Costo-efficace metodo per il rilevamento di origine microbica Utilizzando specifici virus umani e animali
December 3rd, 2011
Lo studio descrive un metodo conveniente per l'identificazione della fonte di contaminazione fecale / urina o la contaminazione da nitrati in acqua utilizzando qPCR per la quantificazione specifica di virus DNA umano / suini / bovini, adenovirus e poliomavirus, proposti come strumenti di MST.
Metodo economico per il monitoraggio delle fonti microbiche utilizzando virus umani e animali specifici. Lo studio descrive un metodo economico per l'identificazione della fonte di contaminazione delle urine fecali o della contaminazione da nitrati nell'acqua utilizzando la PCR quantitativa per la quantificazione specifica di virus suini, bovini, a DNA virus, adenovirus e poliomavirus umani proposti come strumenti di tracciamento della fonte microbica. Abbiamo sviluppato un protocollo per la concentrazione di virus da campioni di acqua da 10 litri mediante flocculazione organica utilizzando latte scremato, estrazione di acidi nucleici virali dal sedimento e quantificazione di virus DNI umani bovini o suini mediante PCR quantitativa.
È noto che la contaminazione microbica della vitamina rappresenta un rischio significativo per la salute e abbiamo bisogno di conoscere le fonti della contaminazione. Abbiamo proposto l'uso di virus a DNA altamente diffusi come strumenti di tracciamento delle fonti microbiche. I virus selezionati sono adenovirus e poliomavirus.
Questi virus vengono escreti in modo persistente durante tutto l'anno e in tutte le aree geografiche. Ha studiato in studi precedenti. Abbiamo sviluppato metodi robusti e a basso costo di concentrazione per i virus nell'acqua e abbiamo lavorato allo sviluppo di saggi QPCR per la quantificazione degli adenovirus purinici e dei poliomavirus bovini.
Inoltre, utilizziamo adenovirus umani, poliomavirus NGC, testati da QPCR, anche come marcatori di contaminazione umana nell'acqua, raccolta di campioni d'acqua. In questo studio, quattro repliche di 10 litri per campione d'acqua vengono raccolte in contenitori di plastica con fondo piatto e un campione extra come controllo di processo. Quest'ultimo campione sarà seminato con una quantità nota delle particelle virali utilizzate come controllo.
Un controllo negativo viene preparato in laboratorio utilizzando l'acqua del rubinetto in un contenitore di plastica extra da 10 litri. Se il campione presenta un'elevata quantità di materiale sospeso, sabbia e altri materiali, lasciarlo sedimentare per 15 minuti, trasferire l'acqua in un nuovo contenitore. Concentrazione virale mediante flocculazione organica.
Il rilevamento di virus in campioni di acqua poco o moderatamente inquinata richiede la concentrazione dei virus da almeno diversi litri d'acqua in un volume molto più piccolo. La procedura di concentrazione comprende l'acidificazione di campioni d'acqua da 10 litri, la flocculazione utilizzando la gravità del latte scremato, la sedimentazione dei fiocchi e la raccolta del precipitato in 10 millilitri di tampone fosfato per avviare il processo, viene preparata una soluzione di localizzazione del latte scremato in acqua di mare artificiale sciogliendo 10 grammi di latte scremato in polvere in un litro di acqua di mare artificiale e regolando attentamente il pH a 3,5. Con l'acido cloridrico, il gregge dovrebbe essere visibile.
Preparare la soluzione poco prima dell'uso o conservare a quattro gradi Celsius per 24 ore. I campioni d'acqua vengono mescolati e viene misurata la conducibilità nei campioni. Se è inferiore a 1,5 millisiemens, verranno aggiunti sali marini.
Regolare il pH del campione d'acqua a 3,5 mediante l'aggiunta di acido cloridrico. Registrare il pH dei campioni prima e dopo il condizionamento, nonché il volume di acido cloridrico utilizzato. Anche la conducibilità dovrebbe essere registrata.
Dopo aver regolato il pH, aggiungiamo 100 millilitri di latte scremato pref flod, l'1% al campione d'acqua da 10 litri e mescoliamo i campioni per 8-10 ore per consentire ai virus di assorbirsi negli allevamenti. Per il campione spike utilizzato come controllo del processo, aggiungere al campione il volume standard del virus di controllo, ad esempio un millilitro. Smetti di mescolare e lascia che il gregge sedimenti per gravità per otto-10 ore.
Dopo 16 ore, di solito il giorno successivo, saremo in grado di raccogliere i sedimenti. A tale scopo, rimuovere il surnatante utilizzando una pompa peristaltica. Raccogliere il sedimento con i fiocchi, circa 500 millilitri in una bottiglia da centrifuga.
Bilanciare le pentole con l'aggiunta di latte scremato pref flod pH 3,5, centrifugare le pentole con centrifuga ad alta velocità, 8.000 Gs 30 minuti a quattro gradi Celsius. Non appena la centrifuga si ferma, rimuovere con cautela i recipienti della centrifuga dalla centrifuga. Versare molto delicatamente e scartare il surnatante.
Sciogliere il pellet in ogni flacone da centrifuga fino a un volume finale di 10 millilitri di fosfato, estrazione dell'acido nucleico e quantificazione dei virus. Il concentrato virale viene utilizzato per l'estrazione di acidi nucleici virali e dei virus specifici per adenovirus e poliomi di interesse saranno quantificati mediante A-Q-P-C-R. Esegui un'estrazione dell'acido nucleico con il mini kit di RNA virale Key amp.
La lisi dei virus presenti in 140. I microlitri di concentrati virali vengono eseguiti manualmente e gli acidi nucleici totali vengono estratti fino a 80 microlitri. Questo kit consente l'uso di una piattaforma automatizzata come Key cube.
Il passo successivo è la quantificazione del genoma virale. Le copie nei campioni utilizzando una PCR quantitativa con sonde tac man, adenovirus umani, virus JC Polyoma e virus polioma bovino possono essere quantificate nella stessa piastra a 96 pozzetti. Poiché tutti utilizzano gli stessi cicli di amplificazione, gli adenovirus suini devono essere testati separatamente in una piastra indipendente per la quantificazione del virus bersaglio.
Preparare la miscela di PCR quantitativa in un'area separata e pulita. Una volta preparata la miscela, allocare 15 microlitri in ogni pozzetto, compresi i controlli. Aggiungere le estrazioni di acido nucleico dai campioni 10 microlitri in un'area separata, eseguire direttamente e una diluizione di dieci volte in acqua purificata di ciascun campione in duplicato il volume totale per una reazione dopo l'aggiunta del target sarà di 25 microlitri, 15 di miscela più 10 di campione o coprire standard i pozzetti contenenti i campioni con parte di una copertura adesiva.
Conservare l'altra parte del coperchio per il passaggio successivo. Diluizione AB delle sospensioni standard del DNA. 10 microlitri da 10 a zero a 10 a sei copie del genoma, finti microlitri in triplicato e utilizzando un micro pbit utilizzato esclusivamente per la copertura standard del DNA.
I pozzetti contenenti gli standard con il coperchio adesivo precedentemente tagliato. Questa figura mostra la distribuzione dei campioni e dei controlli standard delle sospensioni. Nella piastra a 96 pozzetti.
Eseguire la QPCR in un sistema adeguato, selezionando i parametri appropriati dopo l'attivazione dell'oro di ampiezza per 10 minuti. A 95 gradi Celsius, vengono eseguiti 40 cicli di amplificazione una volta completate le reazioni. Memorizzare i dati e i risultati come descritto nel manuale dell'utente dell'apparecchiatura utilizzata.
La quantità di DNA sarà definita come la mediana dei dati ottenuti dopo aver corretto il fattore di diluizione quando necessario. Il grafico di amplificazione e la curva standard ottenuti per la quantificazione degli adenovirus suini hanno mostrato un coefficiente di correlazione di 0,999. I valori di pendenza accettabili vanno da meno 3,1 a meno 3,6 dopo la procedura.
I virus umani e animali descritti sono stati testati in campioni di acque sotterranee provenienti da un'area che presenta alti livelli di nitrati per definire le fonti di contaminazione. Le quattro repliche analizzate hanno mostrato risultati positivi per il valore medio degli adenovirus suini, 7,74 per 10 a due copie del genoma per litro, che sarebbe correlato alla presenza di liquami suini nell'area circostante il sito di campionamento e dimostrerebbe la presenza di contaminazione fecale suina nelle acque sotterranee. Nessuna contaminazione umana era presente in nessuno dei campioni testati.
I dati virologici sono stati confermati dalla PCR nidificata e dall'analisi di sequenziamento. Conclusione. In questo studio, abbiamo presentato i risultati analizzando campioni di acque sotterranee, presentando la contaminazione di origine suina in assenza di contaminazione umana o bovina. La procedura è stata applicata anche all'analisi delle acque di balneazione, delle acque marine e delle acque fluviali.
Presentiamo qui la procedura per applicare questi strumenti all'identificazione della fonte di contaminazione nelle acque sotterranee, presentando alti livelli di nitrati come esempio dell'applicabilità dei metodi sviluppati per rilevare la fonte di contaminazione nell'ambiente.
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Panoramica
Questo studio presenta un metodo economico per identificare le fonti di contaminazione fecale e urinaria nell'acqua. Utilizzando la PCR quantitativa, il metodo quantifica specifici virus del DNA umano, suino e bovino, inclusi adenovirosi e poliomavirosi, come strumenti per il monitoraggio delle fonti microbiche.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Monitoraggio delle fonti microbiche
- Microbiologia ambientale
- Valutazione della qualità dell'acqua
Sfondo
- La contaminazione microbica pone rischi significativi per la salute.
- Identificare le fonti di contaminazione è cruciale per la salute pubblica.
- I virus del DNA sono diffusi e possono servire come efficaci strumenti di monitoraggio.
- Adenovirosi e poliomavirosi sono selezionati per la loro rilevanza.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per monitorare la contaminazione fecale nell'acqua.
- Quantificare specifici virus del DNA da campioni d'acqua.
- Migliorare la comprensione delle fonti di contaminazione.
Metodi utilizzati
- Concentrazione di virus da campioni d'acqua da 10 litri.
- Flocculazione organica utilizzando latte scremato per l'estrazione dell'acido nucleico virale.
- Quantificazione di virus del DNA umano, suino e bovino tramite PCR quantitativa.
- Valutazione delle fonti di contaminazione attraverso indicatori virali selezionati.
Risultati principali
- Concentrazione e quantificazione riuscita dei virus target.
- Efficacia dimostrata del metodo per il monitoraggio delle fonti microbiche.
- Adenovirosi e poliomavirosi identificate come indicatori affidabili.
- Soluzione economica fornita per la valutazione della contaminazione dell'acqua.
Conclusioni
- Il metodo sviluppato è efficace per identificare le fonti di contaminazione.
- L'utilizzo di virus del DNA può migliorare gli sforzi di monitoraggio delle fonti microbiche.
- Questo approccio può migliorare significativamente il monitoraggio della qualità dell'acqua.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Identifying contamination sources in water is critical for public health risk assessment and environmental monitoring. This method provides a cost-effective, high-throughput approach to microbial source tracking using species-specific DNA viruses as reliable indicators. It supports predictive confidence in contamination source attribution and enables scalable screening across diverse water matrices.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of fecal contamination hypotheses through quantification of human adenoviruses, JC polyomaviruses, porcine adenoviruses, and bovine polyomaviruses as specific biomarkers.
- Operational Value: Provides a standardized, reproducible protocol for viral concentration from 10-liter water samples using skimmed milk flocculation and gravity sedimentation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative viral genome copy data via qPCR with TaqMan probes, enabling sensitive detection down to 1-10 genome copies per test tube for porcine and bovine markers.
- Operational Value: Facilitates high-throughput processing of multiple samples in parallel using 96-well plate formats and automated nucleic acid extraction platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by linking viral markers to contamination sources such as porcine slurries in groundwater, as demonstrated in nitrate-impacted samples.
- Operational Value: Ensures translational continuity from environmental sampling to molecular quantification, with nested PCR and sequencing used for virological data confirmation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into environmental microbiology workflows from sample concentration through nucleic acid extraction to quantitative viral measurement, enabling source attribution in water quality assessment pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding contamination origins by quantifying virus-specific biomarkers associated with human, porcine, or bovine fecal sources.
- Screening: Delivers assay readiness through a one-step concentration protocol that eliminates bottlenecks of traditional two-step methods, allowing simultaneous processing of large sample sets.
- Analytics: Provides quantitative outputs via qPCR standard curves and amplification plots, with acceptable slope values between -3.1 and -3.6 and correlation coefficients of 0.999 for porcine adenovirus quantification.
- Translational Research: Connects environmental detection to source identification through correlation of viral markers with known contamination sources, such as porcine slurry in high-nitrate groundwater.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, low-cost capability for viral concentration and quantification applicable to bathing waters, seawater, river water, and groundwater across diverse geographical areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in source tracking by using persistent, geographically widespread DNA viruses excreted in feces and/or urine.
- Operational Value: Delivers standardization and reproducibility through a one-step protocol involving acidification, skimmed milk flocculation, gravity sedimentation, and centrifugation at 8,000 × g for 30 minutes at 4°C.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in environmental monitoring by providing cost-effective, high-sensitivity detection of contamination sources without requiring expensive infrastructure.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of remediation efforts by distinguishing between human, porcine, and bovine contamination sources in water samples.
Implementation Considerations
- Requires expertise in environmental virology, nucleic acid extraction, and quantitative PCR assay design and execution.
- Needs access to centrifugation equipment capable of 8,000 × g, nucleic acid extraction kits (e.g., Key Amp Viral RNA Mini Kit), and qPCR systems with TaqMan probe compatibility.
- Demands standardization of pH adjustment to 3.5 using hydrochloric acid, skimmed milk flocculation (1% v/v), and gravity sedimentation timing (8–10 hours) across teams and sites.
- Involves adaptation considerations for varying water matrices, including pre-sedimentation for high-turbidity samples and conductivity adjustment with sea salts when below 1.5 mS/cm.
- Includes practical limitations such as the need for separate qPCR plates for porcine adenoviruses due to potential probe compatibility issues, even when using similar amplification cycles.
