Successivo sequenziamento di nuova generazione per il rilevamento di Actionable mutazioni nei tumori solidi e liquidi

L'obiettivo generale di questo test mirato all'amplicon con sequenziamento di nuova generazione è quello di rilevare mutazioni patogene nei tumori dei pazienti per uso terapeutico, compresa la diagnostica, la prognostica e la risposta alla terapia mirata. Questo metodo risponde a domande chiave, come ad esempio se un paziente ha una mutazione in un gene che può beneficiare di una terapia mirata o alternativa. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le mutazioni utilizzabili, sia comuni che rare, in molti geni possono essere rilevate in qualsiasi tessuto tumorale utilizzando un singolo test.

Poiché le tecniche e la tecnologia sono così complesse e i passaggi sono così difficili da imparare, è fondamentale dimostrare visivamente questo metodo. Questo è un momento decisivo per l'avanzamento dell'oncologia medica. Con l'adozione del sequenziamento di nuova generazione nella clinica, avremo più e migliori trattamenti contro il cancro per i nostri pazienti.

I nostri tecnologi CPD, Barentt Li, Patrick Candrea, Karthik Ganapathy e Joe Grubb dimostreranno questa procedura. Aiuterò anche in questo processo a mostrare le parti più complesse del saggio. Dopo aver estratto il DNA genomico secondo il protocollo di testo, seguendo il protocollo del produttore, eseguire due microlitri del DNA estratto su un fluorimetro per ottenere la concentrazione di lavoro del campione.

Per creare una libreria di ampliconi, in una piastra semi-gonna da 96 pozzetti chiamata Hyb Plate, aggiungere il volume necessario di EDTA a basso EDTA TE, cinque mircolitori dell'Oligo Tube del pannello, aggiungere da 100 a 250 nanogrammi di DNA genomico a ciascun pozzetto corrispondente. Questo è il passo più importante, poiché qualsiasi confusione qui avrà gravi conseguenze. Dopo l'aggiunta dell'Oligo Hybridization for Sequencing Reagent 1 e la rotazione secondo il protocollo di testo, incubare la Hyb Plate nell'incubatore di ibridazione preriscaldato a 95 gradi Celsius per un minuto.

Dopo aver raffreddato lentamente l'incubatore a 40 gradi Celsius, rimuovere la piastra dall'incubatore e trasferire l'intero volume di ciascun campione dalla piastra Hyb al centro dell'unità piastra filtrante prelavata corrispondente precedentemente preparata o FPU. Coprire l'FPU e centrifugare a 2, 250 volte G e 20 gradi Celsius per tre minuti. Quindi, aggiungere 45 microlitri di SW1 e centrifugare nuovamente.

Dopo un secondo lavaggio con SW1 e un lavaggio con UB1, aggiungere 45 microlitri di Extension Ligation Mix 3 a ciascun pozzetto del campione e convogliarlo su e giù tre volte per mescolare. Utilizzare un foglio di alluminio adesivo per sigillare la piastra e incubare l'intero gruppo FPU in un'incubatrice preriscaldata a 37 gradi Celsius per 45 minuti. Per indicizzare l'amplificazione PCR, disporre i primer nella piastra di amplificazione dell'indice, o dispositivo IAP, e aliquotare gli indici utilizzati nei pozzetti corrispondenti nella piastra, quindi aggiungere 22 microlitri di PCR Master Mix, 2E12, e convogliarlo su e giù tre volte.

Successivamente, dopo aver centrifugato la reazione di legatura dell'estensione di 45 minuti secondo il protocollo di testo, aggiungere 25 microlitri di idrossido di sodio da 50 millimolari a ciascun pozzetto del campione della FPU e convogliarlo su e giù almeno sei volte, assicurandosi che la punta della pipetta entri in contatto con la membrana. Quindi, con la piastra leggermente inclinata e una pipetta multicanale impostata su 20 microlitri, pipettare l'idrossido di sodio nella piastra FPU su e giù almeno sei volte. Trasferire l'eluizione dall'FPU alla colonna corrispondente dell'IAP.

Pipettare delicatamente su e giù per combinare accuratamente il DNA con la PCR Master Mix prima di eseguire il programma PCR delineato nel protocollo di testo. Dopo aver verificato la resa della libreria e incubato i campioni con le perle di purificazione magnetica secondo il protocollo di testo, aggiungere 30 microlitri di EBT a ciascun pozzetto di perle lavate. Pipettare su e giù un paio di volte per assicurarsi che le perle si stacchino dal lato del tubo.

Una volta che la piastra è stata incubata con e quindi senza agitarla, posizionare la piastra sul supporto magnetico e trasferire 20 microlitri di surnatante su una piastra completamente nuova chiamata piastra di normalizzazione della libreria, o LNP. Dopo la preparazione della miscela di normalizzazione, con inversione intermittente, e vortice della soluzione, aggiungere 45 microlitri a ciascun campione di LNP. Quindi, utilizzare una pellicola adesiva trasparente per sigillare la piastra e agitare a 1.800 giri/min per 30 minuti.

Dopo aver lavato le perle, rimuovere l'LNP dal supporto magnetico e per eluire il campione, aggiungere 30 microlitri di idrossido di sodio normale 0,1 fresco in ciascun pozzetto. Quindi, agitare l'LNP a 1.800 RMP per cinque minuti. Riposizionare l'LNP sul supporto magnetico e, dopo che il surnatante si è eliminato, trasferire 30 microlitri di eluizione nel buffer di conservazione della normalizzazione della libreria 1 precedentemente preparato nella piastra di conservazione.

Piegare la piastra, quindi aggiungere cinque microlitri di ciascun campione da sequenziare in una provetta da 1,5 millilitri etichettata Pooled Amplicon Library, o PAL. A seconda della chimica di sequenziamento utilizzata, aggiungere da quattro a 10 microlitri di PAL a 590-596 microlitri di Buffer HT1. Pulire e caricare la cella di flusso.

Caricare i reagenti. Inoltre, segui le istruzioni sullo schermo per avviare l'esecuzione della sequenza. Al termine dell'esecuzione del sequenziamento, eseguire la pipeline Bioinfomatics.

Analizza le statistiche di esecuzione per assicurarti che la libreria sequenziata abbia superato le metriche di controllo qualità determinate dal laboratorio. Infine, in un visualizzatore di dati genomici, esaminare manualmente ogni variante visualizzando i file BAM. Questo è un riassunto delle statistiche di esecuzione più importanti, esclusa la copertura media, utilizzate per determinare se un campione di preparazione della libreria ha superato QC.As visto qui per il caso uno, Bioinformatics ha rilevato quattro mutazioni associate alla LMA segnalabili.

Una mustazione missenso in FLT3, una mutazione missenso in IDH2 e una mutazione frameshift in NPM1. Le mutazioni di FLT3 sono state osservate in circa il 25% dei pazienti adulti con LMA. Il significato prognostico delle mutazioni puntiformi del dominio chinasico FLT3, come osservato in questo paziente con LMA, ha un impatto poco chiaro sulla prognosi.

L'isocitrato deidrogenasi 2, o IDH2, codifica per un modificatore epigenetico che è comunemente mutato nella LMA. Le mutazioni nel gene della nucleofosmina, o NPM1, sono una delle mutazioni più comunemente acquisite nella LMA. Questa tabella elenca tutte le varianti esoniche per il caso due.

Sono state rilevate due mutazioni associate alla malattia. Un'inserzione in-frame nell'esone 20 di ERBB2 e una mutazione missenso in TP53. HER2/neu, o ERBB2, codifica per un recettore tirosin-chinasico.

Le inserzioni attivanti dell'esone 20 di HER2/neu sono state osservate nel 2-4% degli adenocarcinomi polmonari e rappresentano la maggior parte delle mutazioni di HER2/neu osservate nel carcinoma polmonare. Le alterazioni di TP53 sono comuni anche nel cancro. È necessario prestare molta attenzione alla qualità e alla quantità di DNA estratto.

Ciò è particolarmente importante per i campioni FFPE. Proviamo spesso altamente degradato con una variabile la resa del DNA. Durante il processo di convalida del test clinico, è necessario stabilire le metriche per la qualità e la quantità del DNA per ciascun campione prima di far avanzare il DNA nella preparazione della libreria.

Oltre alla preparazione della libreria, è fondamentale convalidare un piano di spionaggio bioinfomatico, determinando i valori di cutoff per l'esecuzione del sequenziamento, le statistiche di controllo della qualità, le statistiche di preparazione della libreria, la profondità di coraggio di un Amplicon e la frequenza minima degli alleli segnalabili. Una volta padroneggiata, la preparazione della libreria può essere eseguita in una giornata lavorativa. Tuttavia, il flusso di lavoro complessivo del saggio richiede più tempo per l'estrazione del DNA, il sequenziamento, l'elaborazione dei dati e la revisione delle varianti.

Questa procedura è progettata per esaminare solo le mutazioni del DNA genomico in alcuni punti caldi chiave. Altre masse che utilizzano l'RNA possono essere eseguite per rispondere a domande aggiuntive come un'espressione differenziale dei geni, associare i tumori a rischio e i riarrangiamenti strutturali. Importanti progressi sono all'orizzonte.

L'adozione dell'automazione e l'incorporazione di un codice a barre molecolare unico consentirà ai laboratori di ridurre i tempi di risposta, utilizzare meno input di campioni e rilevare varianti a una frequenza allelica molto bassa. Il rilevamento delle mutazioni associate alla malattia nei campioni di cancro è stato lo standard di cura per decenni. L'NGS è un approccio meno distorto al sequenziamento di più geni associati a molti tumori in parallelo, che porta all'identificazione di più mutazioni e a migliori trattamenti per i pazienti.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.