Loss e approccio guadagno-di-funzione per indagare cellulare precoce Fate Determinanti in preimpianto embrioni di topo

L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere un in perdita e guadagno-di metodo di funzione che è applicabile per identificare neogenin come un recettore specifico stadio che porta a trophectoderm e la differenziazione massa cellulare interna di embrioni preimpianto mouse.

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di utilizzare manipolazioni di perdita e guadagno di funzione per identificare molecole specifiche dello stadio che controllano la differenziazione della massa cellulare interna degli embrioni di topo durante il preimpianto. Questo metodo può aiutare a rispondere alla domanda chiave riguardante la liberazione precoce del destino cellulare nella biologia dello sviluppo di base, così come nella biologia delle cellule staminali, nelle scienze animali e nelle biotecnologie riproduttive, come la clonazione animale. L'obiettivo principale di questa tecnica è che il recettore specifico dello stadio e ci sono ligandi di utilizzo per migliorare l'espressione del solo fattore specifico delle cellule staminali embrionali durante lo sviluppo dell'embrione.

Questo protocollo è stato sviluppato in collaborazione con diversi laboratori. A dimostrare il processo saranno il mio collaboratore, il professor Sang Jin Lee, e il suo studente laureato, Yong Il Cho. Da 18 a 20 ore dopo l'ultima iniezione, sacrificare le femmine gravide mediante intossicazione da anidride carbonica seguita da lussazione cervicale.

Quindi, apri il retro e taglia lo strato interno con le forbici sottili. Trova e raccogli le corna uterine usando una pinza sottile ed estraile delicatamente dalla cavità del corpo, insieme all'utero, all'ovidotto, all'ovaio e ai cuscinetti adiposi. Quindi, taglia l'area tra l'ovidotto e l'ovaio usando le forbici sottili.

Quindi, riposiziona la pinza e taglia l'utero vicino all'ovidotto, lasciando attaccato almeno un centimetro della parte superiore dell'utero. Ora, trasferire l'ampolla oviduttale nella goccia di terreno M16 ricoperta di olio minerale su una piastra di Petri da 35 millimetri a temperatura ambiente. Riunisci gli ovidotti di diversi topi nello stesso piatto.

Dopo aver preparato l'ago della siringa a un CC, come indicato nel protocollo di testo, utilizzare una pinza fine per tenere ed entrare nell'estremità dell'ovidotto. Quindi forare delicatamente e spremere la massa cumuliforme nella fase di caduta del terreno. Sotto uno stereomicroscopio, recuperare gli embrioni 2-PN insieme alle masse di cumulo circostanti, utilizzando una pipetta di vetro sterile, e trasferirli in una nuova capsula di Petri.

Successivamente, dissociare le cellule del cumulo immergendo i tessuti in un millilitro di soluzione di ialuronidasi. Ora, incuba il piatto a 37 gradi Celsius per cinque-10 minuti. Il passo successivo è quello di denudare gli embrioni.

Usando la pipetta di vetro, far scorrere delicatamente la soluzione del bagno per rilasciare le cellule del cumulo dagli embrioni circostanti. Successivamente, lavare gli embrioni denudati con 30-50 millilitri di PBS fresco per embrione. Eseguire questo lavaggio tre volte.

Ora, trasferisci gli embrioni in una capsula di plastica da 35 millimetri con M16 più BSA e conservali in un'incubatrice umidificata per un massimo di quattro ore prima della microiniezione. Prima della microiniezione, lavare brevemente gli embrioni 2-PN denudati con un millilitro di M16 fresco. Quindi, trasferire gli embrioni in soluzione in una provetta da centrifuga e centrifugarli a 1.000 g per 10 minuti.

Ora, trasferisci ogni embrione in una piastra di coltura con 20-30 microlitri di terreno M16. Questo renderà visibili i pronuclei. Coprire il terreno con un sottile strato di olio minerale e incubare gli embrioni a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per una o due ore.

Nel frattempo, con un estrattore meccanico, preparare le pipette per iniezione e le pipette di tenuta dal tubo capillare in vetro borosilica. Successivamente, utilizzando un microgrinder e un microforger, fabbricare le pipette di iniezione con punte smussate e lucidarle in aperture larghe due micron. La lunghezza della punta deve essere inferiore a 500 micron.

Allo stesso modo, fabbricare pipette di tenuta realizzando punte smussate e lucidando le loro aperture fino a un diametro interno di 20 micron e un diametro esterno di 100 micron. Ora, caricare le pipette per iniezione con almeno 200 nanolitri di soluzione plasmidica a una concentrazione di un microgrammo di DNA per microlitro. Successivamente, montare la pipetta di iniezione in un micromanipolatore motorizzato.

Quindi, impostare l'iniettore su impulsi di circa 10 picolitri. Per la microiniezione, fissare gli embrioni utilizzando la pressione negativa della pipetta di mantenimento. Quindi, avanzare e posizionare la punta della pipetta per iniezione adiacente alla membrana cellulare appena sopra uno dei pronuclei.

Quindi, infilzare la membrana cellulare, spingere ulteriormente nel pronucleo ed effettuare l'iniezione da 10 picolitri. Dopo la microiniezione, raccogliere gli embrioni iniettati e lavarli tre volte con terreno M16 fresco. Ogni lavaggio può durare meno di un minuto.

Quindi, procedere con la coltura degli embrioni coprendo il terreno M16 con una goccia di olio minerale per evitare che evapori e posizionando ogni embrione su una piastra di coltura di plastica su una goccia di terreno M16. Ogni 24 ore, osserva gli embrioni utilizzando un microscopio confocale a scansione laser con ottica DIC a 488 nanometri o 555 nanometri con ingrandimento 200x. La neogenina è espressa transitoriamente durante le prime fasi di sviluppo del preimpianto.

Appare già allo stadio a 2 cellule e dura fino allo stadio iniziale di morula. La sua espressione è principalmente limitata spazialmente all'esterno delle cellule. I livelli di espressione della neogenina sono stati manipolati microiniettando zigoti 2-PN con vettori di cDNA neogeninico, o vettori che ospitano RNA a forcina corta contro la neogenina.

RFP e GFP sono stati coespressi come indicatori. Il livello di espressione della neogenina risultante è stato confermato sia dall'immunofluorescenza che dall'immunoblotting. Non ci sono state differenze morfologiche grossolane né negli embrioni con perdita di neogenina né in quelli con guadagno di neogenina, né si sono sviluppati in modo diverso fino allo stadio di blastocisti.

Tuttavia, lo sviluppo dell'ICM è stato meno pronunciato negli embrioni con perdita di neogenina, come misurato dalle cellule ICM positive del terzo e del quarto ottobre. Inoltre, c'erano più cellule ICM positive per blastocisti negli embrioni con guadagno di neogenina. Questa osservazione è stata ulteriormente confermata dall'analisi rtPCR.

Negli embrioni con guadagno di neogenina, le espressioni di Oct 3 e Four, SOX2 e Nanog sono aumentate notevolmente, in contrasto con un cambiamento trascurabile dell'espressione di Cdx2 e Tead4. Una volta padroneggiata, questa parte di microiniezione di questo protocollo può essere completata in circa un'ora. Mentre tenti questo protocollo, tieni presente che l'embrione 2-PN è una microiniezione di isolamento ottimizzata per congelatori che sta coltivando l'embrione per ridurre al minimo il danno.

A complemento di questo metodo procedurale, come gli studi sui farmaci, possono essere eseguiti per rispondere a domande annose sulla via di segnalazione e così via.