresi con un obiettivo a immersione in olio 40x con una NA di 1,30 e una distanza di lavoro di 0,21 mm. I pannelli centrali mostrano gli ingrandimenti degli ICM o dei singoli nuclei e il confine tra di loro può essere distinto.

I pannelli inferiori illustrano come più avanzato è l'embrione, maggiore è la densità nucleare e quindi maggiore è la possibilità di errori di segmentazione. Queste immagini mostrano errori che MINS può commettere, come il rilevamento di nuclei apoptotici come cellule vive, una segmentazione eccessiva o insufficiente. Questa sequenza di fette Z rivela un evento di sottosegmentazione, in cui due celle sono state identificate come una.

Una volta padroneggiato, questo protocollo può essere eseguito in tre o quattro giorni dall'inizio alla fine, con un carico di tempo da due a quattro ore al giorno. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di essere molto coerenti con le condizioni dell'esperimento, ovvero i protocolli di immunofluorescenza e i parametri di imaging. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia dello sviluppo dei topi per eseguire analisi quantitative in situ dell'espressione genica e proteica in singole cellule.

Dopo aver visto questo video, avrai una buona comprensione di come acquisire dati di immagine appropriati per l'analisi quantitativa dell'espressione in situ.