Name: Successivo sequenziamento di nuova generazione per il rilevamento di Actionable mutazioni nei tumori solidi e liquidi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Scopri il sequenziamento di nuova generazione per rilevare mutazioni actionable in tumori solidi e ematologici. Questo metodo bioinformatico guida decisioni terapeutiche personalizzate in oncologia di precisione.

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Gli autori vorrebbero riconoscere l&#39;assistenza di Daniel Wild per la lettura del manoscritto e l&#39;assistenza nella produzione.

<ol><li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).</li>
<li>Campbell, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+patterns+and+dynamics+of+genomic+instability+in+metastatic+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The patterns and dynamics of genomic instability in metastatic pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1109-1113 (2010).</li>
<li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+evolution+in+relapsed+acute+myeloid+leukaemia+revealed+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing.</a> Nature. 481 (7382), 506-509 (2012).</li>
<li>Frampton, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+clinical+cancer+genomic+profiling+test+based+on+massively+parallel+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a clinical cancer genomic profiling test based on massively parallel DNA sequencing.</a> Nature Biotechnol. 31 (11), 1023-1031 (2013).</li>
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<li>Shih, A. H., Abdel-wahab, O., Patel, J. P., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mutations+in+epigenetic+regulators+in+myeloid+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The role of mutations in epigenetic regulators in myeloid malignancies.</a> Nat Rev Cancer. 12 (9), 599-612 (2012).</li>
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<li>Arcila, M. E., Chaft, J. E., Nafa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+clinicopathologic+associations%2C+and+molecular+spectrum+of+ERBB2+%28HER2%29+tyrosine+kinase+mutations+in+lung+adenocarcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Prevalence clinicopathologic associations, and molecular spectrum of ERBB2 (HER2) tyrosine kinase mutations in lung adenocarcinomas.</a> Clin Cancer Res. 18 (18), (2012).</li>
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<li>Sheikhha, M. H., Awan, A., Tobal, K., Liu Yin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+FLT3+ITD+and+D835+mutations+in+AML+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Hematol+J%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of FLT3 ITD and D835 mutations in AML patients.</a> Hematol J. 4 (1), 41-46 (2003).</li>
<li>Mazières, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer+that+harbors+an+HER2+mutation+epidemiologic+characteristics+and+therapeutic+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Lung cancer that harbors an HER2 mutation epidemiologic characteristics and therapeutic perspectives.</a> J Clin Oncol. 31 (16), 1-8 (2014).</li>
<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Genomics+Viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrative Genomics Viewer.</a> Nat Biotechnol. 29 (1), 495-500 (2011).</li>
<li>Forbes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COSMIC%3A+exploring+the+world%27s+knowledge+of+somatic+mutations+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">COSMIC: exploring the world's knowledge of somatic mutations in human cancer.</a> Nucleic Acids Res. 43 (Database issue), D805-D811 (2014).</li>
<li>Daber, R., Sukhadia, S., Morrissette, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+limitations+of+next+generation+sequencing+informatics%2C+an+approach+to+clinical+pipeline+validation+using+artificial+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genetics%22%5BJournal%5D)">Understanding the limitations of next generation sequencing informatics, an approach to clinical pipeline validation using artificial data sets.</a> Cancer Genetics. 206 (12), 441-448 (2013).</li>
<li>Haraksingh, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Mapping+of+Copy+Number+Variation+in+Humans%3A+Comparative+Analysis+of+High+Resolution+Array+Platforms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Mapping of Copy Number Variation in Humans: Comparative Analysis of High Resolution Array Platforms.</a> PLoS ONE. 6 (11), e27859(2011).</li>
<li>de Leeuw, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+Array+Analysis+in+Constitutional+and+Cancer+Genome+Diagnostics+-+Copy+Number+Variants%2C+Genotyping+and+Quality+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">SNP Array Analysis in Constitutional and Cancer Genome Diagnostics - Copy Number Variants, Genotyping and Quality Control.</a> Cytogenet Genome Res. 135 (3-4), 212-221 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

<html> Poiché le due prove NGS descritti in questo manoscritto sono offerti clinicamente, la più importante considerazione pratica è il controllo della qualità. In particolare, stretta considerazione deve essere prestata alla qualità e quantità di DNA estratto. Ciò è particolarmente importante per campioni FFPE che sono spesso altamente degradato con resa DNA variabile. Un metodo isopropanolo precipitazione è stata sviluppata al fine di massimizzare il rendimento del DNA da campioni FFPE come metodi basati su colonne sono stati trovati talvolta portare alla tranciatura DNA con volumi di eluizione limitati. Pertanto, la maggior parte del tempo in cui un esemplare produce concentrazione troppo bassa o troppo degradato per il test, è molto probabilmente a causa delle dimensioni del tessuto, tipo o fissaggio, e non il processo di estrazione. Per i campioni di sangue / midollo osseo, se vi è un guasto di estrazione, di solito è dovuto ad un campione di hemodilute essere (cioè, non avendo il numero sufficiente di sangue o di tumore bianchi cellule in quel pareggio) o chemio ablazione. . Nt &quot;&gt; Durante la convalida, tagli di accettabilità della qualità del DNA e la quantità dovrebbe essere istituito L&#39;ingresso raccomandata di 100-250 ng è spesso usato nel saggio, tuttavia, se la qualità del DNA è buona, allora quantità di input più bassi possono avere successo. Inoltre, se la qualità del DNA è scarsa (cioè, la quantità di DNA amplificabile è inferiore a 100 - 250 ng) allora importi più elevati dei fattori possono migliorare la qualità dei risultati di sequenziamento (poiché la quantità di DNA amplificabile raggiungerà l&#39;ingresso raccomandato) . Metriche per la qualità del DNA e la quantità dovrebbe essere applicato a ogni campione prima di passare il DNA in preparazione biblioteca. I campioni in una &quot;zona grigia&quot; (vedi figura 2) dovrebbe essere eseguito a discrezione del direttore del laboratorio o designato. Attualmente il migliore senso predire se il DNA non eseguirà bene durante sequenziamento è quello di eseguire un saggio qPCR-based che permette di valutare la quantificazione e la qualità del DNA di ingresso. Questo approccio risolve il bioavailabilità di frammenti di dimensioni diverse nel campione, attraverso l&#39;amplificazione di frammenti di dimensioni diverse (ad esempio, 100 bp, 150 bp, 200 bp e 300 bp) e confronto resa. Attualmente, la preparazione biblioteca coinvolge un gran numero di operazioni manuali, dove un passo falso in uno dei numerosi frangenti può causare la libreria sia sicuro o essere di scarsa qualità. L&#39;analisi di gel microfluidica è l&#39;unico passo QC per controllare un problema di biblioteca di preparazione prima di sequenziamento. Di conseguenza, ci sono diversi passaggi critici in cui la consapevolezza extra può aumentare la probabilità di una reazione di successo. È indispensabile garantire il campione corretto e piscina oligonucleotide sono utilizzati per ciascun campione. Garantire e registrare correttamente che ogni campione contiene una delle 96 combinazioni uniche di coppie dual-indicizzato di primer PCR riduce la possibilità per un campione confusione. Inoltre, è importante garantire la piastra filtrante (FPU) drena correttamente; se non scarica adeguatamente questo può causare la extepasso nsion-legatura della preparazione libreria per eseguire subottimale e portare a dati di sequenziamento scarsa qualità. Dopo libreria QC, è fondamentale garantire che le perline LNB1 siano completamente risospese e che la soluzione LNB1 / LNA1 è ben miscelato prima di aggiungere ai campioni come la concentrazione di questa miscela è utilizzato per determinare la molarità della libreria. Infine, se il passo tallone eluizione porta ad una quantità ottimale di biblioteca eluendo fuori le perline diminuirà la densità di clustering e causare la libreria di non ottenere un&#39;adeguata copertura medio. Al contrario, un eccesso di libreria comporterà qualità inferiore legge. Pertanto, è importante essere coerenti nella fase di normalizzazione tallone basata per garantire il pool ottimale e raggruppamento delle librerie del sequencer. Oltre alla preparazione biblioteca, è fondamentale per convalidare un oleodotto bioinformatica che produrrà le chiamate mutazione accurati dai, i file RAW de-multiplexing FASTQ. la scelta di unsoluzione personalizzata può essere in termini di tempo in quanto vi sono molti allineatori open source e disponibili in commercio, i chiamanti variante, e pacchetti software NGS che uno avrebbe dovuto passare al setaccio. dovranno algoritmi personalizzati per essere progettato per estrarre statistiche essenziali delle prestazioni, identificare le mutazioni ricorrenti uniche che sfuggivano strumenti più open source, e di determinare lo stato del numero di copie su ciascuno dei loci. Durante il processo di convalida di una conduttura bioinformatica, è importante determinare i tagli di informativa per le varianti che soddisfano o superano entrambi una profondità minima di copertura dopo filtrazione qualità (per esempio, un minimo di 250 letture) e una frequenza minima allele (ad esempio, 4 %). Poiché questo un saggio amplicone basato multiplato, è importante determinare la media minima profondità di copertura (ad esempio, 1,000x) che la biblioteca deve raggiungere per poter ottenere l&#39;amplicone eseguendo basso alla profondità minima di letture. Inoltre, la natura multiplato del test fa cause off effetti bersaglio e questi &#39;artefatti&#39; dovrà essere scoperto e completamente controllati prima del lancio. Un&#39;altra importante limitazione al test descritto è la necessità di campioni di contenere più del 10% del tumore al fine di conseguire l&#39;allele frequenza minima convalidato. Il rilevamento di bassa frequenza, 1%, inserzioni FLT3 è prova che revisione manuale è ancora desiderabile in questo processo. Anche con una frequenza allele cut-off del 5%, alcune mutazioni importanti forse senza risposta e revisione in tal modo manuale saranno essenziali per accertare queste varianti. Per FLT3-DTI, ispezione visiva dell&#39;esone 14 viene eseguita per tutti i pazienti con LMA per garantire un livello basso o grande inserimento / duplicazione non passare inosservato. Inoltre, HER2 esone 20 inserzioni che sono comunemente accanto alla sequenza primer devono intervento manuale. Pur avendo una robusta pipeline di bioinformatica, alcune varianti potrebbero andare trascurati, che è solo la natura di avere un taglio durooff per la maggior parte le statistiche di cui sopra. bioinformatica Meglio sarebbero necessari per contribuire ad alleviare questo problema, così come una migliore biblioteca preparazione e / o sequenziamento metodologie, perché è più vantaggioso disporre di dati di buona qualità a tagli ancora più bassi che contengono un minor numero di artefatti e falsi positivi. Il rilevamento e l&#39;interpretazione di frequenze alleliche possono essere difficile a causa della difficoltà di determinazione percentuale tumore e polarizzazione amplificazione alcune regioni del genoma. Inoltre, le frequenze alleliche oltre 50% possono essere rilevate, come osservato nel caso 2. Questo viene interpretato come una perdita di eterozigosi (LOH) evento, sia a causa di perdita dell&#39;allele normale, portando alla apparente aumento del mutante legge, un guadagno del allele mutante (ad esempio, 2 mutante e una copia normale) o altri meccanismi. Questi meccanismi possono essere chiariti utilizzando array di ibridazione genomica comparativa (CGH 19) e / o un array di genotipizzazione SNP. 20. Le attuali metodologie di arricchimento obiettivo si basano su procedure di un&#39;intera giornata di entrambi cattura ibrido inefficiente o tecniche di PCR multiplex che si traducono nella necessità di una maggiore copertura sequenziamento di un singolo campione e più fuori sequenza bersaglio legge. Ulteriori applicazioni per NGS oncologia molecolare ci si attende in un prossimo futuro includeranno più semplici metodi di preparazione libreria che può essere completamente automatizzabili e in grado di elaborare i campioni con quantità molto basse di DNA di ingresso (ad esempio, meno di 1 ng), così come i campioni con altamente degradati DNA. Per affrontare queste sfide, la maggior parte dei metodi saranno presumibilmente basati sulla PCR, sia essere un approccio a più fasi PCR o un approccio massicciamente parallelo singleplex PCR. Inoltre, codici a barre molecolare dei singoli ampliconi ha dimostrato di ridurre drasticamente il rumore di fondo di sequenziamento e consentirà analisi di campioni con proporzioni minori di cellule tumorali per ottenere basse frequenze alleliche e muoversi verso l&#39;acquisizione circulating cellule tumorali. Rilevazione delle mutazioni associate alla malattia nei campioni tumorali è stata standard di cura per decenni. Storicamente, i geni sono stati spesso testati in sequenza, un gene / esone alla volta, con l&#39;identificazione di una mutazione che porta alla fine della sequenza di test. L&#39;avvento di NGS ha consentito un approccio meno polarizzate ad sequenziare più geni associati con molti tumori in parallelo conducono alla identificazione di mutazioni multiple che sono associati con neoplasia. L&#39;utilità clinica della NGS per la rivelazione di mutazioni somatiche nel cancro è sempre più evidente. Infatti, l&#39;analisi NGS basata su campioni di tumore rappresenta un nuovo paradigma che sfida tradizionale, singolo test genetici, ma l&#39;utilità clinica è molto chiaro. laboratori clinici di oggi hanno l&#39;eccitante opportunità di coniugare un&#39;attenta validazione del metodo e interpretazione del test con l&#39;applicazione di questa potente tecnologia.

sequenziamento di prossima generazione (NGS) di campioni oncologia clinica è diventato più ampiamente disponibile nel corso degli ultimi anni, come sempre più punti di letteratura scientifica l&#39;importanza di individuare i cambiamenti genetici per il targeting e marcatori molecolari predittivi / prognostici. Pannello Multi-gene analisi e interi studi sequenziamento in entrambi epiteliali 1,2 e 3 ematologiche maligne hanno solidificato il concetto di eterogeneità del tumore e l&#39;evoluzione clonale come malattia progredisce e ricadute. Inoltre, a differenza delle tecnologie concorrenti come la reazione a catena della polimerasi (PCR) o sequenziamento Sanger, NGS in grado di rilevare la maggior parte delle alterazioni genomiche in tutti i geni del cancro clinicamente rilevanti in un singolo test 4. Il Centro per la diagnostica personalizzati inizialmente lanciato con due NGS pannelli clinici, una consuetudine pannello ematologica (eme-NGS Panel) e un off-the-shelf Cancer Panel per i campioni FFPE (Solid-NGS Panel) (vedi <strong&gt; Figura 1). Questi pannelli coprono le regioni di interesse clinicamente rilevanti o elevati di geni selezionati; Non tutti i geni o esoni sono completamente coperti. Ampliconi sono generati da ibridazione sonda seguita per estensione e legatura. Le regioni interessate sono ulteriormente amplificati con PCR con primer dual-indicizzato universale, consentendo fino a 96 campioni devono essere aggregate per il sequenziamento. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52758/52758fig1.jpg" /> Figura 1:. Elenco dei geni coperti nei pannelli preparazione Biblioteca viene eseguita utilizzando sia l&#39;usanza ematologiche Panel (Pannello di eme-NGS) di 33 geni o off-the-shelf Amplicon Cancer Panel (Solid-NGS) di 47 geni. Non tutti i geni o esoni sono coperti per intero, come alcuni ampliconi può riguardare soltanto alcune hotspot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/52758fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. &lt;</a>/ A&gt; Il contenuto per il pannello di eme-NGS è stato derivato da più fonti, ma centra circa 16 geni mutati nella leucemia mieloide acuta (AML) precedentemente descritto come dimostrazione di un alto livello di utilità clinica 5. Il-NGS solido pannello è prodotto commercialmente con le regioni mirate basate su geni comunemente mutato nel tumore come riportato nel catalogo di mutazioni somatiche in Cancro (COSMIC) del database 6. Diversi passaggi chiave che caratterizzano i flussi di lavoro per NGS clinici. Dopo il medico ordina il test, un patologo determina l&#39;adeguatezza del campione seguenti analisi per la percentuale del tumore e volume del campione. Nella nostra istituzione, si richiede almeno il 10% del tumore a causa del tasso sfondo sequenziamento di errore ( &quot;disturbo&quot;) della tecnologia e l&#39;efficienza del approccio mirato. Se il tessuto è adeguata per il test, il DNA genomico è estratto. Questo DNA viene poi sottoposto a controllo multiplo qualità (QC) passi. Se il DNA passa QC, una libreria amplicone viene generato e sequenziato. I dati risultanti viene analizzata attraverso un bioinformatica pipeline in-house. A seguito di analisi bioinformatica, le varianti sono rivisti manualmente ed interpretati per la patogenicità prima dell&#39;incorporazione in una relazione clinica. Qui di seguito vengono descritti due casi che ha attraversato questo rigorosa del flusso di lavoro e, infine, ha portato a cambiamenti nella gestione clinica. Caso 1 - leucemia mieloide acuta Una biopsia del midollo osseo dal paziente A era diagnostico per AML, senza la maturazione. Studi citogenetici sono stati inviati sul campione di midollo osseo e hanno dimostrato una normale cariotipo femminile. Ci sono stati 95% di blasti circolanti presenti, in modo da una periferica campione di sangue è stato inviato per l&#39;esame diagnostico personalizzato sul pannello eme-NGS. Leucemia mieloide acuta (LMA) è un tumore maligno ematologica della linea mieloide dei globuli bianchi. La rilevazionedi mutazioni geniche in LMA è diventato sempre più importante per la prognosi e il trattamento, con mutazioni genetiche ricorrenti riconosciuti come importante nella patogenesi e la prognosi 7. Le mutazioni in NPM1 e CEBPA sono stati associati con un rischio prognostico favorevole, mentre duplicazioni tandem interni (DTI) a FLT3 sono stati associati con un esito meno favorevole 8. Un crescente corpo di evidenze supporta un ruolo patogenetico di queste e altre mutazioni in AML 9. Caso 2 - Polmone Adenocarcinoma Una biopsia di una massa sopraclaveare sinistro da paziente B ha dimostrato adenocarcinoma polmonare. materiale bioptico dal incluso in paraffina (FFPE) linfonodo fissato in formalina è stato inviato per il test genomico (pannello solido-NGS), come rotoli / riccioli con più del 50% del tumore, per identificare se una mutazione era presente per un intervento terapeutico mirato. Lung cancER è la principale causa di mortalità per cancro correlati negli Stati Uniti ed è diviso in due tipi principali, non a piccole cellule del polmone (NSCLC) e carcinoma polmonare a piccole cellule (SCLC). NSCLC può essere ulteriormente definita come adenocarcinoma o carcinoma a cellule squamose, sulla base l&#39;istologia della lesione. Polmone adenocarcinoma è il sottotipo più comune di cancro del polmone, visto in fumatori e non fumatori, ed è la forma più comune di cancro al polmone per i non fumatori 10. Studi molecolari degli adenocarcinomi del polmone hanno identificato mutazioni in diversi oncogeni 11. Le mutazioni del driver più comuni individuate nei fumatori sono mutazioni nel gene KRAS e BRAF. Le mutazioni più comuni nei non fumatori sono mutazioni in EGFR, e riarrangiamenti che coinvolgono i geni ALK, RET e ROS1. Tumori del polmone sono stati descritti con un esone 20 inserimento in-frame nel ERBB2 gene (HER2 / neu). L&#39;anomalia più comune in HER2 / neu è un ampliamento di questo locus nel carcinoma mammario per le quali una terapia mirata è disponibile (trastuzumab: un anticorpo monoclonale umanizzato contro HER2 / neu). Il 20 inserimento HER2 / neu esone che si osserva nel 2-4% del polmone adenocarcimomas 12 ha mostrato risposta parziale alla terapia di combinazione con HER2 / neu e inibitori di mTOR (neratinib e temsirolimus, rispettivamente) 13.

<table><tbody><tr><td>ScreenTape per DNA genomico</td><td>Tecnologia Agilent</td><td>5067-5365</td><td></td></tr><tr><td>Reagenti per DNA genomico</td><td>Tecnologia Agilent</td><td>5067-5366</td><td></td></tr><tr><td>ScreenTape D1000 ad alta sensibilità</td><td>Tecnologia Agilent</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>Reagenti D1000 ad alta sensibilità</td><td>Tecnologia Agilent</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr>Tecnologia <td>Agilent</td> <td>TapeStation 2200</td>Software <td>di analisi TapeStation G2965A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tecnologia Agilent</td><td>A.01.04 o superiore</td><td></td></tr><tr><td>Rack per lo stoccaggio di provette a 96 pozzetti Rack per provette da</td> 15/50 ml <td>di qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rack per piastre a 96 pozzetti</td><td>di qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetta, canale singolo, 0,5&ndash; 2.5 &mu; l</td><td>Pipetta di qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, monocanale, 1&ndash; 10 &mu; l</td><td>Pipetta di qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, canale singolo, 2&ndash; 20 &mu; l</td><td>Pipetta di qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, canale singolo, 10&ndash; 100 &mu; l</td><td>Pipetta di qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, monocanale, 20&ndash; 200 &mu; l</td><td>Pipetta di qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, canale singolo, 100&ndash; 1.000 &mu; l</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettatore sierologico</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Secchiello per il ghiaccio</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga (per provette e provette a strisce)</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Congelatore, -20 &deg; C</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg; C Frigorifero</td><td>Qualsiasi fornitore Acqua</td><td></td><td></td></tr><tr><td>o Bagno di perline</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice (37 &deg; c)</td> <td>Eventuali Piccine</td> Sierologiche Fornitori<td></td><td></td></tr><tr><td>, 1&nbsp; ml</td> Pipette sierologiche <td>di qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 5&nbsp; ml</td> Pipette sierologiche <td>di qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 10&nbsp; ml</td> Pipette sierologiche <td>di qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 25&nbsp; ml</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guanti</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamette da barba/Grilletti</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo conico da 15 ml</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo conico da 50 ml</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Asciugamani di carta</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 prova di etanolo</td><td>Qualsiasi fornitore Negozio</td><td></td><td>in armadio infiammabile</td></tr><tr><td>2-propanolo (isopropanolo)</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td>Negozio in armadio infiammabile</td></tr><tr><td>Serbatoi da 25 ml Qualsiasi</td><td>fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 N NaOH</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetta, 8 canali, 1 &ndash; 10 &mu; l</td><td>Pipetta di qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 8 canali, 10 - 100 & l</td><td>Pipetta di qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 8 canali, 20 - 300 & l</td><td>Secchiello</td> per il ghiaccio di qualsiasi fornitore <td></td><td></td></tr><tr><td>Bottiglia di spruzzatura d'acqua</td> di <td>qualsiasi fornitore</td> Bottiglia di spruzzatura di alcol di qualsiasi fornitore <td></td><td></td></tr> Carta per <tr><td>la pulizia delle lenti</td><td>di qualsiasi</td> fornitore Qualsiasi piastra del fornitore<td></td><td></td></tr><tr><td>, PCR a 96 pozzetti, semi-gonna</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> Strisce di tubi, 8 pozzetti, 0,2&nbsp;<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ml</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>BioShake IQ o 3000-T olmo</td><td>Bulldog Bio/Q.Instruments</td><td>1808-0506/ 1808-0517</td><td></td></tr><tr><td>DropPlate96 S - LabChipDS</td><td>Calibro</td><td>128876</td><td></td></tr><tr><td>DropPlate96 D - LabChipDS</td><td>Calibro</td><td>132848</td><td></td></tr><tr><td>Calibro DropSense96</td><td>(Trinean)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DropQuant Software</td><td>Pinza (Trinean)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pellicola sigillante per piastre</td><td>Denville</td><td>B1212-5S</td><td></td></tr><tr><td>Foglio di tenuta in alluminio</td><td>Denville</td><td>B1212-6S</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di acqua pura senza nucleasi</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5424 centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>22621408</td><td></td></tr><tr><td>5804R</td><td>Eppendorf</td><td>22623508</td><td>Rotatori per provette e piastre da 15 ml, preferibilmente una centrifuga che può arrivare fino a 2.500 x g.</td></tr><tr><td>Provetta Safe-Lock da 1,5 ml,</td> Provetta Natural <td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>da 5 ml, Provetta DNA LoBind</td><td>Centrifuga Eppendorf</td><td>30108310</td><td></td></tr><tr><td>5430R</td><td>Eppendorf</td><td>022620645</td><td>Qualsiasi centrifuga rotatore a piastre funzionerà Incubatore</td></tr><tr><td>per microcampioni Hybex</td><td>Fisher Scientific</td><td>1057-30-0</td><td></td></tr><tr><td>Blocco provette Hybex da 0,2 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>1057-31-0</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Amplicon &ndash; Pannello Cancer Illumina</td><td></td><td>FC-130-1008</td><td>96 reazioni</td></tr><tr><td>TruSeq Custom Amplicon</td><td>Illumina</td><td>PE-940-1011</td><td>96 reazioni</td></tr><tr><td>TruSeq Custom Amplicon Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1003</td><td>96 indici, 384 campioni</td></tr><tr><td>Kit di reagenti MiSeq v3, 500 cicli</td><td>Kit</td> di reagenti Illumina <td>MS-102-3003</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq v2, 300 cicli</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2002</td><td></td></tr><tr><td>Kit di reagenti MiSeq v2, 500 cicli</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>Experiment Manager</td><td>Illumina</td><td>1.3 o superiore</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reporter</td><td>Illumina</td><td>2.0 o superiore</td><td></td></tr><tr><td>Visualizzatore di analisi del sequenziamento</td><td>Illumina</td><td>1.8 o superiore</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Index Plate Fixture and Collar Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1007</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq v2</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Custom Amplicon Filter Plate</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1006</td><td></td></tr><tr><td>Index Adapter Tappi di ricambio Illumina</td><td></td><td>11294657</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 0.5 ml Provette</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA Kit di test</td> <td>ad ampio raggioInvitrogen</td><td>Q32853</td><td></td></tr><tr><td>DynaMa6-96 Supporto magnetico, gonna laterale</td><td>Invitrogen</td><td>120.27</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp PCR System 9700 (blocco oro/argento)</td><td>Life Technologies</td><td>N8050200</td><td></td></tr><tr><td>Gentra Puregene Blood Kit</td><td>Qiagen</td><td>158489</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di deparaffinazione (16 ml)</td><td>Qiagen</td><td>19093</td><td></td></tr><tr><td>Tampone ATL (4 x 50 ml)</td><td>Qiagen</td><td>939011</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di Precipitazione Proteica (50 ml)</td><td>Qiagen</td><td>158910</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di Idratazione del DNA (100 ml)</td><td>Qiagen</td><td>158914</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di Glicogeno (500&nbsp; &mu; l)</td><td>Qiagen</td><td>158930</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen proteinasi K</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr><tr><td>RNASI (5 ml)</td><td>Qiagen</td><td>158924</td><td></td></tr><tr><td>Acqua senza nucleasi (10 x 50 ml)&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>129114</td><td></td></tr><tr><td>Pestelli</td><td>USA Scientific</td><td>1415-5390</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 10 &#181; l puntali per pipette con filtro allungato in rack sterilizzati, 10 rack da 96 puntali (960 puntali).</td><td>USA Scientific</td><td>1180-3810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 100 &#181; l. puntali per pipette con filtro smussato naturale in rack sterilizzati, 10 rack da 96 puntali (960 puntali)</td><td>USA Scientific</td><td>1180-1840</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 200 &mu; l. puntali per pipette con filtro smussato naturale in rack, rack sterilizzati, 10 rack da 96 puntali (960 puntali)</td><td>USA Scientific</td><td>1180-8810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 20 &mu; l. puntali per pipette con filtro smussato naturale in rack, rack sterilizzati, 10 rack da 96 puntali (960 puntali)</td><td>USA Scientific</td><td>1180-1810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 1.000 &mu; l puntali per pipette con filtro XL naturale e graduato in</td><td>USA Scientific</td><td>1182-1830</td><td></td></tr></tbody></table>

successivo sequenziamento di nuova generazione per il rilevamento di actionable mutazioni nei tumori solidi e liquidi

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

Man mano che la nostra comprensione delle mutazioni driver necessarie per l'inizio e la progressione dei tumori migliora, otteniamo informazioni critiche su come specifici profili molecolari di un tumore possono predire la risposta agli agenti terapeutici o fornire conoscenze sulla prognosi. Presso il nostro istituto è stato istituito un programma di genotipizzazione dei tumori come parte delle cure cliniche di routine, che esamina sia i tumori ematologici che quelli solidi per un ampio spettro di mutazioni utilizzando due pannelli di sequenziamento di nuova generazione (NGS): un pannello personalizzato di 33 neoplasie ematologiche geniche per l'uso con sangue periferico e midollo osseo e un pannello di tumori solidi prodotto commercialmente per l'uso con tessuto incluso in paraffina fissato in formalina che ha come bersaglio 47 geni comunemente mutati nel cancro. Il nostro flusso di lavoro include una revisione patologica della biopsia per garantire che vi sia una quantità adeguata di tumore per il test, seguita dall'estrazione personalizzata del DNA sul campione. Il controllo di qualità del campione include passaggi per la quantità, la qualità e l'integrità e solo dopo che il DNA estratto ha superato queste metriche viene generata e sequenziata una libreria di ampliconi. I dati risultanti vengono analizzati attraverso una pipeline bioinformatica interna e le varianti vengono esaminate e interpretate per verificarne la patogenicità. Qui forniamo un'istantanea dell'utilità di ciascun pannello utilizzando due casi clinici per fornire informazioni su come un flusso di lavoro NGS ben progettato possa contribuire all'ottimizzazione dei risultati clinici.

Caso 1 - eme-NGS Panel Il DNA estratto da sangue periferico leucemica era di qualità sufficiente e la quantità (176 ng / ml) per il pannello di eme-NGS. La profondità media complessiva di copertura è 4,933x (al di sopra della profondità media minima di copertura dei 1,000x). Ulteriori statistiche run sono in Tabella 3. Degli 8 regioni sottostanti copertura 250x, 3 erano dovuti a taglio improprio dei primer (cioè, la sequenza di innesco non è stato rimosso correttamente a causa di errori di sequenziamento), 1 era un artefatto conosciuto del dosaggio, e gli altri 4 erano zone parziali di esoni di geni diversi senza varianti informativa. Anche se il nostro protocollo clinico comprende solo la segnalazione varianti coperte da almeno 250 legge, tutti i dati con almeno 100 letture vengono importati nel database per la revisione. Il trattamento dei dati from il gasdotto bioinformatica rilevato tre informativa, malattia mutazioni associate; una mutazione missense in FLT3, una mutazione missense nel IDH2, e una mutazione frameshift in NPM1. Le varianti exonic con le loro frequenze alleliche sono descritti nella Tabella 4. Una mutazione comune nel FLT3 è il FLT3 -Internal tandem duplicazione (ITD) che non viene chiamato automaticamente dalla nostra pipeline e richiede un controllo visivo dell&#39;esone 14. Controllo visivo dell&#39;esone 14 di FLT3 non ha mostrato alcuna inserimento o la duplicazione nel campione presentati. Il FLT3 I836del era al 1% frequenza allelica e non è stata inclusa nella relazione finale perché è caduto sotto la frequenza minima allele convalidata del 5%. Questa mutazione non è sulla stessa molecola di DNA come il cambiamento FLT3 D835Y (cioè, osservato nella stessa regione amplicone, ma non in &quot;cis&quot; di qualsiasi sequenza letture) ed è stata osservata solamente con una revisione manuale del fi .bamLes quando si verifica la variazione p.D835Y. Le frequenze alleliche inferiori delle due mutazioni FLT3 suggerisce queste mutazioni possono rappresentare l&#39;eterogeneità e / o evoluzione clonale; tuttavia, la differenza potrebbe essere dovuta a prestazioni del test per quella amplicone o un polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) vicino o sovrapposizione la sequenza di innesco che ha colpito l&#39;amplificazione di questo allele. I risultati del pannello eme-NGS per Caso 1 con leucemia mieloide acuta identificato mutazioni in FLT3, IDH2, e NPM1, tre geni comunemente mutati in AML. Le mutazioni in FLT3 si osservano in ~ 25% dei pazienti adulti con leucemia mieloide acuta (database COSMIC 17) e sono o duplicazioni tandem interno (DTI) o mutazioni missense nel dominio della tirosin-chinasi. I FLT3-DTI sono la mutazione più comune e sono associati con scarsa risposta alla chemioterapia standard, mentre il significato prognostico di FLT3 chinasi dmutazioni puntiformi OMain, come si vede in questo paziente AML, ha un impatto sulla prognosi chiaro 14. Isocitrate deidrogenasi 2 (NADP +), mitocondriale (IDH2) è un gene che codifica un modificatore di epigenetica che viene comunemente mutato in AML. Mutazioni nel modificatori epigenetici sono relativamente comuni nella LAM, con mutazioni nel IDH1 e dnmt3a che rappresentano altre mutazioni in questa classe di geni che portano a geni disregolazione. Le mutazioni nel gene per nucleophosmin (NPM1) sono una delle mutazioni acquisite più comuni in AML e sono generalmente considerati di essere un buon fattore prognostico (in assenza di un FLT3 - ITD). Co-mutazioni NPM1 e IDH2 sono stati descritti in letteratura come indicatore prognostico favorevole 5, con una sopravvivenza globale a 3 anni del 89%. Ciò rappresenta un vantaggio significativo di sopravvivenza rispetto alla sopravvivenza globale a 3 anni diwild type NPM1 e IDH2 del 31%. Ad esempio, standard di pratica di assistenza include l&#39;analisi di mutazione per NPM 1 e mutazioni FLT3-ITD. In questo scenario, l&#39;individuazione di una mutazione unica NPM1 avrebbe mancato di opportunamente paziente stratificare per il rischio, come le mutazioni secondarie possono essere favorevoli (ad esempio, IDH2) o sfavorevole (ad esempio, TET2), riducendo la fiducia per alleviare un trapianto di midollo osseo. Caso 2 - pannello solido-NGS DNA estratto dal tessuto FFPE era di qualità sufficiente e quantità per Solid-NGS Panel, con una concentrazione di 252 ng / ml e solo il 4% del DNA inferiore a 1.000 paia di basi (bp). Dopo l&#39;analisi dei dati la profondità media di copertura era 9.167 legge (ben al di sopra la nostra profondità di taglio minimo di 1.000 legge), senza regioni al di sotto di 250 profondità di lettura. Ulteriori metriche QC sono shown in Tabella 3. I dati trattati attraverso il gasdotto bioinformatica rilevati due associata a malattia mutazioni: un inserimento in-frame in esone 20 di ERBB2 (HER2 / neu) e una mutazione missense nel TP53. Tutte le varianti exonic con le loro frequenze alleliche sono rappresentati nella Tabella 5. L&#39;inserimento in ERBB2 in realtà rappresenta un tandem duplicato (HER2 / neu) sequenza, che si riflette nella nomenclatura. L&#39;identificazione e la conferma della revisione manuale in-frame inserimento richiesta del sequenziamento legge attraverso IGV. Il rilevamento di frequenze di mutazione superiori al 50%, come visto sia per il TP53 e HER2 / neu mutazioni è indicativo di una perdita di eterozigosi evento (LOH) (vedi la discussione). I risultati Solid-NGS pannello per Caso 2 con mutazioni adenocarcinoma del polmone rilevati in ERBB2 (HER2 / neu) e TP53, due geni non comunemente testati per come parte della corrente standard di cura per i pazienti affetti da cancro del polmone. HER2 / neu codifica per un recettore tirosin-chinasi simile ad un altro gene comunemente mutato nel cancro del polmone, EGFR . Attivazione HER2 esone / neu sono osservati 20 inserzioni in 2-4% degli adenocarcinomi del polmone, rappresentano la maggior parte dei HER2 mutazioni / neu osservate nel cancro del polmone, e sono tipicamente visto in tumori senza mutazioni in altri geni del driver, come EGFR e ALK 12 . Ci sono diverse linee di prove che dimostrano il potenziale per le varie opzioni di trattamento per i pazienti con l&#39;attivazione di inserzioni HER2 / neu, tra cui risposta parziale alla terapia di combinazione con HER2 / neu e inibitori di mTOR 13 e controllo delle malattie significativa con l&#39;anticorpo monoclonale trastuzumab in combinazione con la chemioterapia 15. Alla scoperta di un cambiamento TP53 non è uncoMMON nel cancro, ma in questo momento non esistono terapie attuabili. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Caso 1 </td><td> caso 2 </td></tr><tr><td> Totale a partire Legge </td><td> 2.215.926 </td><td> 2.129.110 </td></tr><tr><td> Percentuale di Legge Mapping </td><td> 98.42% </td><td> 98.29% </td></tr><tr><td> Percentuale di Legge su Target </td><td> 99.01% </td><td> 97.29% </td></tr><tr><td> Percentuale di Legge sulla destinazione dopo Filter </td><td> 97.60% </td><td> 95.45% </td></tr><tr><td> Percentuale di utilizzabile Legge </td><td> 94.87% </td><td> 91.79% </td></tr><tr><td> Percentuale delle basi sopra copertura 250x </td><td> 98.40% </td><td> 100% </td></tr><tr><td> Percentuale delle basi unLa copertura Bove 1000x </td><td> 95.90% </td><td> 99.70% </td></tr><tr><td> La copertura Sotto 250x - Amplicon Numero </td><td> 8 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table> Tabella 3:. Sequencing Run QC Metrics Questo è un riassunto delle più importanti statistiche di esecuzione, che non includono la copertura media, che vengono utilizzati per la revisione dei dati per determinare se un campione biblioteca preparazione è passato controllo di qualità. L&#39;intero processo è successo se tutte le percentuali sono superiori al 90%, ma è possibile, con riporto di SW1 o UB1 nel passo FPU lavaggio o Primer cross-talk, ad avere minore &#39;Percent su Target&#39; nell&#39;intervallo 80 - 90%. Se il &#39;Percent Mapped&#39; è troppo bassa, che indicano una contaminazione di batteri o altro DNA, come tutti i campioni devono allinearsi umana. Quando una di queste specifiche sono al di sotto dell&#39;80%, il campione è in posizione di ulteriore revisione per aiutare a determinare come proceed e migliorare il processo. <img alt="Tabella 4" src="/files/ftp_upload/52758/52758tbl4.jpg" /> Tabella 4:.. Caso 1 Risultati rilevato patogeni, malattia associata, variante di significato sconosciuto (VUS), e varianti exonic probabilmente benigni sopra i criteri di rilevazione del 5% frequenza dell&#39;allele sono elencate <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/JoVE_Table_4.xlsx" target="_blank">Cliccate qui per scaricare questa tabella.</a> <img alt="Tabella 5" src="/files/ftp_upload/52758/52758tbl5.jpg" /> Tabella 5:.. Caso 2 Risultati rilevato patogeni, malattie associate, variante di significato sconosciuto (VUS), e le varianti exonic probabilmente benigni sopra i criteri di rilevazione del 5% frequenza dell&#39;allele sono elencati <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/JoVE_Table_5.xlsx" target="_blank">Cliccate qui per scaricare questa tabella</a>. Supplemento Figura 1: Un esempio di SampleSheet.csv amplicone-based. Questa scheda trasmette al sequencer ciò chimica per eseguire (in questo caso Amplicon), ciò workflow (ad esempio, GenerateFastq), ciò Applicazione e Assay (ad esempio, FastqOnly), quante basi (o legge) a sequenza (in questo caso 186 bp x 186 bp), ed infine quali campioni sono associate con alcuni indici (in questo caso doppia indicizzazione). Le parti che sono evidenziati in giallo possono essere modificati a tutto ciò che lo sperimentatore vuole, ma in questo caso il laboratorio utilizza questi parametri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/SupplementaryFigure1.pdf" target="_blank">Cliccate qui per scaricare questa cifra.</a>

Questo manoscritto descrive i protocolli clinici per due pannelli di sequenziamento di nuova generazione. Un pannello interroga le neoplasie ematologiche, mentre l'altro pannello prende di mira i geni comunemente mutati nei tumori solidi. La classificazione molecolare delle mutazioni driver nelle neoplasie umane offre preziose informazioni prognostiche e predittive.

Successivo sequenziamento di nuova generazione per il rilevamento di Actionable mutazioni nei tumori solidi e liquidi

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

L'obiettivo generale di questo saggio di sequenziamento mirato di nuova generazione basato su amplificazione è rilevare mutazioni patogene nei tumori del paziente per uso terapeutico, inclusi scopi diagnostici, prognostici e nella risposta alla terapia mirata. Questo metodo fornisce risposte a domande fondamentali, come ad esempio se un paziente presenti una mutazione in un gene che potrebbe trarre beneficio da una terapia mirata o alternativa. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nella possibilità di rilevare mutazioni clinicamente rilevanti, comuni e rare, in molti geni diversi, in qualsiasi tessuto tumorale, mediante un singolo saggio.Poiché le tecniche e la tecnologia sono estremamente complesse e i passaggi sono molto difficili da apprendere, è fondamentale dimostrare questo metodo in modo visivo. Questo rappresenta un momento decisivo per il progresso dell'Ematologia Medica. Con l'introduzione del sequenziamento di nuova generazione in ambito clinico, potremo offrire ai nostri pazienti trattamenti contro il cancro più numerosi e più efficaci.I nostri tecnologi CPD, Barentt Li, Patrick Candrea, Karthik Ganapathy e Joe Grubb, dimostreranno questa procedura. Parteciperò anche io per illustrare le parti più complesse del saggio. Dopo aver estratto il DNA genomico seguendo il protocollo indicato nel testo e le istruzioni del produttore, analizzare due microlitri del DNA estratto su un fluorimetro per determinare la concentrazione di lavoro del campione.Per creare una libreria di amplificazione, in una piastra a 96 pozzetti semilorda denominata Piastra Hyb, aggiungere il volume necessario di TE con basso contenuto di EDTA, cinque microlitri del tubo di oligonucleotidi del pannello e da 100 a 250 nanogrammi di DNA genomico in ciascun pozzetto corrispondente. Questo è il passaggio singolarmente più cruciale, poiché qualsiasi errore in questa fase avrà conseguenze gravi. Dopo l'aggiunta del Reagente 1 per ibridazione degli oligonucleotidi per il sequenziamento e aver effettuato la centrifugazione secondo il protocollo indicato nel testo, incubare la Piastra Hyb nell'incubatore pre-riscaldato per ibridazione a 95 gradi Celsius per un minuto.Dopo aver raffreddato lentamente l'incubatrice a 40 gradi Celsius, rimuovere la piastra dall'incubatrice e trasferire l'intero volume di ogni campione dalla Hyb Plate al centro dell'unità corrispondente di piastra filtrante preparata in precedenza e prerisciacquata, o FPU. Coprire l'FPU e centrifugare a 2.250 ×g e 20 gradi Celsius per tre minuti. Successivamente, aggiungere 45 microlitri di SW1 e centrifugare nuovamente.Dopo un secondo lavaggio con SW1 e un lavaggio con UB1, aggiungere 45 microlitri di Extension Ligation Mix 3 in ogni pozzetto del campione e aspirare e rilasciare tre volte per mescolare. Sigillare la piastra con pellicola adesiva in alluminio e incubare l'intero assemblaggio FPU in un incubatore preriscaldato a 37 gradi Celsius per 45 minuti. Per l'amplificazione degli indici tramite PCR, disporre i primer nella piastra per l'amplificazione degli indici, o IAP Fixture, e aliquotare gli indici utilizzati nei pozzetti corrispondenti della piastra; quindi aggiungere 22 microlitri del PCR Master Mix, 2E12, e aspirare e rilasciare tre volte.Dopo aver centrifugato la reazione di ligazione prolungata di 45 minuti secondo il protocollo descritto, aggiungere 25 microlitri di idrossido di sodio 50 millimolare in ciascun pozzetto dell'FPU ed eseguire almeno sei aspirazioni e dispense, assicurandosi che la punta della pipetta entri in contatto con la membrana. Successivamente, inclinando leggermente la piastra e utilizzando una pipetta multicanale impostata a 20 microlitri, aspirare e dispensare l'idrossido di sodio nella piastra FPU almeno sei volte. Trasferire l'eluito dall'FPU alla colonna corrispondente dell'IAP.Pipettare delicatamente su e gi&ugrave; per combinare completamente il DNA con la PCR Master Mix prima di eseguire il programma PCR descritto nel protocollo testuale. Dopo aver verificato il rendimento della libreria e aver incubato i campioni con le perle di purificazione magnetiche secondo il protocollo testuale, aggiungere 30 microlitri di EBT in ogni pozzetto contenente perle lavate. Pipettare su e gi&ugrave; alcune volte per assicurarsi che le perle si stacchino dalle pareti del tubo.Dopo aver incubato la piastra con agitazione e successivamente senza agitazione, posizionare la piastra sul supporto magnetico e trasferire 20 microlitri del soprannatante in una nuova piastra denominata Piastra di Normalizzazione della Libreria, o LNP. Dopo aver preparato il mix di normalizzazione, aggiungere 45 microlitri a ciascun campione della LNP, mescolando il tutto con inversioni intermittenti e vortexaggio della soluzione. Successivamente, sigillare la piastra con un film adesivo trasparente e agitare a 1.800 giri al minuto per 30 minuti.Dopo aver lavato le perle, rimuovere la piastra con le perle dal supporto magnetico e, per eluire il campione, aggiungere 30 microlitri di idrossido di sodio 0,1 N fresco in ciascun pozzetto. Quindi, agitare la piastra con le perle a 1.800 giri al minuto per cinque minuti. Riposizionare la piastra con le perle sul supporto magnetico e, una volta chiarito il soprannatante, trasferire 30 microlitri dell'eluato nel Buffer di Stoccaggio per la Normalizzazione delle Librerie 1 precedentemente preparato nella Piastra di Stoccaggio.Piegare la piastra, quindi aggiungere cinque microlitri di ogni campione da sequenziare a un tubo PAL (Pooled Amplicon Library) da 1,5 millilitri etichettato. A seconda della chimica di sequenziamento utilizzata, aggiungere da quattro a dieci microlitri di PAL a da 590 a 596 microlitri di Buffer HT1. Pulire e caricare la Flow Cell.Caricare i reagenti. Quindi, seguire le indicazioni a schermo per avviare il sequenziamento. Al termine del sequenziamento, eseguire la pipeline di bioinformatica.Analizzare le statistiche della corsa per assicurarsi che la libreria sequenziata abbia superato i parametri di controllo qualità stabiliti dal laboratorio. Infine, in un Visualizzatore di Dati Genomici, esaminare manualmente ogni variante visualizzando i file BAM. Questo è un riepilogo delle statistiche di corsa più importanti, esclusa la copertura media, utilizzate per determinare se un campione di preparazione della libreria ha superato il controllo qualità. Come mostrato qui per il Caso Uno, la Bioinformatica ha rilevato quattro mutazioni associate alla LMA segnalabili.Una mutazione missenso in FLT3, una mutazione puntiforme missenso in IDH2 e una mutazione frameshift in NPM1. Le mutazioni in FLT3 si osservano nel circa 25% dei pazienti adulti con AML. Il significato prognostico delle mutazioni puntiformi nel dominio chinasi di FLT3, come quelle riscontrate in questo paziente con AML, ha un impatto prognostico non chiaro.Isocitrato deidrogenasi 2, o IDH2, codifica un modificatore epigenetico che è comunemente mutato nella LMA. Le mutazioni nel gene della nucleofosmina, o NPM1, sono tra le mutazioni acquisite più frequenti nella LMA. Questa tabella elenca tutte le varianti esoniche per il Caso Due.Sono state rilevate due mutazioni associate a malattie. Un'inserzione in frame nell'esone 20 di ERBB2 e una mutazione missenso in TP53. HER2/neu, o ERBB2, codifica un recettore tirosina chinasi.Le inserzioni attivanti nell'esone 20 di HER2/neu si osservano nel due-quattro percento dei carcinomi polmonari a cellule adenocinomatose e rappresentano la maggior parte delle mutazioni di HER2/neu osservate nel cancro del polmone. Anche le alterazioni di TP53 sono comuni nel cancro. È necessario prestare particolare attenzione alla qualità e alla quantità di DNA estratto.Questo è particolarmente importante per i campioni FFPE, che spesso sono fortemente degradati e presentano una resa di DNA variabile. Durante il processo di validazione del test clinico, è necessario stabilire delle metriche per la qualità e la quantità del DNA per ciascun campione prima di procedere alla preparazione della libreria di DNA.Oltre alla preparazione della libreria, è fondamentale convalidare un Piano Bioinformatico Spy, determinando i valori soglia per il run di sequenziamento, le statistiche di controllo qualità, le statistiche di preparazione della libreria, la profondità di copertura di un Amplicon e la frequenza minima dell'allele riportabile. Una volta acquisita padronanza, la preparazione della libreria può essere completata in una giornata lavorativa. Tuttavia, l'intero flusso di lavoro del saggio richiede più tempo per l'estrazione del DNA, il sequenziamento, l'elaborazione dei dati e la revisione delle varianti.Questa procedura è stata progettata per analizzare esclusivamente le mutazioni del DNA genomico in determinati punti critici chiave. Altri esami che utilizzano l'RNA possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come l'espressione differenziale dei geni, l'associazione al rischio di tumori e i riarrangiamenti strutturali. Sono in arrivo notevoli progressi.L'adozione dell'automazione e l'integrazione di una barcodifica molecolare unica permetteranno ai laboratori di ridurre i tempi di analisi, utilizzare quantità minori di campione e rilevare varianti con una frequenza allelica molto bassa. Il rilevamento di mutazioni associate a malattie in campioni tumorali è da decenni parte della pratica clinica standard. Il sequenziamento di nuova generazione (NGS) rappresenta un approccio meno soggetto a bias per il sequenziamento parallelo di numerosi geni associati a molteplici tipi di cancro, consentendo l'identificazione di diverse mutazioni e terapie più efficaci per i pazienti.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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