Trascrittoma Profiling di In-Vivo Embrioni bovini pre-impianto prodotto con piattaforma microarray a due colori

L'obiettivo generale di questo video è quello di fornire una procedura tecnica ottimizzata utilizzando un array bovino personalizzato a due colori utilizzando una bassa quantità di RNA totale proveniente dagli embrioni bovini del settimo giorno. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave riguardanti la perdita embrionale nelle vacche da latte ad alta produzione e domande sulla qualità embrionale rispetto all'espressione genica nell'embrione in via di sviluppo prima dell'impianto. Il vantaggio di questa tecnica è che possiamo studiare l'espressione genica utilizzando il livello di picogramma dell'RNA totale estratto da singoli embrioni.

Questo metodo può fornire informazioni sul fattore che influenza la sopravvivenza degli embrioni bovini preimpianto prodotti in vivo. Questo può anche aiutare a migliorare le tecnologie riproduttive come la produzione di embrioni in vitro. Per iniziare la procedura, preparare gli embrioni bovini congelati in una provetta da microcentrifuga da un kit di estrazione dell'RNA su scala pico a colonna.

Aggiungere 10 microlitri di tampone di lisi alla provetta e incubare gli embrioni a 42 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi, centrifugare la provetta per due minuti a 800 volte G.Pipette 250 microlitri di tampone di condizionamento nella membrana del filtro della colonna di purificazione e incubare la colonna per cinque minuti a temperatura ambiente. Centrifugare la provetta di raccolta a 16.000 volte G per un minuto per terminare il precondizionamento della colonna.

Aggiungere 10 microlitri di etanolo al 70% alla miscela di tampone di lisi ed embrioni e mescolare bene. Quindi, caricare la miscela sulla colonna di purificazione. Centrifugare la colonna per due minuti a 100 volte G, quindi a 16.000 volte G per 30 secondi.

Aggiungere 100 microlitri del primo tampone di lavaggio alla colonna e centrifugare a 8.000 volte G per un minuto. Utilizzando un kit DNase, mescolare cinque microlitri di soluzione madre con 35 microlitri di tampone e mescolare capovolgendo delicatamente il tubo chiuso. Quindi, caricare la miscela di DNasi sulla membrana della colonna di purificazione e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.

Aggiungere 40 microlitri del primo tampone di lavaggio alla colonna e centrifugare a 8.000 volte G per 15 secondi. Quindi, aggiungere 100 microlitri del secondo tampone di lavaggio e centrifugare per un minuto. Aggiungere un'altra porzione del secondo tampone di lavaggio alla colonna e centrifugare per due minuti a 16.000 volte G.Trasferire la colonna di purificazione in un'altra provetta da microcentrifuga e caricare 11 microlitri di tampone di eluizione sulla membrana della colonna.

Incubare la colonna per un minuto a temperatura ambiente. Centrifugare la colonna per un minuto a 1.000 volte G, e poi per un altro minuto a 16.000 volte G.Controllare la qualità e la quantità dell'RNA eluito, quindi conservare il campione a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Utilizzando un kit di amplificazione, amplificare 100 picogrammi di RNA di alta qualità.

Valutare l'intervallo di dimensioni dell'aRNA amplificato con quantificazione basata sulla fluorescenza. Quindi, determinare la concentrazione di aRNA mediante spettrofotometria. Preparare due microgrammi di aRNA amplificato per la marcatura fluorescente con un kit standard.

Installa una scatola di ozono in una camera oscura e attendi che il livello di ozono scenda a 0,001 parti per milione. Posiziona un filtro per camera oscura sulla luce. Quindi, portare il campione nella scatola dell'ozono e aggiungere due microlitri ciascuno di cianonina cinque colorante e tampone di etichettatura.

Con il campione sotto una luce sicura, aggiungere acqua priva di RNasi per ottenere un volume totale di 20 microlitri. Mescolare delicatamente il campione, quindi incubare la provetta in un termociclatore a 85 gradi Celsius per 15 minuti. Raffreddare il campione con ghiaccio per un minuto, quindi centrifugare il campione.

Pulisci l'aRNA marcato e amplificato con un kit di estrazione dell'RNA. Utilizzando il tipo appropriato di spettrometro, determinare la concentrazione di aRNA marcato e amplificato. Preparare un secondo campione di aRNA amplificato marcato con il colorante cianina tre.

Conservare i campioni di aRNA a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per un massimo di tre giorni. Combina 825 nanogrammi ciascuno di Cy3 e aRNA marcato con 5. A questo si aggiungono il buffer di blocco e il buffer di frammentazione.

Incubare la miscela a 60 gradi Celsius per 15 minuti, quindi raffreddare con ghiaccio per un minuto. Aggiungere 55 microlitri di tampone di ibridazione e mescolare bene senza introdurre bolle d'aria. Centrifugare la miscela a 11, 300 volte G per un minuto.

Caricare 100 microlitri di campione sul vetrino dell'array e sigillare il vetrino nella camera di ibridazione. Ibridare il campione per 17 ore a 65 gradi Celsius ruotando a 10 rotazioni al minuto. Preparare una soluzione stabilizzante ed essiccante per l'ozono.

Lavare gli array, prendendo precauzioni per ridurre al minimo l'esposizione all'ozono, quindi immergerli nella soluzione stabilizzante e asciugante per 30 secondi. Assicurarsi che la superficie dell'array sia asciutta e priva di polvere. Conservare gli array in una posizione buia.

Accendere lo scanner di microarray e attendere che sia pronto per la scansione. Quindi, carica l'array con il codice a barre a sinistra. Eseguire un'analisi spot e salvare i dati come file GPR.

Nel software di analisi statistica, normalizzare e analizzare i dati. Calcola la soglia di selezione del punto positivo e visualizza il grafico dei segnali ibridati e di fondo. Eseguire una normalizzazione Loess all'interno dell'array e quindi una normalizzazione del quantile tra gli array.

Esporta i dati normalizzati in un file di foglio di calcolo. Utilizza tutti i segnali positivi in un repository di dati di microarray per creare un elenco ID di geni unici selezionati. Carica l'elenco ID in un database di classificazione e analisi delle proteine, scegliendo bos taurus come organismo, ed esegui un test di sovrarappresentazione statistica predefinito.

Dopo l'amplificazione a due giri, i frammenti sono di dimensioni molto simili e di buona qualità. Il successo dell'amplificazione con questo metodo dovrebbe produrre un aumento di almeno mille volte dell'aRNA. Un'immagine microarray di alta qualità ha un'elevata intensità spot e una bassa intensità di sfondo su entrambi i canali.

Se l'intensità dello sfondo è troppo alta, la risoluzione del segnale sarà scarsa. Circa il 46% delle macchie si trovava al di sopra del fondo, da cui sono stati isolati 6.765 trascritti unici di RNA espressi nella blastocisti. Un test di sovrarappresentazione statistica ha indicato che i primi 10 termini di ontologia genica rappresentavano processi di divisione cellulare attivi.

Lo sviluppo di questa tecnica ha permesso ai ricercatori nel campo della riproduzione animale di esplorare l'espressione genica embrionale e di valutare come vari fattori influenzano l'embrione in via di sviluppo. Questa tecnica è stata sviluppata anche in altre specie importanti, come il maiale. Seguendo questa procedura, è possibile utilizzare altri metodi come la PCR quantitativa per convalidare i risultati dei microarray.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come estrarre l'RNA dagli embrioni e di come amplificare ed etichettare l'RNA per eseguire l'analisi dei microarray a due colori.