Proteine ​​Isolamento dal Sviluppare embrionali di topo Cuore Valve Regione

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare ed estrarre proteine dalle valvole cardiache embrionali. Ciò si ottiene isolando prima un embrione da un topo gravido. Nella seconda fase, il cuore viene sezionato dall'embrione, quindi le valvole cardiache vengono raccolte nella fase finale.

Il tessuto viene lisato e il campione proteico risultante viene preparato per la successiva analisi. In definitiva, l'analisi Western BLO può essere utilizzata per valutare i livelli di espressione proteica. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di dissezione sono difficili da apprendere a causa della forma piccola e compatta del cuore in via di sviluppo.

Al giorno di sviluppo embrionale desiderato, utilizzare il 70% di etanolo per sterilizzare l'addome della femmina incinta. Quindi sollevare la pelle e il muscolo del basso addome verso l'alto e lontano dagli organi interni e sezionare la cavità addominale inferiore per consentire l'accesso al corno uterino. Quindi, tieni la cervice con una pinza e taglia con cura la coccola fino alle punte.

Quindi sollevare il corno uterino tagliando il tessuto connettivo che mantiene il corno in posizione e completare la rimozione tagliando la giunzione del corno uterino con l'uct. Mettere il corno uterino sezionato in una capsula di Petri contenente un tampone tris molare freddo da 0,1 e risciacquare se necessario. Quindi tagliare il corno uterino.

Aprire longitudinalmente per esporre le sacche embrionali. Per esporre un embrione, aprire un sacco embrionale all'incrocio tra la placenta e l'embrione e tagliare i vasi ombelicali per liberare l'embrione. Posizionare l'embrione sezionato in una seconda piastra di Petri con tampone tris molare freddo da 0,1 molari e rimettere la prima piastra di Petri con gli embrioni rimanenti e sezionati nel ghiaccio fino alla successiva dissezione embrionale.

Dopo la decapitazione, posizionare l'embrione sulla schiena e tagliare la parete toracica verticalmente lungo il lato della gabbia toracica vicino a una per zoppicare e orizzontalmente sopra il diaframma. Per visualizzare il cuore, apri la parete toracica. Quindi tieni il forcipe in alto lungo i grandi vasi, solleva il cuore e taglia i vasi sottostanti.

Quindi, taglia sopra il forcipe per liberare il cuore. Se i vasi polmonari rimangono integri, rimuovere i polmoni con il cuore prima di continuare agli stadi embrionali qui descritti, l'arteria polmonare è leggermente opaca. Dopo aver identificato l'arteria, tagliarla e rimuoverla al di sopra del livello della valvola.

Ora, tagliare appena sotto la valvola polmonare, evitando il miocardio ventricolare ECD, e rimuovere il tampone tris in eccesso lontano dalla regione di interesse. Prima di posizionare la valvola in un tubo einor contenente due microlitri di tampone di lisi come l'arteria polmonare, l'aorta apparirà leggermente opaca. Dopo la sua identificazione, tagliare appena sotto la valvola aortica.

Anche in questo caso, evitando il miocardio ventricolare trabecolato. Rimuovere l'eventuale soluzione tri in eccesso, quindi trasferire la valvola nel tubo einor contenente lisi, tampone e tessuto dell'arteria polmonare. Dopo che tutto il tessuto è stato raccolto, posizionare immediatamente i campioni a meno 80 gradi Celsius fino a ulteriormente.

Utilizzare per l'estrazione delle proteine, scongelare i tessuti raccolti su ghiaccio, quindi pellettare i campioni per un minuto a 13, 100 g a quattro gradi Celsius. Controllare il volume del campione risultante e utilizzare il tampone di lisi per portare il volume totale fino a 40 microlitri. Quindi aggiungere perline di acciaio inossidabile da cinque millimetri per interrompere e omogeneizzare i campioni in una lyr per due o quattro minuti a 50 hertz, secondo le istruzioni del produttore.

Dopo l'omogeneizzazione, centrifugare brevemente le provette e trasferire i campioni in nuove provette, lasciando dietro di sé i detriti insolubili per ulteriori analisi sperimentali. Utilizzando questa tecnica di preparazione, lo smad fosforilato 1 5 8 può essere rilevato in singole regioni della valvola aortica da embrioni E 13,5. Ad esempio, la proteina isolata anche da una singola regione valvolare è sufficiente per rilevare una debole banda p smad con l'intensità del segnale che aumenta proporzionalmente al numero di regioni valvolari raggruppate.

È importante sottolineare che il rapporto p smad beta actina rimane chiaramente costante tra le diverse dimensioni del campione a causa dei bassi livelli di proteine disponibili, lo stesso blot non può essere rimosso e riesaminato per la smad totale. Tuttavia, un blot separato che mostra smad totale uno e beta actina mostra lo stesso modello di espressione. Queste regioni valvolari sono quasi completamente prive di miocardio ventricolare contaminante utilizzando questa tecnica di preparazione in combinazione con campioni dal ventricolo destro, il marcatore del miocardio ventricolare, una NP non è rilevabile nelle regioni della valvola aortica, mentre questo marcatore è prontamente rilevato nel ventricolo.

Inoltre, il marcatore miocardico ventricolare della catena leggera della miosina due V è anch'esso facilmente rilevabile nel campione ventricolare, ma è appena rilevabile nelle regioni della valvola aortica, sottolineando la precisione della dissezione a seguito di questa dissezione. Altri mes come la QPCR o l'RN AIC possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come quali geni a valle sono influenzati durante le diverse fasi di sviluppo.