Successivo sequenziamento di nuova generazione per il rilevamento di Actionable mutazioni nei tumori solidi e liquidi

L'obiettivo generale di questo saggio di sequenziamento mirato di nuova generazione basato su amplificazione è rilevare mutazioni patogene nei tumori del paziente per uso terapeutico, inclusi scopi diagnostici, prognostici e nella risposta alla terapia mirata. Questo metodo fornisce risposte a domande fondamentali, come ad esempio se un paziente presenti una mutazione in un gene che potrebbe trarre beneficio da una terapia mirata o alternativa. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nella possibilità di rilevare mutazioni clinicamente rilevanti, comuni e rare, in molti geni diversi, in qualsiasi tessuto tumorale, mediante un singolo saggio.

Poiché le tecniche e la tecnologia sono estremamente complesse e i passaggi sono molto difficili da apprendere, è fondamentale dimostrare questo metodo in modo visivo. Questo rappresenta un momento decisivo per il progresso dell'Ematologia Medica. Con l'introduzione del sequenziamento di nuova generazione in ambito clinico, potremo offrire ai nostri pazienti trattamenti contro il cancro più numerosi e più efficaci.

I nostri tecnologi CPD, Barentt Li, Patrick Candrea, Karthik Ganapathy e Joe Grubb, dimostreranno questa procedura. Parteciperò anche io per illustrare le parti più complesse del saggio. Dopo aver estratto il DNA genomico seguendo il protocollo indicato nel testo e le istruzioni del produttore, analizzare due microlitri del DNA estratto su un fluorimetro per determinare la concentrazione di lavoro del campione.

Per creare una libreria di amplificazione, in una piastra a 96 pozzetti semilorda denominata Piastra Hyb, aggiungere il volume necessario di TE con basso contenuto di EDTA, cinque microlitri del tubo di oligonucleotidi del pannello e da 100 a 250 nanogrammi di DNA genomico in ciascun pozzetto corrispondente. Questo è il passaggio singolarmente più cruciale, poiché qualsiasi errore in questa fase avrà conseguenze gravi. Dopo l'aggiunta del Reagente 1 per ibridazione degli oligonucleotidi per il sequenziamento e aver effettuato la centrifugazione secondo il protocollo indicato nel testo, incubare la Piastra Hyb nell'incubatore pre-riscaldato per ibridazione a 95 gradi Celsius per un minuto.

Dopo aver raffreddato lentamente l'incubatrice a 40 gradi Celsius, rimuovere la piastra dall'incubatrice e trasferire l'intero volume di ogni campione dalla Hyb Plate al centro dell'unità corrispondente di piastra filtrante preparata in precedenza e prerisciacquata, o FPU. Coprire l'FPU e centrifugare a 2.250 ×g e 20 gradi Celsius per tre minuti. Successivamente, aggiungere 45 microlitri di SW1 e centrifugare nuovamente.

Dopo un secondo lavaggio con SW1 e un lavaggio con UB1, aggiungere 45 microlitri di Extension Ligation Mix 3 in ogni pozzetto del campione e aspirare e rilasciare tre volte per mescolare. Sigillare la piastra con pellicola adesiva in alluminio e incubare l'intero assemblaggio FPU in un incubatore preriscaldato a 37 gradi Celsius per 45 minuti. Per l'amplificazione degli indici tramite PCR, disporre i primer nella piastra per l'amplificazione degli indici, o IAP Fixture, e aliquotare gli indici utilizzati nei pozzetti corrispondenti della piastra; quindi aggiungere 22 microlitri del PCR Master Mix, 2E12, e aspirare e rilasciare tre volte.

Dopo aver centrifugato la reazione di ligazione prolungata di 45 minuti secondo il protocollo descritto, aggiungere 25 microlitri di idrossido di sodio 50 millimolare in ciascun pozzetto dell'FPU ed eseguire almeno sei aspirazioni e dispense, assicurandosi che la punta della pipetta entri in contatto con la membrana. Successivamente, inclinando leggermente la piastra e utilizzando una pipetta multicanale impostata a 20 microlitri, aspirare e dispensare l'idrossido di sodio nella piastra FPU almeno sei volte. Trasferire l'eluito dall'FPU alla colonna corrispondente dell'IAP.

Pipettare delicatamente su e giù per combinare completamente il DNA con la PCR Master Mix prima di eseguire il programma PCR descritto nel protocollo testuale. Dopo aver verificato il rendimento della libreria e aver incubato i campioni con le perle di purificazione magnetiche secondo il protocollo testuale, aggiungere 30 microlitri di EBT in ogni pozzetto contenente perle lavate. Pipettare su e giù alcune volte per assicurarsi che le perle si stacchino dalle pareti del tubo.

Dopo aver incubato la piastra con agitazione e successivamente senza agitazione, posizionare la piastra sul supporto magnetico e trasferire 20 microlitri del soprannatante in una nuova piastra denominata Piastra di Normalizzazione della Libreria, o LNP. Dopo aver preparato il mix di normalizzazione, aggiungere 45 microlitri a ciascun campione della LNP, mescolando il tutto con inversioni intermittenti e vortexaggio della soluzione. Successivamente, sigillare la piastra con un film adesivo trasparente e agitare a 1.800 giri al minuto per 30 minuti.

Dopo aver lavato le perle, rimuovere la piastra con le perle dal supporto magnetico e, per eluire il campione, aggiungere 30 microlitri di idrossido di sodio 0,1 N fresco in ciascun pozzetto. Quindi, agitare la piastra con le perle a 1.800 giri al minuto per cinque minuti. Riposizionare la piastra con le perle sul supporto magnetico e, una volta chiarito il soprannatante, trasferire 30 microlitri dell'eluato nel Buffer di Stoccaggio per la Normalizzazione delle Librerie 1 precedentemente preparato nella Piastra di Stoccaggio.

Piegare la piastra, quindi aggiungere cinque microlitri di ogni campione da sequenziare a un tubo PAL (Pooled Amplicon Library) da 1,5 millilitri etichettato. A seconda della chimica di sequenziamento utilizzata, aggiungere da quattro a dieci microlitri di PAL a da 590 a 596 microlitri di Buffer HT1. Pulire e caricare la Flow Cell.

Caricare i reagenti. Quindi, seguire le indicazioni a schermo per avviare il sequenziamento. Al termine del sequenziamento, eseguire la pipeline di bioinformatica.

Analizzare le statistiche della corsa per assicurarsi che la libreria sequenziata abbia superato i parametri di controllo qualità stabiliti dal laboratorio. Infine, in un Visualizzatore di Dati Genomici, esaminare manualmente ogni variante visualizzando i file BAM. Questo è un riepilogo delle statistiche di corsa più importanti, esclusa la copertura media, utilizzate per determinare se un campione di preparazione della libreria ha superato il controllo qualità. Come mostrato qui per il Caso Uno, la Bioinformatica ha rilevato quattro mutazioni associate alla LMA segnalabili.

Una mutazione missenso in FLT3, una mutazione puntiforme missenso in IDH2 e una mutazione frameshift in NPM1. Le mutazioni in FLT3 si osservano nel circa 25% dei pazienti adulti con AML. Il significato prognostico delle mutazioni puntiformi nel dominio chinasi di FLT3, come quelle riscontrate in questo paziente con AML, ha un impatto prognostico non chiaro.

Isocitrato deidrogenasi 2, o IDH2, codifica un modificatore epigenetico che è comunemente mutato nella LMA. Le mutazioni nel gene della nucleofosmina, o NPM1, sono tra le mutazioni acquisite più frequenti nella LMA. Questa tabella elenca tutte le varianti esoniche per il Caso Due.

Sono state rilevate due mutazioni associate a malattie. Un'inserzione in frame nell'esone 20 di ERBB2 e una mutazione missenso in TP53. HER2/neu, o ERBB2, codifica un recettore tirosina chinasi.

Le inserzioni attivanti nell'esone 20 di HER2/neu si osservano nel due-quattro percento dei carcinomi polmonari a cellule adenocinomatose e rappresentano la maggior parte delle mutazioni di HER2/neu osservate nel cancro del polmone. Anche le alterazioni di TP53 sono comuni nel cancro. È necessario prestare particolare attenzione alla qualità e alla quantità di DNA estratto.

Questo è particolarmente importante per i campioni FFPE, che spesso sono fortemente degradati e presentano una resa di DNA variabile. Durante il processo di validazione del test clinico, è necessario stabilire delle metriche per la qualità e la quantità del DNA per ciascun campione prima di procedere alla preparazione della libreria di DNA.

Oltre alla preparazione della libreria, è fondamentale convalidare un Piano Bioinformatico Spy, determinando i valori soglia per il run di sequenziamento, le statistiche di controllo qualità, le statistiche di preparazione della libreria, la profondità di copertura di un Amplicon e la frequenza minima dell'allele riportabile. Una volta acquisita padronanza, la preparazione della libreria può essere completata in una giornata lavorativa. Tuttavia, l'intero flusso di lavoro del saggio richiede più tempo per l'estrazione del DNA, il sequenziamento, l'elaborazione dei dati e la revisione delle varianti.

Questa procedura è stata progettata per analizzare esclusivamente le mutazioni del DNA genomico in determinati punti critici chiave. Altri esami che utilizzano l'RNA possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come l'espressione differenziale dei geni, l'associazione al rischio di tumori e i riarrangiamenti strutturali. Sono in arrivo notevoli progressi.

L'adozione dell'automazione e l'integrazione di una barcodifica molecolare unica permetteranno ai laboratori di ridurre i tempi di analisi, utilizzare quantità minori di campione e rilevare varianti con una frequenza allelica molto bassa. Il rilevamento di mutazioni associate a malattie in campioni tumorali è da decenni parte della pratica clinica standard. Il sequenziamento di nuova generazione (NGS) rappresenta un approccio meno soggetto a bias per il sequenziamento parallelo di numerosi geni associati a molteplici tipi di cancro, consentendo l'identificazione di diverse mutazioni e terapie più efficaci per i pazienti.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.