Trascrittoma Profiling di In-Vivo Embrioni bovini pre-impianto prodotto con piattaforma microarray a due colori
30 gennaio 2017
La tecnologia Microarray consente la misurazione quantitativa e la profilazione dell'espressione genica dei trascritti su base genomica. Pertanto, questo protocollo fornisce una procedura tecnica ottimizzata in un array bovino a due colori su misura utilizzando embrioni bovini del giorno 7 per dimostrare la fattibilità dell'utilizzo di una bassa quantità di RNA totale.
L'obiettivo generale di questo video è quello di fornire una procedura tecnica ottimizzata utilizzando un array bovino personalizzato a due colori utilizzando una bassa quantità di RNA totale proveniente dagli embrioni bovini del settimo giorno. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave riguardanti la perdita embrionale nelle vacche da latte ad alta produzione e domande sulla qualità embrionale rispetto all'espressione genica nell'embrione in via di sviluppo prima dell'impianto. Il vantaggio di questa tecnica è che possiamo studiare l'espressione genica utilizzando il livello di picogramma dell'RNA totale estratto da singoli embrioni.
Questo metodo può fornire informazioni sul fattore che influenza la sopravvivenza degli embrioni bovini preimpianto prodotti in vivo. Questo può anche aiutare a migliorare le tecnologie riproduttive come la produzione di embrioni in vitro. Per iniziare la procedura, preparare gli embrioni bovini congelati in una provetta da microcentrifuga da un kit di estrazione dell'RNA su scala pico a colonna.
Aggiungere 10 microlitri di tampone di lisi alla provetta e incubare gli embrioni a 42 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi, centrifugare la provetta per due minuti a 800 volte G.Pipette 250 microlitri di tampone di condizionamento nella membrana del filtro della colonna di purificazione e incubare la colonna per cinque minuti a temperatura ambiente. Centrifugare la provetta di raccolta a 16.000 volte G per un minuto per terminare il precondizionamento della colonna.
Aggiungere 10 microlitri di etanolo al 70% alla miscela di tampone di lisi ed embrioni e mescolare bene. Quindi, caricare la miscela sulla colonna di purificazione. Centrifugare la colonna per due minuti a 100 volte G, quindi a 16.000 volte G per 30 secondi.
Aggiungere 100 microlitri del primo tampone di lavaggio alla colonna e centrifugare a 8.000 volte G per un minuto. Utilizzando un kit DNase, mescolare cinque microlitri di soluzione madre con 35 microlitri di tampone e mescolare capovolgendo delicatamente il tubo chiuso. Quindi, caricare la miscela di DNasi sulla membrana della colonna di purificazione e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
Aggiungere 40 microlitri del primo tampone di lavaggio alla colonna e centrifugare a 8.000 volte G per 15 secondi. Quindi, aggiungere 100 microlitri del secondo tampone di lavaggio e centrifugare per un minuto. Aggiungere un'altra porzione del secondo tampone di lavaggio alla colonna e centrifugare per due minuti a 16.000 volte G.Trasferire la colonna di purificazione in un'altra provetta da microcentrifuga e caricare 11 microlitri di tampone di eluizione sulla membrana della colonna.
Incubare la colonna per un minuto a temperatura ambiente. Centrifugare la colonna per un minuto a 1.000 volte G, e poi per un altro minuto a 16.000 volte G.Controllare la qualità e la quantità dell'RNA eluito, quindi conservare il campione a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Utilizzando un kit di amplificazione, amplificare 100 picogrammi di RNA di alta qualità.
Valutare l'intervallo di dimensioni dell'aRNA amplificato con quantificazione basata sulla fluorescenza. Quindi, determinare la concentrazione di aRNA mediante spettrofotometria. Preparare due microgrammi di aRNA amplificato per la marcatura fluorescente con un kit standard.
Installa una scatola di ozono in una camera oscura e attendi che il livello di ozono scenda a 0,001 parti per milione. Posiziona un filtro per camera oscura sulla luce. Quindi, portare il campione nella scatola dell'ozono e aggiungere due microlitri ciascuno di cianonina cinque colorante e tampone di etichettatura.
Con il campione sotto una luce sicura, aggiungere acqua priva di RNasi per ottenere un volume totale di 20 microlitri. Mescolare delicatamente il campione, quindi incubare la provetta in un termociclatore a 85 gradi Celsius per 15 minuti. Raffreddare il campione con ghiaccio per un minuto, quindi centrifugare il campione.
Pulisci l'aRNA marcato e amplificato con un kit di estrazione dell'RNA. Utilizzando il tipo appropriato di spettrometro, determinare la concentrazione di aRNA marcato e amplificato. Preparare un secondo campione di aRNA amplificato marcato con il colorante cianina tre.
Conservare i campioni di aRNA a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per un massimo di tre giorni. Combina 825 nanogrammi ciascuno di Cy3 e aRNA marcato con 5. A questo si aggiungono il buffer di blocco e il buffer di frammentazione.
Incubare la miscela a 60 gradi Celsius per 15 minuti, quindi raffreddare con ghiaccio per un minuto. Aggiungere 55 microlitri di tampone di ibridazione e mescolare bene senza introdurre bolle d'aria. Centrifugare la miscela a 11, 300 volte G per un minuto.
Caricare 100 microlitri di campione sul vetrino dell'array e sigillare il vetrino nella camera di ibridazione. Ibridare il campione per 17 ore a 65 gradi Celsius ruotando a 10 rotazioni al minuto. Preparare una soluzione stabilizzante ed essiccante per l'ozono.
Lavare gli array, prendendo precauzioni per ridurre al minimo l'esposizione all'ozono, quindi immergerli nella soluzione stabilizzante e asciugante per 30 secondi. Assicurarsi che la superficie dell'array sia asciutta e priva di polvere. Conservare gli array in una posizione buia.
Accendere lo scanner di microarray e attendere che sia pronto per la scansione. Quindi, carica l'array con il codice a barre a sinistra. Eseguire un'analisi spot e salvare i dati come file GPR.
Nel software di analisi statistica, normalizzare e analizzare i dati. Calcola la soglia di selezione del punto positivo e visualizza il grafico dei segnali ibridati e di fondo. Eseguire una normalizzazione Loess all'interno dell'array e quindi una normalizzazione del quantile tra gli array.
Esporta i dati normalizzati in un file di foglio di calcolo. Utilizza tutti i segnali positivi in un repository di dati di microarray per creare un elenco ID di geni unici selezionati. Carica l'elenco ID in un database di classificazione e analisi delle proteine, scegliendo bos taurus come organismo, ed esegui un test di sovrarappresentazione statistica predefinito.
Dopo l'amplificazione a due giri, i frammenti sono di dimensioni molto simili e di buona qualità. Il successo dell'amplificazione con questo metodo dovrebbe produrre un aumento di almeno mille volte dell'aRNA. Un'immagine microarray di alta qualità ha un'elevata intensità spot e una bassa intensità di sfondo su entrambi i canali.
Se l'intensità dello sfondo è troppo alta, la risoluzione del segnale sarà scarsa. Circa il 46% delle macchie si trovava al di sopra del fondo, da cui sono stati isolati 6.765 trascritti unici di RNA espressi nella blastocisti. Un test di sovrarappresentazione statistica ha indicato che i primi 10 termini di ontologia genica rappresentavano processi di divisione cellulare attivi.
Lo sviluppo di questa tecnica ha permesso ai ricercatori nel campo della riproduzione animale di esplorare l'espressione genica embrionale e di valutare come vari fattori influenzano l'embrione in via di sviluppo. Questa tecnica è stata sviluppata anche in altre specie importanti, come il maiale. Seguendo questa procedura, è possibile utilizzare altri metodi come la PCR quantitativa per convalidare i risultati dei microarray.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come estrarre l'RNA dagli embrioni e di come amplificare ed etichettare l'RNA per eseguire l'analisi dei microarray a due colori.
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Panoramica
Questo protocollo descrive una procedura tecnica ottimizzata che utilizza un array bovino personalizzato a due colori per analizzare l'espressione genica negli embrioni bovini al settimo giorno. Il metodo consente l'uso di piccole quantità di RNA totale, fornendo informazioni sulla qualità embrionale e sui fattori che influenzano la sopravvivenza dell'embrione.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Embriologia
- Espressione genica
Sfondo
- La tecnologia dei microarray consente il profilo dell'espressione genica a livello del genoma.
- Comprendere la perdita embrionale nelle bovine da latte è fondamentale per migliorare le tecnologie riproduttive.
- Metodi con basso quantitativo di RNA in ingresso possono potenziare gli studi su singoli embrioni.
- L'analisi dell'espressione genica può guidare le pratiche nella produzione in vitro di embrioni.
Scopo dello studio
- Dimostrare la fattibilità dell'uso di basse quantità di RNA totale da embrioni bovini.
- Indagare l'espressione genica associata alla qualità embrionale prima dell'impianto.
- Fornire informazioni sui fattori che influenzano la sopravvivenza degli embrioni bovini pre-impianto.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di embrioni bovini congelati rapidamente.
- Utilizzo di un kit per l'estrazione di RNA su colonna su scala pico.
- Impiego di un array bovino personalizzato a due colori.
- Misurazione quantitativa dell'espressione genica a livelli di RNA in picogrammi.
Risultati principali
- Profilazione riuscita dell'espressione genica utilizzando quantità minime di RNA.
- Informazioni sulla qualità embrionale e sui fattori che influenzano la sopravvivenza.
- Potenziali miglioramenti nelle tecnologie riproduttive.
- Dimostrazione della fattibilità del metodo per studi futuri.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce uno strumento prezioso per lo studio dell'espressione genica nell'embrione bovino.
- Metodi con basso input di RNA possono facilitare la ricerca sullo sviluppo embrionale.
- Questo approccio potrebbe portare a progressi nelle pratiche riproduttive nell'allevamento bovino da latte.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente il profilo dell'espressione genica su scala genomica a partire da RNA di livello picogrammo estratto da singoli embrioni bovini, affrontando un collo di bottiglia critico nella ricerca in biologia della riproduzione. Fornendo dati trascrittomici quantitativi da embrioni pre-impianto prodotti in vivo, il metodo supporta l'identificazione meccanicistica dei fattori di perdita embrionale nei bovini da latte ad alta produzione. L'approccio offre un valore traslazionale per la validazione di bersagli in terapie riproduttive e una maggiore affidabilità predittiva nei protocolli di valutazione della qualità degli embrioni.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi delle reti trascrizionali che regolano la sopravvivenza e la qualità dell'embrione prima dell'impianto.
- Valore operativo: Facilita la validazione funzionale delle target collegando i profili di espressione genica agli esiti fenotipici nello sviluppo embrionale.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio identificando firme molecolari associate a embrioni vitali rispetto a quelli non vitali.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prontezza del saggio: Genera profili trascrittomici standardizzati e riproducibili, adatti alla scoperta di biomarcatori e alla standardizzazione dei saggi.
- Scalabilità: La progettazione di microarray a due colori aumenta la replicazione tecnica e riduce al minimo la variabilità, consentendo confronti robusti tra campioni.
- Utilità della piattaforma: Crea una base riutilizzabile per la validazione successiva mediante qPCR o screening funzionale di geni candidati.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Fornisce un sistema modello bovino con parallelismi nello sviluppo con l'embriogenesi umana pre-impianto per studi meccanicistici.
- Continuità traslazionale: Collega i risultati sulla espressione genica della fase di scoperta alla valutazione preclinica dei fattori che influenzano la sopravvivenza dell'embrione.
- Progressione aggiustata per il rischio: Permette decisioni basate sui dati riguardo interventi di tecnologie riproduttive in base ai profili di espressione di vie di sviluppo chiave.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso iniziale della scoperta, sostenendo l'identificazione di bersagli guidata da ipotesi e la validazione meccanicistica prima di passare a saggi funzionali o studi di validazione in vivo.
- Biologia della Scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi biologici e la riduzione del rischio biologico isolando trascritti espressi in modo differenziale associati alla qualità e alla sopravvivenza dell'embrione.
- Screening: Fornisce output quantitativi ed espressioni normalizzate che permettono confronti affidabili degli effetti di condizioni genetiche o ambientali sullo sviluppo embrionale.
- Analisi: Utilizza la normalizzazione Loess e quantile con test statistici di sovra-rappresentazione per ricavare informazioni utili di ontologia genica dai dati di microarray.
- Ricerca Translazionale: Si allinea agli sforzi di scoperta di biomarcatori identificando processi conservati, come la divisione cellulare attiva, come termini funzionali principali negli embrioni allo stadio di blastocisti.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro standardizzato da RNA-a-dati applicabile tra specie zootecniche e adattabile ad altri modelli di embrioni mammiferi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nella perdita embrionale fornendo dati sull'espressione a scala genomica provenienti da stadi di sviluppo clinicamente rilevanti.
- Valore operativo: Consente un rilevamento ad alta sensibilità a partire da quantità minime di RNA, standardizzando procedure con basso input per campioni biologici preziosi o limitati.
- Valore strategico: Migliora la decisione di proseguire o interrompere lo sviluppo delle tecnologie riproduttive collegando i profili molecolari agli esiti di vitalità embrionale.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio di bersagli o interventi, in base all'arricchimento di reti geniche funzionalmente coerenti.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione dell'RNA, nell'amplificazione enzimatica e nelle tecniche di marcatura fluorescente per prevenire il degrado del campione.
- Dipende dall'accesso a scanner per microarray, camere di ibridazione e ambienti controllati per l'ozono per mantenere l'integrità del segnale.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le metriche di qualità dell'RNA, l'efficienza di marcatura e le condizioni di ibridazione, al fine di ottenere risultati riproducibili.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si trasferisce il protocollo a stadi embrionali diversi, a specie diverse o a tipi di campione con resa di RNA variabile.
- I limiti pratici includono la necessità di un input di RNA amplificato e il potenziale bias introdotto durante i passaggi di amplificazione a due cicli.
