Imaging live simultaneo di più embrioni di insetti nei microscopi a fluorescenza a fogli di luce a camera campione

I microscopi a florescenza a foglio luminoso basati su camera di campionamento sono progettati per un contenuto elevato piuttosto che per un'elevata produttività. I saggi di imaging dal vivo devono quindi essere eseguiti in sequenza e quindi meno influenzati dalla varianza ambientale. Il nostro supporto per ragnatela consente l'impilamento e l'imaging simultaneo di più embrioni, eliminando la varianza ambientale e aumentando la produttività.

Il montaggio degli embrioni nel supporto della ragnatela richiede una certa finezza. Un video esplicativo è l'ideale per illustrare la sequenza dei numerosi brevi gesti di condotta. Per la calibrazione della camera del campione basata su un microscopio a fluorescenza a foglio luminoso.

Innanzitutto, riliquefare un'aliquota di agarosio in un miscelatore a blocchi secco a 80 gradi Celsius. Lasciare raffreddare l'agarosio fuso a 35 gradi Celsius e trasferire 50 microlitri di agarosio in una provetta di reazione da 1,5 millilitri. Mescolare 0,5 microlitri di soluzione di microsfere fluorescenti con l'agarosio a 1.400 giri al minuto per un minuto e riempire il foro fessurato del supporto della ragnatela con 10 microlitri della miscela di soluzioni di microsfere fluorescenti di agarosio.

Aspirare quanto più agarosio possibile fino a quando non rimane solo un sottile film di agarosio e lasciare che l'agarosio si solidifichi per 30-60 secondi. Riempire la camera del campione con acqua di rubinetto autoclavata e inserire lentamente il supporto della ragnatela nella camera del campione. Spostare il foro asolato davanti alla lente di rilevamento e ruotare il supporto in una posizione di 45 gradi rispetto agli assi di illuminazione e di rilevamento.

Il supporto della ragnatela non deve essere visibile nel canale di trasmissione della luce. Passa al canale di fluorescenza appropriato e regola la potenza del laser e il tempo di esposizione, in modo che le microsfere fluorescenti forniscano un segnale adeguato. Specificare un volume visivo che copra completamente la pellicola di agarosio ora orientata trasversalmente e calcolare la risoluzione assiale massima possibile per la rispettiva combinazione di lenti di illuminazione e rilevamento per definire la spaziatura Z.

Quindi, registrare una pila Z di prova tridimensionale delle microsfere fluorescenti e confrontare le proiezioni massime X, Y e Z con il grafico di calibrazione. Se le microsfere appaiono sfocate, sfocate e/o distorte. Regolare le posizioni delle lenti di illuminazione e/o di rilevamento.

Per la decorionazione dell'embrione, aggiungere otto millilitri di acqua di rubinetto autoclavata nei pozzetti A1, A2, A3 e B3 di una piastra a sei pozzetti per linea. Quindi, aggiungere sette millilitri di acqua di rubinetto autoclavata e un millilitro di soluzione di ipoclorito di sodio nei pozzetti B1 e B2. Posizionare la prima piastra sotto uno stereomicroscopio e inserire il primo embrione contenente il colino cellulare nel pozzetto A1.

Lavare gli embrioni con una leggera agitazione per 30-60 secondi, prima di spostare il colino sul pozzetto B1. Agitare energicamente la piastra per 30 secondi, prima di trasferire il colino nella fontana A2. Lavare gli embrioni per un minuto con una leggera agitazione e spostare il colino nel pozzetto B2 per agitare vigorosamente fino a quando la maggior parte degli embrioni non è completamente decorionazione.

Quindi, trasferire il colino nel pozzetto A3 per un minuto di lavaggio delicato, prima di conservare il colino degli embrioni dechorionati nel pozzetto B3 fino a quando gli embrioni di altre linee non sono stati trattati come dimostrato. Per montare gli embrioni sul supporto della ragnatela, riliquefare un'altra aliquota di agarosio come dimostrato. Quando l'agarosio si è raffreddato, posizionare il supporto della ragnatela sotto lo stereomicroscopio e aggiungere 10 microlitri di agarosio sul foro fessurato.

Utilizzare la punta della pipetta per stendere l'agarosio sul foro fessurato, prima di aspirare quanto più agarosio possibile fino a quando non rimane solo un sottile film di agarosio. Quando l'agarosio si è solidificato, utilizzare un pennello per raccogliere e trasferire con cura gli embrioni sulla pellicola di agarosio. Disponili lungo l'asse lungo del foro asolato con i loro assi antero-posteriori allineati con l'asse lungo del foro asolato.

Per stabilizzare gli embrioni, pipettare con cura uno o due microlitri di agarosio nello spazio tra gli embrioni e il film di agarosio. Quando l'agarosio si è solidificato, inserire lentamente il supporto della ragnatela con gli embrioni montati nella camera del campione riempita con il buffer dell'immagine. Per visualizzare gli embrioni, verificare che il supporto della ragnatela si trovi in una posizione di 45 gradi rispetto agli assi di illuminazione e rilevamento e nel canale della luce di trasmissione, spostare l'embrione al centro del campo visivo.

Il supporto della ragnatela non deve essere visibile. Quindi, sposta l'embrione con lo stadio di micro traslazione in Z fino a quando il piano medio dell'embrione si sovrappone al piano focale e il contorno appare nitido. Senza passare al canale di fluorescenza, spostare l'embrione di 250 micron in entrambe le direzioni per specificare il volume di visione.

Se è necessario eseguire l'imaging in più direzioni, ruotare l'embrione in modo appropriato, metterlo a fuoco e specificare il volume di visuale appena dimostrato. Quindi, ripeti questa procedura per tutti gli altri embrioni montati. Quando il volume di visione è stato specificato per tutti gli embrioni, definire il canale di fluorescenza e i parametri time-lapse e avviare il processo di imaging.

Per i saggi che durano diversi giorni, considerare la possibilità di coprire l'apertura della camera del campione almeno parzialmente per ridurre l'evaporazione. Al termine del test di imaging, rimuovere con cautela il supporto della ragnatela dalla camera del campione e utilizzare un piccolo pennello per staccare gli embrioni dalla pellicola di agarosio e posizionare gli embrioni su un vetrino da microscopio adeguatamente etichettato. Collocare il vetrino in una capsula di recupero per l'incubazione nelle condizioni standard di allevamento appropriate.

Con l'avvicinarsi del momento della schiusa, controllare frequentemente le piastre di recupero e trasferire le larve schiuse nei singoli pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. Riempire i pozzetti a metà con il terreno di coltura appropriato, quindi incubare le larve nelle condizioni di allevamento standard appropriate. Quando gli individui osservati raggiungono l'età adulta, fornire partner di accoppiamento adatti e verificare la progenie dopo diversi giorni.

In questo video, si può osservare la dinamica del segnale fluorescente di tre embrioni derivati da diverse linee transgeniche di Drosophila per un periodo di circa un giorno. Ci si aspettava un pattern di fluorescenza simile, poiché tutte le linee esprimevano EGFP localizzato nucleare sotto il controllo di promotori presumibilmente ubiquitari e costituentemente attivi. I risultati comparativi dell'imaging dal vivo, tuttavia, hanno rivelato forti differenze spazio-temporali nei modelli di espressione che non erano effetti secondari dovuti alla varianza ambientale.

In questa analisi di tre embrioni di Tribolium portatori dello stesso transgene basato su piggyback. I risultati comparativi dell'imaging dal vivo del processo di chiusura della finestra sierosa durante la gastrulazione suggeriscono che la seconda sottolinea fornisce un segnale complessivo notevolmente più forte rispetto alle altre due sottolinee. Come indicano questi dati, il contesto genomico può anche avere una forte influenza sul livello di espressione dei transgeni in Tribolium.

Il nostro approccio è adatto per l'analisi dei fenotipi knockdown e knockout, in quanto consente di visualizzare simultaneamente embrioni di controllo wild type. Il nostro protocollo può essere utilizzato anche per confrontare la morfogenesi di due o più specie di insetti. E quindi, ottenere una visione più approfondita dell'evoluzione dello sviluppo.