Robusto confronto dei livelli della proteina attraverso tessuti e sviluppo utilizzando standardizzati quantitativa Western Blotting

Questo protocollo può essere utilizzato per affrontare importanti questioni nella ricerca fondamentale e clinica esaminando l'espressione proteica tra diversi tessuti e punti di tempo. Per eseguire un blotting quantitativo occidentale affidabile, combiniamo una macchia proteica totale fluorescente con un controllo interno del carico. Ciò supera i limiti che sorgono quando si confrontano vari tessuti in condizioni sperimentali.

Per estrarre proteine da campioni di cellule o tessuti congelati a scatto, scongelare i campioni di meno 80 gradi sul ghiaccio prima di lavare i campioni a seconda dei casi, secondo la tabella. Utilizzando un omogeneizzatore elettrico portatile con un pestello in polipropilene, omogeneizzare i campioni lavati, risciacquando il pestello in acqua doppia distillata e asciugandosi con un tessuto pulito tra i campioni. Lasciare i campioni sul ghiaccio per 10 minuti, seguiti da centrifugazione.

Quindi, trasferire il supernatante contenente campioni proteici in un nuovo tubo sul ghiaccio senza disturbare il pellet. Per quantificare la concentrazione proteica, stabilire norme per l'albumina del siero bovino a concentrazioni crescenti in triplice copia e aggiungere un microliter di ciascun campione proteico in duplice copia ai pozzi appropriati di una piastra ottica a 96 pozzetti. Incubare la proteina su un blocco termico di 60 gradi Celsius per 10 minuti o più se si prevede che la concentrazione proteica sia bassa e misurare l'assorbimento a 560 nanometri su un lettore di piastre.

Esportare le misurazioni del lettore di lastre e calcolare la concentrazione proteica confrontando i valori medi di assorbanza di ciascun campione con una curva standard ottenuta utilizzando lo standard proteico. Per normalizzare la quantità di proteine, preparare le diluizioni dei campioni proteici nel tampone del campione e nell'acqua ultra pura e incubare i campioni in un blocco di calore di 70 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, posizionare i campioni sul ghiaccio prima di vortice e centrifugare brevemente.

Per l'elettroforesi, impostare un gel gradiente prefabbricato da quattro a 12%Bis-Tris nel sistema a camera di elettroforesi in gel e caricare 3,5 microlitri di uno standard proteico nel pozzo. Quando si utilizza uno standard interno per la normalizzazione tra membrane, caricare una quantità uguale agli altri campioni nei primi tre pozzi accanto alla scala proteica e caricare 30 microgrammi di ogni campione nei pozzi rimanenti. Quindi, eseguire i campioni attraverso il gel impilamento a 80 volt per 10 minuti seguito da 150 volt per altri 45-60 minuti.

Al termine dell'elettroforesi, per assemblare la pila di trasferimento, posizionare il gel proteico sulla pila inferiore contenente la membrana di difluoruro di polivinilidene seguita dalla carta filtrante. Utilizzare il rullo di soffiatura per rimuovere eventuali bolle d'aria e posizionare la pila superiore sulla parte superiore della carta filtrante prima di far rotolare di nuovo la pila per rimuovere le bolle d'aria. Trasferire l'intera pila nel dispositivo di trasferimento con l'elettrodo sul lato sinistro del dispositivo e posizionare la spugna di gel sopra la pila in modo che la spugna sia allineata con i corrispondenti contatti elettrici sul dispositivo.

Dopo aver chiuso il coperchio, selezionare e avviare il programma appropriato. Alla fine del programma, tagliare la membrana alle dimensioni del gel e lavare rapidamente la membrana tagliata con acqua doppia distillata prima di continuare con la macchia proteica totale. Per la colorazione proteica totale, arrotolare la membrana in un tubo da 50 millilitri con il lato proteico rivolto verso l'interno ed etichettare la membrana con cinque millilitri di soluzione proteica su un rullo per cinque minuti a temperatura ambiente in una cappa aspirante.

Al termine dell'incubazione, lavare rapidamente la membrana con cinque millilitri di soluzione di lavaggio, restituendo brevemente il tubo al rullo tra i lavaggi, seguito da un breve risciacquo con acqua ultra pura. Aggiungere tre millilitri di tampone di blocco alla membrana e riportare la membrana sul rullo per 30 minuti a temperatura ambiente. Sostituire il tampone di blocco con l'anticorpo primario di interesse alla concentrazione ottimizzata appropriata e incubare la membrana sul rullo durante la notte a quattro gradi Celsius.

Il giorno successivo, lavare la membrana sei volte per cinque minuti con cinque millilitri di PBS fresco per lavaggio sul rullo a temperatura ambiente. Dopo l'ultimo lavaggio, incubare la membrana con l'appropriata soluzione anticorpale secondaria sul rullo per un'ora a temperatura ambiente seguita da tre lavaggi per 30 minuti per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, asciugare la membrana e utilizzare un foglio di alluminio per mantenere la membrana protetta dalla luce.

Per l'acquisizione dell'immagine, posizionare la membrana sullo scanner con il lato proteico rivolto verso il basso e selezionare l'area di scansione nel software. Quindi, acquisire immagini in entrambi i canali ed esportare le immagini in un programma di analisi delle immagini appropriato. Visualizzate il canale di 700 nanometri per visualizzare il risultato totale della colorazione delle proteine e selezionate Analisi (Select Analysis) e Disegna rettangolo (Draw Rectangle) per definire l'area di interesse per la normalizzazione.

Quindi, copiare e incollare la prima area rettangolare in ogni singolo campione per assicurarsi che l'area definita sia della stessa dimensione per tutte le corsie analizzate. Per quantificare la concentrazione proteica in ogni corsia, copiare i risultati sia dalla macchia proteica totale che dalla proteina di interesse in un programma di foglio di calcolo e determinare il segnale di macchia proteica totale più alto. Quindi, dividere ogni valore totale del segnale di macchia proteica per questo valore per ottenere il valore di carico delle proteine normalizzate e dividere il valore del segnale di 800 nanometri da ogni singolo campione per il corrispondente valore proteico normalizzato per calcolare il rapporto di espressione proteica relativa in diversi campioni.

In queste macchie occidentali rappresentative, le proteine estratte dai tessuti ottenuti dai topi del quinto giorno post-natale vengono confrontate con le proteine estratte da topi adulti di 10 settimane. La quantificazione dell'intensità di fluorescenza della macchia proteica totale è stata ottenuta misurando l'intensità della fluorescenza all'interno della scatola rettangolare su ogni corsia. Quando vengono analizzate intere corsie, l'intensità della fluorescenza rimane relativamente simile tra i campioni, indicando che l'uso della macchia proteica totale per la normalizzazione è adatto a questo scopo.

La macchia proteica totale fluorescente può anche essere utilizzata per confrontare i livelli proteici in diversi punti di tempo di sviluppo. Ad esempio, sebbene i livelli di proteine dei motoneuroni di sopravvivenza diminuiscano chiaramente con l'età nei topi, la quantificazione totale macchiata di proteine rimane costante. L'uso di standard interni, normalizzazione basata sulla fluorescenza e statistiche adeguate aumenta la robustezza dell'analisi complessa dell'espressione proteica in diverse condizioni.

Questo protocollo si aggiunge alle tradizionali tecniche western blot, superando i problemi di controlli di carico appropriati e confronti tra lotti sperimentali e fornendo flessibilità per l'analisi dell'espressione proteica. Questo approccio può essere esteso al confronto dell'espressione proteica in altre condizioni sperimentali.