Temporale ordinazione di espressione Dynamic Data di espressione spaziale dettagliata Mappe

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è quello di mappare le dinamiche di espressione genica spazio-temporale dell'orologio di segmentazione dei vertebrati utilizzando un campionamento tissutale fisso. Questo metodo consente una valutazione imparziale della dinamica genica oscillatoria nel mesoderma presomitico, e questo è fondamentale per comprendere i meccanismi molecolari che regolano la somatogenesi dei vertebrati. Il vantaggio principale di questa tecnica è che molti campioni possono essere generati ed elaborati contemporaneamente, consentendo l'analisi in tre parti della dinamica dell'espressione genica in tessuto fisso.

A dimostrare la procedura sarà la dottoressa Charlotte Bailey, che è un'ex post-doc nel mio laboratorio. Dopo aver ottenuto un corno uterino di topo secondo il protocollo di testo, sotto uno stereomicroscopio, ho usato delle forbici curve per tagliare la spessa membrana muscolare del corno uterino ed estrarre con cura ogni embrione. Con le forbici curve e le pinze sottili, seziona il sacco amniotico da ogni embrione.

Quindi, utilizzando un ago chirurgico o delle forbici curve, prelevare il tessuto della coda da ciascun embrione tagliando l'embrione anteriormente alle gemme degli arti posteriori. Bilanciare il tessuto caudale con il lato ventrale rivolto verso il basso. Quindi generare coppie di espianti di PSM sezionando il tessuto della coda in due metà lungo la linea mediana, utilizzando un leggero movimento oscillatorio con l'ago.

Assicurarsi che il tubo neurale, la notocorda e il tessuto PSM siano equamente divisi tra i due espianti. Quindi pipettare ciascun espiantante di PSM controlaterale sul lato inferiore di un coperchio di plastica da 35 mm in un piccolo volume di terreno di coltura preriscaldato. Posiziona il piatto sulla parte superiore del coperchio e capovolgilo rapidamente, in modo che il fazzoletto PSM sia sospeso dal coperchio in una goccia di terreno pendente.

Quindi coltivare gli espianti di PSM in una camera umidificata a 37 gradi Celsius per una o due ore. Trasferire coppie di espianti di PSM nei singoli pozzetti di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti. Quindi aggiungere il 4% di paraformaldeide in PBS ai campioni e incubare la piastra a temperatura ambiente per un'ora, o a quattro gradi Celsius su una piattaforma oscillante per una notte.

Dopo l'incubazione, utilizzare il PBS per lavare i pozzetti del campione a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante. Con una pipetta Pasteur di plastica fine, sostituire la soluzione PBS sui campioni tre o quattro volte. Per eseguire l'immunoistochimica, aggiungere il 2% di Triton X-100 in PBS a un espiante di PSM da ciascuna coppia embrionale e incubare i campioni a temperatura ambiente su una piattaforma a dondolo per un'ora per lavarli.

Utilizzare PBS per risciacquare brevemente i campioni. Quindi sostituire il PBS con una soluzione bloccante e incubare i campioni a quattro gradi Celsius su una piattaforma oscillante per una notte. Utilizzando il tampone di lavoro, diluire gli anticorpi primari desiderati.

In questo esempio, gli anticorpi Delta-like 1 e Notch1 vengono utilizzati a una diluizione di 1:25. Aggiungere gli anticorpi agli espianti e incubare i campioni su una piattaforma oscillante a quattro gradi Celsius per tre-cinque giorni. Dopo l'incubazione, utilizzare il PBS per lavare i campioni due volte per cinque-dieci minuti ciascuno.

Quindi eseguire tre lavaggi in Triton X-100 allo 0,3% in PBS a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante. Dopo aver diluito gli anticorpi secondari nel tampone di lavoro, aggiungere 250-500 microlitri della soluzione anticorpale a ciascun pozzetto del campione, facendo attenzione a non utilizzare gli ultimi microlitri di soluzione, che possono contenere aggregati di anticorpi. Con un foglio di stagnola, coprire la piastra e incubare i campioni in una soluzione di anticorpi secondari al buio a quattro gradi Celsius per tre-cinque giorni.

Dopo l'incubazione, utilizzare PBST per lavare i campioni due volte per dieci minuti ciascuno. Quindi utilizzare PBS per lavare il fazzoletto una volta a temperatura ambiente su una piattaforma a dondolo per cinque minuti. Seguendo il protocollo di testo, disidratare e reidratare i restanti espianti di PSM controlaterale attraverso una serie di diluizioni PBST con etanolo.

Aggiungere dieci microgrammi per millilitro di proteinasi K allo 0,1% di PBST agli espianti e incubare il tessuto senza agitazione per cinque minuti. Quindi rimuovere rapidamente la soluzione di proteinasi K e utilizzare PBST per risciacquare brevemente i campioni. Aggiungere il 4% di formaldeide e lo 0,1% di glutaraldeide in PBST agli espianti di PSM per postfissarli e incubare i campioni per 30 minuti.

Quindi, dopo aver utilizzato PBST per lavare i campioni due volte per dieci minuti ciascuno, aggiungere una miscela di ibridazione al 50% al tessuto e incubare a 65 gradi Celsius senza agitazione per dieci minuti. Dopo aver incubato i campioni e la miscela di ibridazione secondo il protocollo di testo, rimuovere la soluzione e aggiungere da 0,25 a 0,5 millilitri di miscela di ibridazione preriscaldata contenente una sonda di RNA antisenso marcata con digossigenina contro un componente noto dell'orologio di segmentazione. Utilizzare del nastro adesivo per sigillare la piastra e incubare i campioni a 65 gradi Celsius per due notti.

Dopo l'incubazione, utilizzare una miscela di ibridazione preriscaldata al 50% in TBST per lavare i campioni per 15 minuti. Quindi utilizzare TBST per sciacquare i campioni due volte prima di incubare il tessuto in TBST a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante per 30 minuti. Successivamente, pre-incubare gli espianti in soluzione bloccante per un minimo di due ore.

Quindi sostituire la soluzione con una soluzione bloccante fresca, contenente una diluizione 1:200 dell'anticorpo anti-digossigenina coniugato HRB. Incubare i campioni a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, utilizzare TBST per sciacquare i campioni tre volte a temperatura ambiente e trasferirli nei singoli pozzetti di una nuova piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti.

Quindi, con TBST, lavare gli espianti tre volte per un'ora ciascuno. Utilizzare un kit di amplificazione del segnale della tiramide per visualizzare l'mRNA rilevato prima di preparare i campioni per l'imaging. Preparare un vetrino di adesione caricato per ogni coppia di espianti rimuovendo il rivestimento adesivo da un distanziatore di imaging di 0,12 mm di spessore e incollandolo su un vetrino.

Dopo aver posizionato una coppia o un espiante sul vetrino secondo il protocollo di testo, lasciare che i campioni aderiscano al vetrino per 45-60 secondi, fino a quando il tessuto inizia ad apparire appiccicoso e traslucido senza asciugarsi completamente. Nel frattempo, utilizzare una pinza per rimuovere il rivestimento adesivo rimanente dal distanziatore e aggiungere una grande goccia di mezzo di montaggio a doppia funzione e soluzione di pulizia ai campioni al centro del distanziatore. Applicare un vetrino coprioggetti circolare sui campioni assicurandosi che il mezzo di montaggio sia distribuito uniformemente e che tutti i bordi entrino in contatto con il distanziatore.

Quindi posizionare il vetrino coprioggetti capovolto su della carta a basso contenuto di pelucchi. Premere con decisione per assicurarsi che il vetrino coprioggetti aderisca completamente al distanziatore e che il supporto di montaggio in eccesso venga rimosso. Ripetere questo processo fino a quando il supporto di montaggio non macchia più la carta.

Pulire ed etichettare il vetrino e conservarlo al buio fino all'imaging. Quindi eseguire l'imaging e l'analisi secondo il protocollo di testo. In questo esperimento, è stato dimostrato che l'espressione delle proteine Delta-Like 1 e Notch1 oscilla fuori sincronia organizzando temporaneamente gli embrioni secondo la trascrizione nascente della frangia lunatica intronica del gene dell'orologio di segmentazione regolata da Notch rilevata in metà di ciascuna coppia di espianto.

I pannelli sono disposti secondo le fasi uno, due e tre del ciclo di clock di segmentazione. L'estensione dei domini di espressione per Delta-Like 1, Notch1 e la frangia lunatica intronica lungo l'asse anteroposteriore del PSM è delimitata da barre codificate a colori. Come mostrato qui, viene generato un grafico per quantificare l'intensità del segnale Delta-Like 1, Notch1 e della frangia lunatica intronica in relazione all'asse anteroposteriore del PSM e illustra la variazione assiale e l'intensità del segnale attraverso il PSM durante il ciclo di clock.

I chimografi visualizzano la distribuzione spaziale di Delta-Like 1, Notch1 e frangia lunatica intronica in numerosi PSM. Ogni riga del chimografo rappresenta l'intensità del segnale di un singolo espiante PSM. La quantificazione dell'intensità del segnale Delta-Like 1, Notch1 e della frangia lunatica intronica in relazione all'asse anteroposteriore del PSM rivela una chiara dinamica di espressione oscillatoria per questi bersagli.

Infine, questi chimografi mostrano la distribuzione spaziale della forma scissa e attivata del recettore di Notch NICD, Delta-Like 1, frangia lunatica intronica e Notch1 in numerosi PSM. Questa tecnica ha aiutato i ricercatori nel campo della mitogenesi dei vertebrati a comprendere meglio le dinamiche di oscillazione genica della segmentazione nel mesoderma presomitico di pollo e topo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita su un gran numero di campioni, consentendo di analizzare contemporaneamente i profili di espressione di diversi mRNA e proteine di interesse.

Seguendo questa procedura, un'ulteriore quantificazione dei dati dell'immagine può fornire una comprensione dei ritardi temporali nell'espressione genica e della localizzazione subcellulare sia dell'RNA che dei segnali proteici di interesse per il ricercatore. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come mappare le dinamiche di espressione genica spazio-temporale dell'orologio di segmentazione dei vertebrati utilizzando il campionamento di tessuti spessi. Questo può essere seguito da un'analisi automatizzata delle immagini, come descritto nel protocollo di testo.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante garantire un'equa distribuzione di PSM, notocorda e tubo neurale tra gli espianti di PSM e ottimizzare attentamente le diluizioni degli anticorpi prima di iniziare. Ricorda che lavorare con formammide, paraformaldeide e glutaraldeide può essere estremamente pericoloso. Fare attenzione a indossare dispositivi di protezione individuale e lavorare in una cappa aspirante, se applicabile.