Proteine Isolamento dal Sviluppare embrionali di topo Cuore Valve Regione
23 settembre 2014
L'analisi dell'espressione proteica nelle giovani valvole embrionali di topo è stata ostacolata dal limitato tessuto disponibile. Questo manoscritto fornisce un protocollo per la preparazione di proteine da regioni valvolari embrionali di topo in via di sviluppo per l'analisi del western blot.
L'obiettivo generale di questa procedura è isolare ed estrarre proteine dalle valvole cardiache embrionali. Ciò si ottiene isolando prima un embrione da un topo gravido. Nella seconda fase, il cuore viene sezionato dall'embrione, quindi le valvole cardiache vengono raccolte nella fase finale.
Il tessuto viene lisato e il campione proteico risultante viene preparato per la successiva analisi. In definitiva, l'analisi Western BLO può essere utilizzata per valutare i livelli di espressione proteica. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di dissezione sono difficili da apprendere a causa della forma piccola e compatta del cuore in via di sviluppo.
Al giorno di sviluppo embrionale desiderato, utilizzare il 70% di etanolo per sterilizzare l'addome della femmina incinta. Quindi sollevare la pelle e il muscolo del basso addome verso l'alto e lontano dagli organi interni e sezionare la cavità addominale inferiore per consentire l'accesso al corno uterino. Quindi, tieni la cervice con una pinza e taglia con cura la coccola fino alle punte.
Quindi sollevare il corno uterino tagliando il tessuto connettivo che mantiene il corno in posizione e completare la rimozione tagliando la giunzione del corno uterino con l'uct. Mettere il corno uterino sezionato in una capsula di Petri contenente un tampone tris molare freddo da 0,1 e risciacquare se necessario. Quindi tagliare il corno uterino.
Aprire longitudinalmente per esporre le sacche embrionali. Per esporre un embrione, aprire un sacco embrionale all'incrocio tra la placenta e l'embrione e tagliare i vasi ombelicali per liberare l'embrione. Posizionare l'embrione sezionato in una seconda piastra di Petri con tampone tris molare freddo da 0,1 molari e rimettere la prima piastra di Petri con gli embrioni rimanenti e sezionati nel ghiaccio fino alla successiva dissezione embrionale.
Dopo la decapitazione, posizionare l'embrione sulla schiena e tagliare la parete toracica verticalmente lungo il lato della gabbia toracica vicino a una per zoppicare e orizzontalmente sopra il diaframma. Per visualizzare il cuore, apri la parete toracica. Quindi tieni il forcipe in alto lungo i grandi vasi, solleva il cuore e taglia i vasi sottostanti.
Quindi, taglia sopra il forcipe per liberare il cuore. Se i vasi polmonari rimangono integri, rimuovere i polmoni con il cuore prima di continuare agli stadi embrionali qui descritti, l'arteria polmonare è leggermente opaca. Dopo aver identificato l'arteria, tagliarla e rimuoverla al di sopra del livello della valvola.
Ora, tagliare appena sotto la valvola polmonare, evitando il miocardio ventricolare ECD, e rimuovere il tampone tris in eccesso lontano dalla regione di interesse. Prima di posizionare la valvola in un tubo einor contenente due microlitri di tampone di lisi come l'arteria polmonare, l'aorta apparirà leggermente opaca. Dopo la sua identificazione, tagliare appena sotto la valvola aortica.
Anche in questo caso, evitando il miocardio ventricolare trabecolato. Rimuovere l'eventuale soluzione tri in eccesso, quindi trasferire la valvola nel tubo einor contenente lisi, tampone e tessuto dell'arteria polmonare. Dopo che tutto il tessuto è stato raccolto, posizionare immediatamente i campioni a meno 80 gradi Celsius fino a ulteriormente.
Utilizzare per l'estrazione delle proteine, scongelare i tessuti raccolti su ghiaccio, quindi pellettare i campioni per un minuto a 13, 100 g a quattro gradi Celsius. Controllare il volume del campione risultante e utilizzare il tampone di lisi per portare il volume totale fino a 40 microlitri. Quindi aggiungere perline di acciaio inossidabile da cinque millimetri per interrompere e omogeneizzare i campioni in una lyr per due o quattro minuti a 50 hertz, secondo le istruzioni del produttore.
Dopo l'omogeneizzazione, centrifugare brevemente le provette e trasferire i campioni in nuove provette, lasciando dietro di sé i detriti insolubili per ulteriori analisi sperimentali. Utilizzando questa tecnica di preparazione, lo smad fosforilato 1 5 8 può essere rilevato in singole regioni della valvola aortica da embrioni E 13,5. Ad esempio, la proteina isolata anche da una singola regione valvolare è sufficiente per rilevare una debole banda p smad con l'intensità del segnale che aumenta proporzionalmente al numero di regioni valvolari raggruppate.
È importante sottolineare che il rapporto p smad beta actina rimane chiaramente costante tra le diverse dimensioni del campione a causa dei bassi livelli di proteine disponibili, lo stesso blot non può essere rimosso e riesaminato per la smad totale. Tuttavia, un blot separato che mostra smad totale uno e beta actina mostra lo stesso modello di espressione. Queste regioni valvolari sono quasi completamente prive di miocardio ventricolare contaminante utilizzando questa tecnica di preparazione in combinazione con campioni dal ventricolo destro, il marcatore del miocardio ventricolare, una NP non è rilevabile nelle regioni della valvola aortica, mentre questo marcatore è prontamente rilevato nel ventricolo.
Inoltre, il marcatore miocardico ventricolare della catena leggera della miosina due V è anch'esso facilmente rilevabile nel campione ventricolare, ma è appena rilevabile nelle regioni della valvola aortica, sottolineando la precisione della dissezione a seguito di questa dissezione. Altri mes come la QPCR o l'RN AIC possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come quali geni a valle sono influenzati durante le diverse fasi di sviluppo.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per l'isolamento e l'estrazione delle proteine dalle valvole cardiache embrionali nei topi. Il metodo affronta le sfide nell'analisi dell'espressione proteica dovuta alla limitata disponibilità di tessuto.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Biologia dello sviluppo
- Ricerca cardiovascolare
Contesto
- L'analisi dell'espressione proteica nei tessuti embrionali è spesso limitata dalla dimensione del campione.
- Comprendere i livelli delle proteine nelle valvole cardiache è cruciale per gli studi sullo sviluppo.
- L'analisi del western blot è una tecnica comune per valutare l'espressione proteica.
- La dissezione di piccoli tessuti come i cuori embrionali può essere tecnicamente impegnativa.
Obiettivo dello studio
- Fornire un protocollo dettagliato per l'estrazione delle proteine dalle valvole cardiache embrionali del topo.
- Facilitare l'analisi del western blot per studiare i livelli di espressione delle proteine.
- Migliorare la riproducibilità e l'accuratezza nell'analisi delle proteine da campioni limitati.
Metodi utilizzati
- Isolamento degli embrioni da topi incinte.
- Dissezione del cuore dall'embrione.
- Raccolta delle valvole cardiache per l'estrazione delle proteine.
- Lisi del tessuto per preparare i campioni proteici per l'analisi.
Risultati principali
- Estrazione con successo delle proteine dalle valvole cardiache embrionali.
- Preparazione di campioni adatti per l'analisi del western blot.
- Dimostrazione di tecniche di dissezione per un apprendimento efficace.
- Valutazione dei livelli di espressione proteica nei tessuti cardiaci in via di sviluppo.
Conclusioni
- Il protocollo consente lo studio efficace dell'espressione delle proteine nelle valvole cardiache embrionali.
- Gli ausili visivi sono essenziali per padroneggiare le tecniche di dissezione.
- Questo metodo può far progredire la ricerca nello sviluppo cardiaco e nei campi correlati.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Protein isolation from limited embryonic tissue enables detection of signaling pathway activation in early developmental models. This approach supports target validation by providing semi-quantitative data on phosphorylated proteins from pooled microdissected valve regions. The method addresses a key bottleneck in preclinical research where sample scarcity hinders mechanistic de-risking of cardiovascular targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in cardiac valve development through detection of phosphorylated signaling proteins like pSmad1/5/8.
- Operational Value: Provides a reproducible workflow for protein extraction from four E13.5 mouse aortic valve regions, each yielding ~1 µg protein.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by allowing semi-quantitative assessment of pathway activation in disease-relevant embryonic systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological samples for downstream western blot analysis, enabling reliable compound evaluation in phenotypic screening.
- Operational Value: Standardizes lysis and homogenization protocols using Tris-based buffer with protease inhibitors and SDS-sample buffer for denaturation.
- Scalability: Enables platform reuse across developmental timepoints by pooling tissue to overcome low protein yield limitations.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase protein expression data to preclinical validation through consistent pSmad/β-actin ratios across sample sizes.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in target engagement by confirming ventricular myocardium exclusion via absence of MYL2V and ANP markers in valve regions.
- Predictive Confidence: Enables risk-adjusted advancement decisions by linking protein expression patterns to developmental stages using internal controls.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by providing mechanistic readouts from disease-relevant embryonic systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through detection of phosphorylated signaling proteins in valve tissue.
- Screening: Delivers assay-ready samples with standardized protein extraction, enabling reproducible western blot outputs for compound screening.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements via chemiluminescent signal intensity proportional to protein pool size, supporting comparative condition analysis.
- Translational Research: Maintains continuity from embryonic discovery to preclinical models by preserving pathway-specific expression patterns detectable in separate blots for total Smad and β-actin.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable capability for protein isolation across embryonic cardiovascular studies, reducing redundant protocol development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by enabling detection of low-abundance phosphorylated proteins from microdissected tissues.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through defined lysis volumes, bead-based homogenization, and consistent sample preparation for western blot.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in early cardiovascular target assessment.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization by providing semi-quantitative pathway activation data from embryonic valve regions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microdissection of embryonic cardiac structures to isolate valve regions without ventricular myocardium contamination.
- Dependent on instrumentation for homogenization (lyser with stainless steel beads) and centrifugation at 13,100 × g for sample clarification.
- Necessitates cross-team standardization of lysis buffer volumes (40 µL final volume) and protease inhibitor use to ensure sample consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to other embryonic tissues or developmental stages beyond E13.5 aortic valve regions.
- Includes practical limitations such as inability to quantify total protein via spectrophotometry due to low yield, requiring reliance on semi-quantitative western blot analysis.
