Rilevamento somatici genetiche Alterazioni in campioni tumorali da Exon Capture e Sequencing Massively Parallel

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare le mutazioni somatiche nei geni associati al cancro di cellule di tessuto tumorale utilizzando librerie di DNA multiplex con codice a barre, seguite da un sequenziamento massivo parallelo. Ciò si ottiene legando prima gli adattatori di sequenziamento con codice a barre ai frammenti di DNA isolati da tumori conservati. La seconda fase della procedura è l'ibridazione con oligonucleotidi biotinilati personalizzati, complementari a tutti gli esoni di rivestimento proteico di 279 oncogeni e geni oncosoppressori.

Il terzo passaggio consiste nell'eseguire il sequenziamento parallelo massivo dei pool di codici a barre dalle librerie acquisite. Il passo finale consiste nel cercare i dati di sequenza per le alterazioni associate al cancro per i 279 geni bersaglio. Questa procedura può rivelare mutazioni di sequenza, piccole inserzioni, piccole delezioni, alterazioni del numero di copie e alterazioni strutturali selezionate.

Quindi i principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti sono che consente di studiare interi esoni sia per le mutazioni comuni che per quelle rare, nonché di identificare ulteriori alterazioni genomiche come perdite e guadagni di numero di copie e ottenere una maggiore sensibilità in campioni eterogenei. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della genomica del cancro, ad esempio quali sono le mutazioni chiave nei vari tipi di cancro e queste mutazioni nei campioni clinici sono correlate con gli esiti o la risposta alle terapie mirate? Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi e al trattamento del cancro perché le mutazioni possono essere identificate in modo prospettico ed essere utilizzate per aiutare a guidare i pazienti verso terapie e studi clinici appropriati.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto una fase di pulizia delle api è difficile da imparare a causa di una tecnica di cautela necessaria durante il lavaggio e l'elusione del DNA dalle perle Preparare il master mix di riparazione finale. Mescolare i volumi appropriati per ottenere 50 microlitri per campione. Aliquotare i 50 microlitri di ogni DNA puro in pozzetti separati di una piastra a sei pozzetti ID.

Quindi aggiungere 50 microlitri della miscela master di riparazione finale preparata a ciascuna reazione e incubare la piastra in un termociclatore per 30 minuti a 20 gradi Celsius per ripulire la reazione. Innanzitutto, aggiungere 200 microlitri di perle AMP pure XP a ciascun campione e pipettare delicatamente l'intero volume su e giù per 10 volte utilizzando un pipettatore multicanale. Successivamente incubando la piastra a temperatura ambiente per 15 minuti.

Quindi, sposta le piastre sul supporto magnetico e lasciale lisciare per 15 minuti a temperatura ambiente. Una volta eliminato, rimuovere delicatamente e scartare la maggior parte del surnatante facendo attenzione a non disturbare le perline. Un po' di liquido può rimanere nei pozzetti.

Quindi aggiungere delicatamente 200 microlitri di etanolo all'80% appena preparato a ciascun campione e incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 secondi. Pipettare con cura l'etanolo e ripetere il lavaggio ancora una volta. Quindi, lascia asciugare il piatto a temperatura ambiente fino a quando tutto l'alcol non fuoriesce.

Ora risospendere le perle essiccate in 44,5 microlitri di acqua sterile. Far scorrere delicatamente ogni campione attraverso la pipetta 10 volte con l'ultima espulsione. Sciacquare le perline attaccate al lato del pozzo.

Ora incubare le perle sospese in acqua a temperatura ambiente per due minuti, quindi spostarle sul supporto magnetico per cinque minuti fino a quando i pozzetti non sono limpidi. Infine, trasferire delicatamente 42 microlitri del surnatante limpido in ciascun pozzetto, che contiene il campione, in un nuovo pozzetto. I campioni possono ora essere conservati a meno 20 gradi Celsius per un massimo di una settimana.

Iniziare preparando la miscela master di coda D in una provetta sterile per microcentrifuga. Aggiungere otto microlitri della miscela master di coda DA preparata a ciascun pozzetto di DNA riparato all'estremità. Quindi incubare la piastra in un termociclatore per 30 minuti a 37 gradi Celsius per ripulire la reazione.

Utilizzare lo stesso processo descritto nella sezione precedente al doppio del volume e terminare con Resus sospendendo le perle in 33,75 microlitri di acqua sterile. A questo punto, i campioni possono essere conservati a meno 20 gradi Celsius per un massimo di una settimana. Per continuare, preparare una miscela master di legatura per 15 microlitri per reazione.

Aggiungere 15 microlitri della miscela master di legatura a ciascun pozzetto contenente il DNA della coda D. Quindi, aggiungere 1,25 microlitri dei 25 micromolari appropriati. Adattatore con codice a barre flessibile successivo.

Per ciascuno, beh, ogni campione dovrebbe ricevere un adattatore con codice a barre separato. Una volta caricati gli adattatori, incubare la piastra per 15 minuti a 20 gradi Celsius. Ora utilizzando 50 microlitri di perline, eseguire una pulizia di legatura post adattatore e risospendere il campione in acqua sterile a 50 microlitri.

Quindi eseguire il processo di pulizia una seconda volta, terminando con 23 microlitri di acqua. A questo punto, i campioni possono essere conservati a meno 20 gradi Celsius per un massimo di una settimana. Il passo successivo è quello di amplificare ogni campione della libreria, che è dettagliato nel protocollo di testo sullo scioglimento del ghiaccio, i bloccanti degli oligonucleotidi universali e indice, la libreria CCAP easy e i componenti di cattura della gen agile, che includono il tampone di ibridazione con TNA two X e il componente di ibridazione.

A.Preparare ora un pool di un millimolare di bloccanti di oligonucleotidi indice corrispondenti alle specifiche sequenze di adattatori con codice a barre utilizzate nella preparazione della libreria. Unire un microlitro di ciascun bloccante e farli vorticare insieme per 10 secondi In un nuovo tubo da 1,5 millilitri, preparare la miscela di cattura composta da cinque microlitri di conte A a un milligrammo per millilitro, due microlitri di bloccante universale e due microlitri della pool di bloccanti. Riunisci 24 librerie con codice a barre in un'unica reazione.

Aggiungi un totale da uno a tre microgrammi di libreria di sequenze con codice a barre raggruppate al mix di acquisizione. Praticare da 15 a 20 fori nel tappo utilizzando un ago a velocità di 20 gauge o inferiore, aspirare la miscela in un concentratore sottovuoto A DNA a 60 gradi Celsius fino a quando non è completamente asciutta. Quindi, reidratare la miscela nel tampone di ibridazione e nel componente di ibridazione A.Coprire i fori nel tappo con nastro adesivo e agitare il campione per 10 secondi.

Quindi centrifugare il composto alla massima velocità per 10 secondi. Ora, incubare brevemente la miscela a 95 gradi Celsius per denaturare il DNA. Seguire con 10 secondi di centrifugazione alla massima velocità a temperatura ambiente in una provetta PCR da 0,2 millilitri, mescolare 2,25 microlitri di sonde CCAP Easy Library Capture allo stesso volume di acqua sterile priva di nucleasi.

Quindi, durante la reazione della centrifuga, miscelare nella provetta e far fluire delicatamente il volume totale attraverso la punta di una pipetta per 10 volte. Ora incubare la provetta da 0,2 millilitri in un termociclatore a 47 gradi Celsius per 48-96 ore. Mantenere la temperatura del coperchio del termociclatore a 57 gradi Celsius per prevenire l'evaporazione e stabilizzare la temperatura di reazione giorni dopo.

Utilizzare i passaggi per il lavaggio e il recupero del DNA catturato. Quindi utilizzare un protocollo Roche nimble gen modificato per amplificare la finitura del DNA catturato quantificando il DNA catturato amplificato utilizzando il saggio ad alta sensibilità del qubit. Un pool di 24 librerie di sequenze con codice a barre che contenevano 12 coppie normali tumorali è stato catturato utilizzando sonde di 279 geni tumorali e sequenziato in due per 75.

Le letture di coppie di basi su una singola corsia di un tumore a cellule di flusso HighSeq 2000 e le librerie normali sono state raggruppate in un rapporto di due a uno. L'immagine IGV mostra la specificità della copertura della sequenza agli esoni dell'EGFR in un cancro del polmone, le barre grigie rappresentano letture di sequenza uniche. La mutazione eterozigote T 2 G a destra era presente nel 24% delle read, indicando che si tratta di una sostituzione somatica dell'amminoacido L 8 58 R.

Nessuna delle letture del tessuto polmonare normale ha mostrato questa mutazione TTA G, alcune indels in un tumore del cancro del colon-retto, una coppia normale ha mostrato un'inserzione di frameshift somatico in un PC o una delezione frameshift somatica di sette coppie di basi. Nel TP 53, sono state osservate anche alterazioni del numero di copie tra le coppie normali del tumore. Ogni punto dati rappresenta un singolo esone da 279 geni bersaglio.

I guadagni e le perdite del numero di copie sono dedotti dall'aumento e dalla diminuzione della sequenza tumorale Copertura Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in sei ore e mezza per la condivisione della preparazione della libreria e da 48 a 96 ore per l'ibridazione a cattura, se eseguita correttamente. Durante l'esecuzione di questo test è estremamente importante prestare attenzione ai contaminanti durante la preparazione della libreria, in quanto potrebbe confondere l'analisi dei dati Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il sequenziamento Sanger e l'analisi dei frammenti per rispondere a domande come: come posso convalidare un'alterazione discutibile? Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare le librerie di DNA con codice a barre ed eseguire l'acquisizione Exxon su queste librerie in pool.