Costo-efficace metodo per il rilevamento di origine microbica Utilizzando specifici virus umani e animali

Metodo economico per il reperimento della fonte microbica mediante l'uso di specifici virus umani e animali. Lo studio descrive un metodo economico per l'identificazione della fonte di contaminazione fecale, urinaria o da nitrati nelle acque, utilizzando la PCR quantitativa per la quantificazione specifica di virus del DNA di origine umana, suina, bovina, adenovirus e poliomavirus proposti come strumenti per il reperimento della fonte microbica. È stato sviluppato un protocollo per la concentrazione di virus da campioni d'acqua di 10 litri mediante flocculazione organica, l'estrazione degli acidi nucleici virali dal sedimento utilizzando latte scremato e la quantificazione di virus del DNA di origine umana, bovina o suina mediante PCR quantitativa.

È noto che la contaminazione microbica della vitamina rappresenta un rischio sanitario significativo e dobbiamo identificare le fonti di tale contaminazione. Abbiamo proposto l'utilizzo di virus a DNA altamente diffusi come strumenti per il tracciamento delle fonti microbiche. I virus selezionati sono gli adenovirus e i poliomavirus.

Questi virus vengono escreti in modo persistente durante tutto l'anno e in tutte le aree geografiche, come studiato in ricerche precedenti. Abbiamo sviluppato metodi di concentrazione robusti ed economici per i virus nell'acqua, e abbiamo lavorato allo sviluppo di saggi QPCR per la quantificazione degli adenovirus purinici e dei poliomavirus bovini.

Inoltre, utilizziamo adenovirus umani e poliomavirus NGC, testati mediante QPCR, anche come marcatori di contaminazione umana nell'acqua, raccolta dei campioni di acqua. In questo studio, vengono raccolte quattro repliche di 10 litri per ogni campione di acqua in contenitori di plastica con fondo piatto e un campione aggiuntivo come controllo del processo. Quest'ultimo campione verrà inoculato con una quantità nota di particelle virali utilizzate come controllo.

Un controllo negativo viene preparato in laboratorio utilizzando acqua di rubinetto in un contenitore di plastica aggiuntivo da 10 litri. Se il campione presenta una grande quantità di materiale in sospensione, sabbia e altri materiali, lasciarlo sedimentare per 15 minuti, quindi trasferire l'acqua in un contenitore nuovo. Concentrazione virale mediante flocculazione organica.

Il rilevamento di virus in campioni d'acqua poco o moderatamente inquinati richiede la concentrazione dei virus da almeno diversi litri di acqua a un volume molto più piccolo. La procedura di concentrazione comprende l'acidificazione di campioni d'acqua da 10 litri, la flocculazione utilizzando latte scremato, la sedimentazione per gravità dei fiocchi e la raccolta del precipitato in 10 millilitri di tampone fosfato per avviare il processo. Per preparare la soluzione di latte scremato in acqua marina artificiale, si sciolgono 10 grammi di latte in polvere scremato in un litro di acqua marina artificiale e si regola attentamente il pH a 3,5 con acido cloridrico; in queste condizioni, i fiocchi devono risultare visibili.

Preparare la soluzione poco prima dell'uso oppure conservarla a quattro gradi Celsius per 24 ore. I campioni d'acqua vengono mescolati e la conducibilità nei campioni viene misurata. Se è inferiore a 1,5 millisiemens, verranno aggiunti sali marini.

Regolare il pH del campione d'acqua a 3,5 aggiungendo acido cloridrico. Registrare il pH dei campioni prima e dopo il condizionamento, nonché il volume di acido cloridrico utilizzato. Anche la conducibilità deve essere registrata.

Dopo aver regolato il pH, aggiungiamo 100 millilitri di latte scremato pref floc, 1%, al campione d'acqua di 10 litri, e agitiamo i campioni per otto-dieci ore per consentire ai virus di assorbirsi sui fiocchi. Per il campione di aggiunta utilizzato come controllo di processo, aggiungere il volume standard del virus di controllo, ad esempio un millilitro, al campione. Arrestare l'agitazione e lasciare sedimentare i fiocchi per gravità per otto-dieci ore.

Dopo 16 ore, generalmente il giorno successivo, sarà possibile raccogliere i sedimenti. A tale scopo, rimuovere il soprannatante utilizzando una pompa peristaltica. Raccogliere il sedimento con i flocculi, per un volume di circa 500 millilitri, in un contenitore per centrifuga.

Bilanciare i beccucci aggiungendo latte scremato pref. pH 3,5, centrifugare i beccucci con una centrifuga ad alta velocità a 8.000 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Non appena la centrifuga si arresta, rimuovere con attenzione i beccucci dalla centrifuga. Versare con molta delicatezza e scartare il soprannatante.

Ri-sospendere il pellet in ciascun flacone da centrifuga fino a un volume finale di 10 millilitri di fosfato, estrazione degli acidi nucleici e quantificazione dei virus. Il concentrato virale viene utilizzato per l'estrazione degli acidi nucleici virali e gli adenovirus specifici e i poliomavirus di interesse saranno quantificati mediante A-Q-P-C-R. Eseguire un'estrazione degli acidi nucleici con il kit Key Amp Viral RNA Mini.

La lisi dei virus presenti in 140 µL di concentrati virali viene eseguita manualmente e gli acidi nucleici totali vengono estratti in un volume di 80 µL. Questo kit consente l'uso di una piattaforma automatizzata come Key cube.

Il passo successivo è la quantificazione del genoma virale. Copie nei campioni possono essere quantificate mediante PCR quantitativa con sonde TaqMan, in cui adenovirus umani, virus JC poliomavirus e virus poliomavirus bovini possono essere analizzati nella stessa piastra a 96 pozzetti. Poiché tutti utilizzano gli stessi cicli di amplificazione, gli adenovirus suini devono essere testati separatamente in una piastra indipendente per la quantificazione del virus bersaglio.

Preparare la miscela di PCR quantitativa in un'area separata e pulita. Una volta preparata la miscela, distribuire 15 microlitri in ciascun pozzetto, inclusi i controlli. Aggiungere le estrazioni di acido nucleico dei campioni (10 microlitri) in un'area separata, effettuando l'analisi diretta e una diluizione dieci volte in acqua purificata di ciascun campione in duplicato; il volume totale per una reazione dopo l'aggiunta del bersaglio sarà di 25 microlitri, 15 di miscela più 10 di campione o standard. Coprire i pozzetti contenenti i campioni con una parte di una pellicola adesiva.

Conservare l'altra parte del coperchio per il passaggio successivo. Diluizione AB delle sospensioni standard di DNA. 10 microlitri da 10 a zero a 10 a sei copie genomiche, microlitri fittizi in triplice replicazione e utilizzando un micro-pbit esclusivamente dedicato al coperchio di DNA standard.

I pozzetti contenenti gli standard con il coperchio adesivo precedentemente tagliato. Questa figura mostra la distribuzione dei campioni di sospensione standard e dei controlli. Nella piastra a 96 pozzetti.

Eseguire la QPCR in un sistema adeguato, selezionando i parametri appropriati dopo l'attivazione dell'amplificatore gold per 10 minuti. A 95 gradi Celsius, vengono effettuati 40 cicli di amplificazione una volta completate le reazioni. Conservare i dati e i risultati come descritto nel manuale utente dell'apparecchiatura utilizzata.

La quantità di DNA sarà definita come la mediana dei dati ottenuti dopo la correzione del fattore di diluizione, quando necessario. Il grafico di amplificazione e la curva standard ottenuti per la quantificazione degli adenovirus suini hanno mostrato un coefficiente di correlazione pari a 0,999. I valori di pendenza accettabili variano da -3,1 a -3,6 seguendo la procedura.

Sono stati testati virus umani e animali descritti in campioni di acqua sotterranea provenienti da un'area con elevati livelli di nitrati, al fine di definire le fonti di contaminazione. Le quattro repliche analizzate hanno mostrato risultati positivi per gli adenovirus suini, con un valore medio di 7,74 da 10 a due copie genomiche per litro, il che indicherebbe la presenza di letamici suini nell'area circostante il sito di campionamento e dimostrerebbe la contaminazione fecale suina nelle acque sotterranee. Nessun campione testato ha evidenziato contaminazione umana.

I dati virologici sono stati confermati mediante analisi di PCR nested e sequenziamento. Conclusione. In questo studio abbiamo presentato risultati provenienti dall'analisi di campioni di acqua sotterranea, che mostrano una contaminazione di origine suina in assenza di contaminazione umana o bovina. La procedura è stata inoltre applicata all'analisi di acque di balneazione, acqua di mare e acqua di fiume.

Presentiamo qui la procedura per l'applicazione di questi strumenti all'identificazione della fonte di contaminazione nelle acque sotterranee, utilizzando livelli elevati di nitrato come esempio dell'applicabilità dei metodi sviluppati per rilevare la fonte di contaminazione nell'ambiente.