Integrazione di Wet and Dry processi banco Ottimizza Targeted sequenziamento di prossima generazione di bassa qualità e di biopsie di tumori a bassa quantità

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di descrivere un sistema completo per il sequenziamento di campioni di cancro impegnativi che combina reagenti di laboratorio umidi, controlli standardizzati e una suite di bioinformatica stand-long. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del cancro, come ad esempio come sequenziare biopsie tumorali di bassa quantità e bassa qualità per ottenere analisi e interpretazioni accurate delle varianti del DNA. Il vantaggio principale di questo metodo è che i campioni difficili da sequenziare sono quelli che hanno semplicemente a disposizione quantità limitate di DNA e possono essere analizzati in modo rapido e affidabile utilizzando reagenti e controlli da un'unica fonte e un software bioinformatico completamente integrato.

Generalmente gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa della complessità dell'NGS mirato, che questo metodo semplifica. Tuttavia, le procedure per la quantificazione delle librerie e il pooling dei campioni richiedono un'attenzione particolare per ottenere una copertura uniforme in tutte le librerie di campioni. Questo protocollo integra processi di banco a umido e a secco per il sequenziamento di campioni tumorali impegnativi.

Il primo passo è la quantificazione e la qualificazione del DNA per determinare il numero di copie del modello di DNA che possono essere amplificate mediante PCR in tempo reale. Iniziare la procedura per la quantificazione del campione e il controllo di qualità preparando una quantità sufficiente di una miscela master in una provetta da microcentrifuga. Utilizzare i seguenti volumi per campione, 5 microlitri di 2x master mix, 0,5 microlitri di miscela di sonde primer, 0,5 microlitri di miscela di sonde primer di inibizione, 0,05 microlitri di ROX e 2,95 microlitri di diluente.

Aggiungere nove microlitri della miscela master in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere un microlitro degli standard del DNA in duplicato e mescolare pipettando su e giù cinque volte. Dopo essersi assicurati che il campione di acido nucleico sia ben miscelato, aggiungere un microlitro di campione alla miscela master e miscelare pipettando su e giù cinque volte.

Posizionare la piastra sigillata nel sistema PCR. Eseguire cicli di PCR di 10 minuti a 95 gradi Celsius, seguiti da 40 cicli di 15 secondi a 95 gradi Celsius e un minuto a 60 gradi Celsius. Analizza i dati qPCR generando un grafico di regressione lineare per ciascuno degli standard di DNA duplicati.

La concentrazione del DNA sconosciuto nel numero di copie funzionali o amplificabili per microlitro viene quindi calcolata come descritto nel testo del protocollo. Il passo successivo, dopo la quantificazione del campione e il controllo di qualità, è l'arricchimento delle sequenze hot spot del cancro mediante PCR multiplex in provetta singola. Gene specifico o gsPCR, sarà eseguito per arricchire per 46 loci in 21 geni tumorali.

Preparare una quantità sufficiente di master mix gsPCR in una provetta da microcentrifuga utilizzando i seguenti volumi per campione, cinque microlitri di master mix di amplificazione 2x e un microlitro di pannello di primer pan-cancer. Aliquotare sei microlitri della miscela master gsPCR in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere quattro microlitri di ciascun campione di acido nucleico nei singoli pozzetti.

Miscelare pipettando su e giù cinque volte. Includi i controlli appropriati. Posizionare la piastra sigillata nel termociclatore per i successivi cicli di PCR.

Cinque minuti a 95 gradi Celsius, 15 secondi a 95 gradi Celsius seguiti da quattro minuti a 60 gradi Celsius per due cicli, 15 secondi a 95 gradi Celsius seguiti da quattro minuti a 72 gradi Celsius per 23 cicli.

Un'estensione finale di 10 minuti a 72 gradi Celsius, seguita da un mantenimento a quattro gradi Celsius. Dopo la PCR gene specifica, eseguire 10 cicli di tag-PCR per incorporare adattatori specifici per piattaforma per la compatibilità con il sequenziamento di nuova generazione. Aggiungere 7,5 microlitri della miscela master indice 2x e 5,5 microlitri di un codice indice a un pozzetto specificato in una piastra da 96 pozzetti e miscelare pipettando su e giù cinque volte.

Aprire con cautela la piastra gsPCR e aggiungere due microlitri di prodotto gsPCR alla nuova piastra con la miscela master. Posizionare la piastra sigillata nel termociclatore per i successivi cicli di PCR, cinque minuti a 95 gradi Celsius, 30 secondi a 95 gradi Celsius, 30 secondi a 55 gradi Celsius e un minuto a 72 gradi Celsius per 10 cicli e un'estensione finale di 10 minuti a 72 gradi Celsius. Seguito dal mantenimento a quattro gradi Celsius.

Dopo la tag-PCR, la purificazione della libreria e la selezione delle dimensioni vengono eseguite utilizzando la chimica delle microsfere magnetiche. Iniziare questa procedura aggiungendo 11 microlitri di biglie magnetiche di preparazione pura della libreria in pozzetti separati di una piastra a 96 pozzetti. Aprire la piastra tag-PCR e aggiungere 10 microlitri di prodotto tag-PCR alle perle e mescolare pipettando su e giù cinque volte.

Incubare la miscela per quattro minuti a temperatura ambiente. Posizionare la piastra a 96 pozzetti su un supporto magnetico per quattro minuti. Con la piastra a 96 pozzetti ancora sul supporto, rimuovere ed eliminare il surnatante con una pipetta.

Dopo aver lavato le perle due volte con un tampone di lavaggio contenente etanolo come descritto nel testo del protocollo, asciugare le perle per due minuti a temperatura ambiente e quindi rimuovere la piastra dal supporto. Risospendere le microsfere aggiungendo 20 microlitri di tampone di eluizione a ciascun pozzetto e pipettando su e giù cinque volte. Incubare per due minuti a temperatura ambiente.

Riposizionare la piastra da 96 pozzetti sul supporto magnetico per quattro minuti, quindi rimuovere con cautela e trasferire 18 microlitri di surnatante trasparente in un pozzetto in una nuova piastra da 96 pozzetti. Il passo successivo di questo protocollo è la quantificazione di ciascuna libreria di campioni purificati mediante PCR in tempo reale relativamente competitiva. Per iniziare questa procedura, preparare una quantità sufficiente di miscela master LQ in una provetta da microcentrifuga utilizzando i seguenti volumi per campione, cinque microlitri di 2x LQ master mix, due microlitri di LQ primer probe mix, 0,5 microlitri di LQ standard e 0,5 microlitri di LQ ROX.

Aggiungere 8 microlitri della master mix LQ a un pozzetto di una piastra ottica a 96 pozzetti. In pozzetti separati, aggiungere due microlitri di una diluizione seriale della libreria, due microlitri di controllo positivo LQ e due microlitri di diluente LQ e mescolare pipettando su e giù cinque volte. Posizionare la piastra sigillata nel sistema PCR e assegnare i rivelatori FAM e VIC per ciascun campione.

Eseguire l'amplificazione PCR utilizzando le seguenti condizioni di ciclo, cinque minuti a 95 gradi Celsius e 15 secondi a 95 Celsius, seguiti da un minuto a 60 gradi Celsius per 40 cicli. La concentrazione di ciascun campione viene quindi calcolata come descritto nel testo del protocollo. Dopo la quantificazione della libreria, ogni libreria di campioni viene normalizzata in base alla concentrazione misurata e raggruppata in un'unica provetta per il sequenziamento.

Un modulo di analisi semplificato viene utilizzato per facilitare i calcoli per la normalizzazione delle librerie e il pooling dei campioni. Per normalizzare la libreria, determinare innanzitutto la concentrazione mediana in nanomolari in tutti i campioni, ciascuno contenente un indice unico a coppie da raggruppare. Successivamente, determinare il volume del singolo campione in microlitri da raggruppare moltiplicando la concentrazione mediana di tutti i campioni per cinque, quindi dividendo per la sua concentrazione individuale.

Aggiungere il volume normalizzato per ciascun campione a una singola provetta da microcentrifuga per creare il pool di campioni. Diluire il pool di campioni a 1,25 nanomolari utilizzando il diluente di sequenziamento. Preparare il pool di campioni per il sequenziamento denaturandolo in presenza di phix control V3. Combinare i seguenti, 15 microlitri di campione da 1,25 nanomolari, tre microlitri da 0,5 nanomolari phix e due microlitri di idrossido di sodio 1N.

Dopo un breve vortice e centrifugazione, incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 8 microlitri di libreria denaturata a 992 microlitri di tampone alto HT1 preraffreddato in una provetta da microcentrifuga. Aggiungere 600 microlitri della libreria denaturata e diluita alla posizione numero 17 della cartuccia del reagente.

Nelle provette da microcentrifuga, diluire separatamente quattro microlitri di ciascun primer di sequenziamento con 636 microlitri di HT1 high buffer. Aggiungere 600 microlitri di primer di sequenziamento read-1 diluiti alla posizione numero 18 della cartuccia del reagente di sequenziamento. 600 microlitri di primer di lettura dell'indice diluiti alla posizione numero 19 e 600 microlitri di primer di sequenziamento read-2 diluiti alla posizione numero 20.

Caricare i reagenti sullo strumento di sequenziamento di nuova generazione ed eseguire un sequenziamento accoppiato, due per 150 cicli, secondo le istruzioni del produttore. Infine, analizza i dati di sequenziamento utilizzando il software di bioinformatica complementare. Un totale di 90 campioni può essere elaborato in una singola corsa NGS utilizzando un sequenziatore da banco.

Per il set di dati mostrato, i campioni includevano linea cellulare, parafina clinica residua formale e fissa incorporata, o FFPE, e DNA modello sintetico e hanno portato a un sequenziamento ad alta profondità e a una copertura uniforme. I valori anomali erano costituiti da nessun controllo stampo, una serie di diluizione di una linea cellulare di DNA con un'ampia amplificazione del numero di copie e un DNA FFPE che è stato contrassegnato per l'inibizione della PCR dal test QC preanalitico basato su qPCR. L'uniformità di copertura tra i 46 ampliconi è stata mantenuta utilizzando tre diversi operatori e per diversi campioni di DNA FFPE di bassa qualità.

Nella FFPE, la miscela di controllo del DNA tumorale composta da una mutazione nota di BRAF V600E al 5% è stata segnalata per avere la mutazione BRAF target con un'abbondanza media di 5,2 più o meno l'1,3% da tre operatori utilizzando un input di 400 copie amplificabili. Diluizioni di campioni di linea cellulare e di DNA FFPE con amplificazione del numero di copie dimostrate dipendono dall'amplificazione di EGFR e KRAS. Significativamente, l'input di DNA FFPE potrebbe essere ridotto a soli 50 copie amplificabili o 1,2 nanogrammi di DNA sfuso.

Preservando il rilevamento di mutazioni note senza chiamate false positive. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 11 ore con circa tre ore e mezza di tempo a disposizione per un lotto di 24 campioni alla volta, se eseguita correttamente.