Temporale ordinazione di espressione Dynamic Data di espressione spaziale dettagliata Mappe

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è mappare la dinamica spazio-temporale dell'espressione genica del clock di segmentazione nei vertebrati, utilizzando campioni di tessuto fissato. Questo metodo consente una valutazione imparziale della dinamica oscillante dei geni nel mesoderma presomitico, aspetto fondamentale per comprendere i meccanismi molecolari che regolano la somatogenesi nei vertebrati. Il principale vantaggio di questa tecnica è che è possibile generare ed elaborare contemporaneamente numerosi campioni, permettendo un'analisi tridimensionale ad alta risoluzione della dinamica dell'espressione genica su tessuto fissato.

La procedura sarà dimostrata dalla dottoressa Charlotte Bailey, già post-dottoranda nel mio laboratorio. Dopo aver ottenuto un corno uterino di topo seguendo il protocollo descritto nel testo, utilizzare sotto un microscopio stereoscopico delle forbici curve per tagliare la spessa membrana muscolare del corno uterino ed estrarre con attenzione ciascun embrione. Con le forbici curve e pinzette fini, dissezionare con cura la sacca amniotica da ogni embrione.

Quindi, utilizzando un ago chirurgico o forbici curve, prelevare il tessuto della coda da ciascun embrione tagliando l'embrione anteriormente ai dischi delle zampe posteriori. Posizionare il tessuto della coda con il lato ventrale rivolto verso il basso. Successivamente, ottenere coppie di espianti di mesoderma parassiale (PSM) sezionando il tessuto della coda in due metà lungo la linea mediana, utilizzando un movimento delicato a dondolo con l'ago.

Assicurarsi che il tubo neurale, la notocorda e il tessuto del mPSM siano divisi equamente tra i due espianti. Quindi, trasferire con una pipetta ciascun espianto del mPSM controlaterale sul lato inferiore del coperchio di una piastra di coltura in plastica da 35 mm, in un piccolo volume di mezzo di coltura preriscaldato. Posizionare la piastra sopra il coperchio e capovolgerla rapidamente, in modo che il tessuto del mPSM rimanga sospeso dal coperchio in una goccia pendente di mezzo.

Quindi coltivare gli espianti di PSM in una camera umidificata a 37 gradi Celsius per uno o due ore. Trasferire coppie di espianti di PSM nei singoli pozzetti di una piastra per colture cellulari a 24 pozzetti. Successivamente aggiungere il 4% di paraformaldeide in PBS ai campioni e incubare la piastra a temperatura ambiente per un'ora, oppure a quattro gradi Celsius su una piattaforma oscillante durante la notte.

Dopo l'incubazione, utilizzare PBS per lavare le pozzette del campione a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante. Con una pipetta Pasteur di plastica fine, sostituire la soluzione di PBS sui campioni da tre a quattro volte. Per eseguire l'immunohistochimica, aggiungere 2%Triton X-100 in PBS a un espianato di PSM da ogni coppia embrionale e incubare i campioni a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante per un'ora per lavarli.

Usare PBS per risciacquare brevemente i campioni. Quindi sostituire il PBS con la soluzione di blocco e incubare i campioni a quattro gradi Celsius su una piattaforma oscillante durante la notte. Diluire gli anticorpi primari desiderati utilizzando il tampone di lavoro.

In questo esempio, gli anticorpi contro Delta-like 1 e Notch1 vengono utilizzati in una diluizione di 1:25. Aggiungere gli anticorpi agli espianti e incubare i campioni su una piattaforma oscillante a quattro gradi Celsius per tre-cinque giorni. Al termine dell'incubazione, lavare i campioni due volte con PBS, per cinque-dieci minuti ciascuna.

Eseguire quindi tre lavaggi con PBS contenente 0,3% di Triton X-100 a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante. Dopo aver diluito gli anticorpi secondari nel buffer di lavoro, aggiungere da 250 a 500 microlitri di soluzione anticorpale in ogni pozzetto del campione, avendo cura di non utilizzare gli ultimi microlitri di soluzione, che potrebbero contenere aggregati anticorpali. Coprire la piastra con della stagnola e incubare i campioni nella soluzione di anticorpo secondario al buio a quattro gradi Celsius per tre-cinque giorni.

Dopo l'incubazione, utilizzare PBST per lavare i campioni due volte per dieci minuti ciascuno. Quindi utilizzare PBS per lavare il tessuto una volta a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante per cinque minuti. Successivamente al protocollo indicato, disidratare e reidratare gli espianti di PSM controlaterali rimanenti attraverso una serie di diluizioni di etanolo in PBST.

Aggiungere dieci microgrammi per millilitro di Proteinasi K in PBST 0,1% agli espianti e incubare il tessuto senza agitazione per cinque minuti. Rimuovere quindi rapidamente la soluzione di Proteinasi K e risciacquare brevemente i campioni con PBST. Aggiungere ai campioni di espianti di PSM una soluzione di PBST contenente il 4% di formaldeide e lo 0,1% di glutaraldeide per la post-fissazione e incubare i campioni per 30 minuti.

Quindi, dopo aver lavato i campioni due volte con PBST per dieci minuti ciascuno, aggiungere la miscela di ibridazione al 50% al tessuto e incubare a 65 gradi Celsius senza agitazione per dieci minuti. Dopo aver incubato i campioni e la miscela di ibridazione secondo il protocollo indicato, rimuovere la soluzione e aggiungere da 0,25 a 0,5 millilitri di miscela di ibridazione preriscaldata contenente una sonda di RNA antisenso marcata con digossigenina contro un noto componente del clock di segmentazione. Utilizzare nastro adesivo per sigillare la piastra e incubare i campioni a 65 gradi Celsius per due notti.

Dopo l'incubazione, lavare i campioni per 15 minuti con una miscela di ibridazione al 50% preriscaldata in TBST. Successivamente, risciacquare i campioni due volte con TBST prima di incubare il tessuto in TBST a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante per 30 minuti. In seguito, pre-incubare gli espianti in soluzione bloccante per un minimo di due ore.

Sostituire quindi la soluzione con una soluzione bloccante fresca, contenente un'anticorpo anti-digossigenina coniugato con HRB diluito 1:200. Incubare i campioni a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, risciacquare i campioni tre volte con TBST a temperatura ambiente e trasferirli in pozzetti separati di una nuova piastra per colture cellulari a 24 pozzetti.

Quindi lavare gli espianti tre volte con TBST, ogni volta per un'ora. Utilizzare un kit di amplificazione del segnale con tiaramide per visualizzare l'mRNA rilevato prima di preparare i campioni per l'acquisizione delle immagini. Preparare un vetrino adesivo carico per ogni coppia di espianti rimuovendo il rivestimento adesivo da uno spaziatore per immagini dello spessore di 0,12 mm e attaccandolo su un vetrino.

Dopo aver posizionato una coppia di espianti sul vetrino seguendo il protocollo descritto, lasciare aderire i campioni al vetrino per 45-60 secondi, fino a quando il tessuto appare appiccicoso e traslucido senza seccarsi completamente. Nel frattempo, utilizzare una pinzetta per rimuovere la pellicola adesiva residua dallo spaziatore e aggiungere una goccia abbondante di mezzo di montaggio bifunzionale e soluzione chiarificante al centro dei campioni posizionati nello spaziatore. Applicare un coprioggetto circolare sopra i campioni assicurandosi che il mezzo di montaggio sia distribuito uniformemente e che tutti i bordi siano a contatto con lo spaziatore.

Quindi posizionare il vetrino con il coverslip capovolto su un foglio di carta a basso rilascio di pelucchi. Premere con fermezza per assicurarsi che il coverslip aderisca completamente allo spaziatore e che venga rimossa ogni eccedenza di mezzo di montaggio. Ripetere questo procedimento finché nessun altro eccesso di mezzo di montaggio macchia la carta.

Pulire e etichettare il vetrino e conservarlo al buio fino all'acquisizione delle immagini. Successivamente, eseguire l'acquisizione e l'analisi secondo il protocollo descritto nel testo. In questo esperimento, si osserva che l'espressione delle proteine Delta-Like 1 e Notch1 oscilla in modo asincrono, disponendo temporaneamente gli embrioni in base alla trascrizione nascente del gene della clock di segmentazione regolato da Notch, lunatic fringe intronico, rilevata nella metà di ciascuna coppia di espianti.

I pannelli sono disposti in base alla fase uno, due e tre del ciclo del clock di segmentazione. L'estensione dei domini di espressione di Delta-Like 1, Notch1 e lunatic fringe intronico lungo l'asse anteroposteriore del PSM è delimitata da barre codificate per colore. Come mostrato qui, viene generato un grafico per quantificare l'intensità del segnale di Delta-Like 1, Notch1 e lunatic fringe intronico in relazione all'asse anteroposteriore del PSM e illustra la variazione assiale e l'intensità del segnale attraverso il PSM durante tutto il ciclo del clock.

I chimoagrafi visualizzano la distribuzione spaziale di Delta-Like 1, Notch1 e lunatic fringe intronico in numerosi PSM. Ogni riga del chimoagrafo rappresenta l'intensità del segnale di un singolo espianto di PSM. La quantificazione dell'intensità del segnale di Delta-Like 1, Notch1 e lunatic fringe intronico in relazione all'asse anteroposteriore del PSM rivela chiare dinamiche oscillatorie di espressione per questi bersagli.

Infine, questi cimografi mostrano la distribuzione spaziale della forma scissa e attivata del recettore Notch (NICD), di Delta-Like 1, della lunatica frangia intronica e di Notch1 attraverso numerosi mesoderma presomitico (PSM). Questa tecnica ha aiutato i ricercatori nel campo della mitogenesi dei vertebrati a comprendere meglio la dinamica dell'oscillazione dei geni di segmentazione nel mesoderma presomitico di pollo e topo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita su un elevato numero di campioni, consentendo di analizzare contemporaneamente i profili di espressione di diverse mRNA e proteine di interesse.

Seguendo questa procedura, un'ulteriore quantificazione dei dati delle immagini può fornire una comprensione dei ritardi temporali nell'espressione genica, nonché della localizzazione subcellulare dei segnali di RNA e proteina di interesse per il ricercatore. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come mappare la dinamica spazio-temporale dell'espressione genica del clock di segmentazione nei vertebrati mediante campionamento di tessuti spessi. Questo può essere seguito da un'analisi automatizzata delle immagini, come descritto nel protocollo testuale.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante garantire una distribuzione uniforme del mesoderma parassiale, del notocorda e del tubo neurale tra gli espianti di mesoderma parassiale e ottimizzare attentamente le diluizioni degli anticorpi prima di iniziare. Ricordare che lavorare con formammide, paraformaldeide e glutaraldeide può essere estremamente pericoloso. Prestare attenzione a indossare dispositivi di protezione individuale e a lavorare sotto cappa aspirante quando necessario.