Integrazione di Wet and Dry processi banco Ottimizza Targeted sequenziamento di prossima generazione di bassa qualità e di biopsie di tumori a bassa quantità

L'obiettivo generale di questa procedura è descrivere un sistema completo per il sequenziamento di campioni tumorali complessi, che combina reagenti di laboratorio, controlli standardizzati e un pacchetto bioinformatico autonomo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'oncologia, come ad esempio come sequenziare biopsie tumorali con quantità ridotte e scarsa qualità per ottenere analisi e interpretazioni accurate delle varianti del DNA. Il principale vantaggio di questo metodo è che i campioni difficili da sequenziare, ovvero quelli per cui è disponibile una quantità limitata di DNA, possono essere analizzati rapidamente e in modo affidabile mediante reagenti e controlli provenienti da un'unica fonte e un software bioinformatico completamente integrato.

Generalmente, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà a causa della complessità del NGS mirato, che questo metodo semplifica. Tuttavia, le procedure di quantificazione delle librerie e di pooling dei campioni richiedono particolare attenzione per ottenere una copertura uniforme su tutte le librerie di campioni. Questo protocollo integra processi di laboratorio chimico e informatico per il sequenziamento di campioni tumorali complessi.

Il primo passaggio consiste nella quantificazione e qualificazione del DNA per determinare il numero di copie del template di DNA che possono essere amplificate mediante PCR in tempo reale. Iniziare la procedura di quantificazione del campione e controllo di qualità preparando una quantità sufficiente di mix master in una provetta per microcentrifuga. Utilizzare i seguenti volumi per ogni campione: 5 microlitri di mix master 2x, 0,5 microlitri di mix di primer e sonda, 0,5 microlitri di mix di primer e sonda per l'inibizione, 0,05 microlitri di ROX e 2,95 microlitri di diluente.

Aggiungere nove microlitri del mix master in ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere un microlitro degli standard di DNA in duplicato e mescolare aspirando e dispensando cinque volte con la pipetta. Dopo aver verificato che il campione di acido nucleico sia ben miscelato, aggiungere un microlitro del campione al mix master e mescolare aspirando e dispensando cinque volte con la pipetta.

Posizionare la piastra sigillata nel sistema PCR. Eseguire i cicli PCR di 10 minuti a 95 gradi Celsius, seguiti da 40 cicli di 15 secondi a 95 gradi Celsius e un minuto a 60 gradi Celsius. Analizzare i dati di qPCR generando un grafico di regressione lineare per ciascuno degli standard di DNA duplicati.

La concentrazione del DNA sconosciuto in copie funzionali o amplificabili per microlitro viene quindi calcolata come descritto nel testo del protocollo. Il passaggio successivo alla quantificazione e al controllo di qualità del campione è l'arricchimento delle sequenze di hotspot tumorali mediante PCR multiplex in un singolo tubo. Verrà eseguita una PCR specifica per gene (gsPCR) per arricchire 46 loci in 21 geni del cancro.

Preparare una quantità sufficiente di mix master gsPCR in un tubo da microcentrifuga utilizzando i seguenti volumi per campione: cinque microlitri di mix master di amplificazione 2x e un microlitro di panel di primer pan-cancro. Aliquotare sei microlitri del mix master gsPCR in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere quattro microlitri di ciascun campione di acido nucleico in pozzetti separati.

Mescolare aspirando e dispensando cinque volte con la pipetta. Includere i controlli appropriati. Posizionare la piastra sigillata nel termociclatore per i seguenti cicli di PCR.

Cinque minuti a 95 gradi Celsius. 15 secondi a 95 gradi Celsius seguiti da quattro minuti a 60 gradi Celsius per due cicli. 15 secondi a 95 gradi Celsius seguiti da quattro minuti a 72 gradi Celsius per 23 cicli.

Un'estensione finale di 10 minuti a 72 gradi Celsius, seguita da mantenimento a quattro gradi Celsius. Dopo la PCR specifica per il gene, eseguire 10 cicli di tag-PCR per incorporare adattatori specifici per la piattaforma, compatibili con il sequenziamento di nuova generazione. Aggiungere 7,5 microlitri del master mix di indice 2x e 5,5 microlitri di un codice indice in un pozzetto specificato di una piastra a 96 pozzetti e mescolare aspirando e dispensando cinque volte con una pipetta.

Aprire con attenzione la piastra gsPCR ed aggiungere due microlitri di prodotto gsPCR alla nuova piastra contenente il master mix. Posizionare la piastra sigillata nel termociclatore per i seguenti cicli PCR: cinque minuti a 95 gradi Celsius, 30 secondi a 95 gradi Celsius, 30 secondi a 55 gradi Celsius e un minuto a 72 gradi Celsius per 10 cicli, seguiti da un'estensione finale di 10 minuti a 72 gradi Celsius. Successivamente, mantenere a quattro gradi Celsius.

Dopo il tag-PCR, la purificazione della libreria e la selezione per dimensione vengono effettuate utilizzando la chimica delle microsfere magnetiche. Iniziare questa procedura aggiungendo 11 microlitri di microsfere magnetiche Library Pure Prep in pozzetti separati di una piastra a 96 pozzetti. Aprire la piastra del tag-PCR e aggiungere 10 microlitri del prodotto di tag-PCR alle microsfere, quindi mescolare aspirando e dispensando cinque volte con una pipetta.

Incubare la miscela per quattro minuti a temperatura ambiente. Posizionare la piastra a 96 pozzetti su un supporto magnetico per quattro minuti. Con la piastra a 96 pozzetti ancora sul supporto, rimuovere e scartare il soprannuante con una pipetta.

Dopo aver lavato le perle due volte con tampone di lavaggio contenente etanolo come descritto nel testo del protocollo, lasciare asciugare le perle per due minuti a temperatura ambiente, quindi rimuovere la piastra dal supporto. Risospendere le perle aggiungendo 20 microlitri di tampone di eluizione in ciascun pozzetto ed eseguendo cinque aspirazioni e dispense con la pipetta. Incubare per due minuti a temperatura ambiente.

Posizionare nuovamente la piastra a 96 pozzetti sul supporto magnetico per quattro minuti ed eliminare con attenzione trasferendo 18 microlitri del sopranatante limpido in un pozzetto di una nuova piastra a 96 pozzetti. Il passaggio successivo di questo protocollo è la quantificazione di ciascuna libreria di campione purificato mediante PCR in tempo reale relativa competitiva. Per iniziare questa procedura, preparare una quantità sufficiente del master mix LQ in un tubo da microcentrifuga utilizzando i seguenti volumi per campione: cinque microlitri di master mix LQ 2x, due microlitri di mix di primer e probe LQ, 0,5 microlitri di standard LQ e 0,5 microlitri di LQ ROX.

Aggiungere 8 microlitri della miscela master LQ in una pozzetta di una piastra ottica da 96 pozzette. In pozzette separate, aggiungere 2 microlitri di una diluizione seriale della libreria, 2 microlitri del controllo positivo LQ e 2 microlitri del diluente LQ, quindi mescolare aspirando e dispensando cinque volte con la pipetta. Posizionare la piastra sigillata nel sistema PCR e assegnare sia il rilevatore FAM che il rilevatore VIC per ogni campione.

Eseguire l'amplificazione PCR utilizzando le seguenti condizioni di termociclaggio: cinque minuti a 95 gradi Celsius, seguiti da 15 secondi a 95 gradi Celsius e da un minuto a 60 gradi Celsius per 40 cicli. La concentrazione di ciascun campione viene quindi calcolata come descritto nel testo del protocollo. Dopo la quantificazione della libreria, ciascuna libreria di campione viene normalizzata in base alla concentrazione misurata e raggruppata in un singolo tubo per il sequenziamento.

Viene utilizzato un modulo di analisi semplificato per facilitare i calcoli relativi alla normalizzazione della libreria e al pooling dei campioni. Per normalizzare la libreria, determinare innanzitutto la concentrazione mediana in nanomolare in tutti i campioni, ciascuno contenente un indice univoco a coppie da raggruppare. Successivamente, determinare il volume individuale del campione in microlitri da raggruppare moltiplicando la concentrazione mediana di tutti i campioni per cinque, quindi dividendo per la sua concentrazione individuale.

Aggiungere il volume normalizzato di ogni campione in un singolo tubo microcentrifugo per creare il pool di campioni. Diluire il pool di campioni a 1,25 nanomolare utilizzando il diluente per sequenziamento. Preparare il pool di campioni per il sequenziamento denaturandolo in presenza del controllo phix V3. Combinare quanto segue: 15 microlitri di pool di campioni a 1,25 nanomolare, tre microlitri di phix a 0,5 nanomolare e due microlitri di idrossido di sodio 1N.

Dopo un breve vortex e una centrifugazione, incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 8 microlitri della libreria denaturata a 992 microlitri di tampone HT1 alto pre-raffreddato in un tubo da microcentrifuga. Aggiungere 600 microlitri della libreria denaturata e diluita nella posizione numero 17 del cartuccia dei reagenti.

In provette microcentrifuga, diluire separatamente quattro microlitri di ogni primer di sequenziamento con 636 microlitri di tampone HT1 alto. Aggiungere 600 microlitri di primer di sequenziamento per la lettura-1 diluiti nella posizione numero 18 della cartuccia del reagente per sequenziamento. Aggiungere 600 microlitri di primer diluiti per la lettura dell'indice nella posizione numero 19 e 600 microlitri di primer di sequenziamento per la lettura-2 diluiti nella posizione numero 20.

Caricare i reagenti sull'apparecchio di sequenziamento di nuova generazione ed eseguire un run di sequenziamento a lettura accoppiata, due per 150 cicli, seguendo le istruzioni del produttore. Analizzare infine i dati di sequenziamento utilizzando il software bioinformatico fornito. Un totale di 90 campioni può essere processato in un singolo run di sequenziamento NGS utilizzando un sequenziatore da banco.

Per il set di dati mostrato, i campioni includevano linee cellulari, resti clinici in formalina fissata e inclusi in paraffina (FFPE) e DNA di templato sintetico, ottenendo un sequenziamento ad alta profondità e una copertura uniforme. Gli outlier erano costituiti da controlli senza templato, una serie di diluizioni di DNA di una linea cellulare con amplificazione del numero di copie elevata e un DNA FFPE che era stato segnalato per inibizione della PCR mediante il saggio di controllo qualità basato su qPCR preanalitica. L'uniformità della copertura lungo i 46 ampliconi è stata mantenuta utilizzando tre operatori diversi e diversi campioni di DNA FFPE di bassa qualità.

Nella miscela di controllo di DNA tumorale FFPE contenente una nota mutazione BRAF V600E al 5%, è stato riportato che la mutazione bersaglio BRAF era presente con un'abbondanza media del 5,2 ± 1,3 percento da parte di tre operatori utilizzando un input di 400 copie amplificabili. Diluizioni di linee cellulari e campioni di DNA FFPE con amplificazioni del numero di copie hanno dimostrato una dipendenza dalla dose per l'amplificazione di EGFR e KRAS. Importante, l'input di DNA FFPE può essere ridotto fino a sole 50 copie amplificabili o 1,2 nanogrammi di DNA totale.

Mantenendo nel contempo il rilevamento delle mutazioni note senza alcuna chiamata di falsi positivi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 11 ore con circa tre ore e mezza di lavoro manuale per un lotto di 24 campioni alla volta, se eseguita correttamente.