Name: Rilevamento somatici genetiche Alterazioni in campioni tumorali da Exon Capture e Sequencing Massively Parallel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-18T19:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Scopri come rilevare mutazioni somatiche in campioni tumorali mediante cattura di esoni e sequenziamento massivamente parallelo. Questo metodo consente l'analisi di 279 geni oncogeni con elevata sensibilità per la medicina personalizzata.

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Ringraziamo il Dott. Agnes Viale e il MSKCC Genomica Nucleo Laboratorio per l&#39;assistenza tecnica. Questo protocollo è stato sviluppato con il sostegno della Geoffrey Beene Cancer Research Center e dalla Fondazione Farmer famiglia.

1. DNA e Preparazione dei reagenti Nota: Questo protocollo descrive l&#39;elaborazione simultanea e l&#39;analisi di 24 campioni (ad esempio 12 / coppie tumorali normali) ma può essere adattato per lotti piccoli e più grandi. Campioni di DNA possono derivare da FFPE o tessuto fresco congelato, campioni citologici, o di sangue. Tipicamente, entrambi tumore e tessuto normale dello stesso paziente sarà profilata insieme per distinguere mutazioni somatiche da polimorfismi ereditati. Il protocollo inizia immediatamente dopo l&#39;estrazione del DNA. <ol><li> Aliquota 50-250 ng (250 ng consigliato) di DNA estratto per campione, diluito in 1x Tris-EDTA (pH 8.0) tampone ad un volume finale di 50 ml, in provette a fondo sferico separati Covaris. </li><li> Tosare il DNA sullo strumento Covaris E220 presso le seguenti impostazioni di taglio: 360 sec a 10 duty factor, 175 PIP, e 200 cicli per scoppiare. </li><li> Scongelare AMPure Beads XP (Tabella 2) a temperatura ambiente. Scongelare tutti i buffers ed enzimi sul ghiaccio prima del passaggio appropriato. </li></ol> 2. End Module Repair - Preparazione Biblioteca <ol><li> Preparare la master mix riparazione end in una provetta sterile utilizzando i seguenti volumi per campione: 10 ml di 10x NEBNext End Repair Reaction Buffer (Tabella 2), 5 ml NEBNext End Repair Enzyme Mix (Tabella 2), 35 microlitri di nucleasi sterile libero H 2 O. </li><li> Aliquotare i 50 pl di ciascun DNA tosata in pozzetti separati di una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 50 ml di riparazione parte master mix pronti a ogni reazione. Incubare in un termociclatore per 30 min a 20 ° C. </li></ol> 3. Messaggio di fine Repair Clean-up <ol><li> Aggiungere il volume 2x (200 ml) di AMPure Beads XP (Tabella 2) per ogni campione e pipettare delicatamente l&#39;intero volume su e giù per 10 volte con una pipetta multicanale. Incubare a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Posizionare sul supporto magnetico (Tabella 2 </strong&gt;) a temperatura ambiente per 15 minuti fino a quando appare il campione chiaro. </li><li> Rimuovere delicatamente e scartare chiara presa surnatante attenzione a non disturbare perline. Alcuni liquido può rimanere in pozzi. </li><li> Con tubi sul cavalletto, aggiungere lentamente 200 ml di preparato fresco 80% di etanolo per ogni campione e incubare piastra a temperatura ambiente per 30 sec. Con cautela, rimuovere l&#39;etanolo mediante pipetta. </li><li> Ripetere il passaggio 5, per un totale di 2 lavaggi etanolo. Assicurarsi che tutto l&#39;etanolo è stato rimosso. Togliere dal supporto magnetico e lasciare asciugare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Risospendere perle secchi con 44,5 ml sterile H 2 O. Delicatamente, pipetta intero volume su e giù per 10 volte mescolando accuratamente. Assicurare perle sono più attaccati al lato del bene. </li><li> Incubare microsfere in sospensione a temperatura ambiente per 2 min. Posto su supporto magnetico per 5 minuti fino a quando appare il campione chiaro. </li><li> Delicatamente trasferire 42 ml di surnatante trasparente contenente il campione di un nuovo pozzo. La procedura può essere tranquillamente fermato a questo step e campioni conservati a -20 ° C per 7 giorni. Per riavviare, scongelare i campioni congelati in ghiaccio prima di procedere. </li></ol> 4. Preparazione Biblioteca - Modulo dA-tailing <ol><li> Preparare la master mix dA-tailing in una provetta sterile utilizzando i seguenti volumi per campione: 5 microlitri di 10x NEBNext reazione dA-tailing Buffer (Tabella 2), 3 ml (3&#39;-5 &#39;exo-) Klenow Fragment (Tabella 2 ). </li><li> Aggiungere 8 ml di preparato master mix dA-tailing in ciascun pozzetto contenente 42 ml di DNA di fine riparato. Incubare in un termociclatore per 30 min a 37 ° C. </li><li> Eseguire un post dA-tailing clean-up: Ripetere i passaggi 3,1-3,8 utilizzando il volume 2x (100 ml) di perline, ma risospendere in H 2 O sterile per un volume finale di 33,75 ml. La procedura può essere tranquillamente fermato a questo punto e campioni conservati a -20 ° C per 7 giorni. Per riavviare, scongelare i campioni congelati in ghiaccio prima di procedere. &lt;/ Li&gt; </ol> 5. Preparazione Biblioteca - Adattatore legatura Module <ol><li> Preparare la master mix legatura in una provetta sterile utilizzando i seguenti volumi per campione: 10 ml di 5x NEBNext rapida Ligation Reaction Buffer (New England Biolabs, Tabella 2), 5 ml rapida T4 DNA ligasi (Tabella 2). </li><li> Aggiungere 15 ml di master mix legatura in ciascun pozzetto contenente il DNA dA-code. </li><li> Aggiungere 1,25 ml di 25 mM appropriato NEXTflex adattatore di codice a barre (Tabella 2) a ciascun pozzetto. Ogni campione deve ricevere una scheda con codice a barre separato. Incubare in un termociclatore per 15 min a 20 ° C. </li><li> Eseguire un adattatore di post legatura clean-up: Ripetere i passaggi 3,1-3,8 utilizzando il volume 1x (50 ml) di perline, ma risospendere in H 2 O sterile fino ad un volume finale di 50 microlitri. </li><li> Ripetere i passaggi 3,1-3,8 per un secondo volume 1x (50 pl) clean-up, ma risospendere in sterile H 2 O ad unvolume finale di 23 microlitri. La procedura può essere tranquillamente fermato a questo punto e campioni conservati a -20 ° C per 7 giorni. Per riavviare, scongelare i campioni congelati in ghiaccio prima di procedere. </li></ol> 6. Amplificazione Biblioteca <ol><li> Preparare la master mix KAPA HiFi in una provetta sterile utilizzando i seguenti volumi per campione: 25 microlitri 2x KAPA HiFi HS RM (Tabella 2), 1 ml ciascuno di 100 micron Primer Primer 1 e 2 (Tabella 3). </li><li> Aggiungere 27 microlitri della master mix in ciascun pozzetto contenente il prodotto di ligazione. Impostare pipetta a 50 microlitri e delicatamente pipetta l&#39;intero volume su e giù 10x. </li><li> Collocare nel termociclatore per i seguenti cicli di PCR: denaturazione iniziale di 45 sec a 98 ° C, 10 cicli di 15 secondi a 98 ° C, 30 sec a 60 ° C, 30 sec a 72 ° C, e l&#39;estensione finale di 1 min a 72 ° C. </li><li> Eseguire un post di amplificazione clean-up: Ripetere i passaggi 3,1-3,8 usandoVolume 1x (50 ml) di AMPure Beads XP, e risospendere in acqua sterile fino ad un volume finale di 30 microlitri. </li><li> Quantificare la concentrazione di ciascuna libreria utilizzando Qubit Ampia gamma Assay (Life Technologies, tabella 2) secondo le istruzioni del produttore. </li></ol> 7. Roche Nimblegen SeqCap EZ Biblioteca ibridazione, lavaggio, e Amplificazione <ol><li> Scongelare bloccanti oligonucleotidi universali e indice (Tabella 3), SeqCap EZ Biblioteca, e componenti di acquisizione NimbleGen (COT DNA, tampone di ibridazione 2x, e l&#39;ibridazione dei componenti A, Tabella 2) su ghiaccio. Tutti i bloccanti oligonucleotidi sono memorizzati in azioni di lavoro di 1 mm. Il nostro SeqCap EZ Library è un pool di custom-designed di sonde di cattura che comprende tutti gli esoni codificanti proteine ​​di 279 geni del cancro-associata, anche se possono essere utilizzati altri disegni personalizzati e catalogo. </li><li> Preparare un pool di 1 mm bloccanti indice di oligonucleotidi corrispondenti all&#39;annuncio codice a barre specificosequenze aptor utilizzati nella preparazione biblioteca. Combina 1 ml di ogni blocker, e vortex. </li><li> In un nuovo sterile da 1,5 ml provetta, aggiungere 5 ml di 1mg/ml COT DNA, 2 ml di 1 mm bloccante universale e 2 microlitri della piscina 1 mm bloccanti indice di oligonucleotidi. </li><li> Pool 24 biblioteche codice a barre in una singola reazione. Aggiungere un totale di 1-3 mg di pool, biblioteca sequenza di codice a barre (preparato in precedenza) alla miscela di cattura. Per 24 campioni, si raccomanda 100 ng per campione. Quando il pool tumori e campioni normali abbinati, si consiglia l&#39;aggiunta più biblioteca tumore (ad esempio 100 ng per tumore e 50 ng per normale) in modo che essi sono in sequenza ad una maggiore profondità di copertura. </li><li> Chiudere tappo della valvola e fare 15-20 fori nella parte superiore del cappuccio con un 18-20 G o più piccolo. Velocità Vac il campione biblioteca / COT DNA / oligo amplificati in un vuoto concentratore DNA in alto calore (60 ° C). </li><li> Una volta completamente asciutta giù, reidratare con 7,5 ml di 2x hybriditampone zazione e 3 ml di ibridazione componente A. Il tubo dovrebbe contenere le seguenti: 5 mg COT DNA, ug variabile biblioteca campione amplificato, 1000 pmol di Universal e Index Oligos, buffer di 7,5 microlitri 2x ibridazione, 3 componente microlitri di ibridazione A in un volume totale di 10,5 microlitri. </li><li> Coprire i fori del tappo con un piccolo pezzo di nastro laboratorio. Vortex il campione per 10 secondi e centrifugare alla massima velocità per 10 sec. </li><li> Incubare il campione a 95 ° C per 10 minuti per denaturare il DNA, seguita da centrifugazione a velocità massima per 10 secondi a temperatura ambiente. </li><li> In un nuovo 0.2 ml PCR tubo striscia, preparare 2,25 ml aliquota di SeqCap EZ sonde di cattura Biblioteca e 2,25 ml di sterile nucleasi libera H 2 O e aggiungere il contenuto di passo 7.7. Pipettare delicatamente l&#39;intero volume su e giù 10x. </li><li> Incubare in un termociclatore a 47 ° C per 48-96 ore. Impostare e mantenere la temperatura coperchio del termociclatore a 57 ° C. </li><li> Folbassi passaggi nel capitolo 6 della Guida dell&#39;utente SR NimbleGen SeqCap EX Biblioteca v3.0 (Tabella 2) per il lavaggio e recupero del DNA catturato. </li><li> Segue passaggi nel capitolo 7 del protocollo Roche NimbleGen per l&#39;amplificazione del DNA catturato con le seguenti modifiche: <ul type="disc"><li> Utilizzare 2x KAPA HiFi polimerasi (tabella 2) anziché Phusion-High Fidelity PCR Master Mix </li><li> Utilizzare 100 micron Primer 1 e 2 Primer elencati nella Tabella 3. </li><li> Eseguire le seguenti condizioni di PCR: denaturazione iniziale a 98 ° C per 30 sec, 11 cicli di 98 ° C per 10 sec, 60 ° C per 30 sec, 72 ° C per 30 sec, e di estensione finale a 72 ° C per 5 min . Tenere a 4 ° C. </li></ul></li><li> Quantificare la concentrazione del DNA catturato amplificato utilizzando Qubit alta sensibilità del test (Tabella 2) secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Analizzare la qualità del DNA catturato utilizzando Agilent BioChip analizzatore di DNA HS (Tabella 2) secondo le istruzioni del produttore. <ul type="disc"><li> La resa PCR deve essere almeno 100 ng (range 100-1.000 ng). </li><li> La lunghezza media frammento deve essere compresa tra 150-400 coppie di basi. </li></ul></li></ol> 8. Illumina Hi-Seq Sequencing <ol><li> Diluire il DNA catturato amplificato a 2:00, e caricare il campione su una sola corsia di una cella di flusso Illumina HiSeq 2000. Sequenza accoppiato-end coppia di 75 di base legge secondo le istruzioni del produttore. Nella nostra esperienza, una corsia è sufficiente a produrre una copertura sequenza unica 500-700x per esempio tra 279 geni per un pool di 24 campioni. </li><li> Software Illumina (Real Time Analysis) ti permette di convertire immagini ad alta risoluzione per intensità di cluster di basare le chiamate e punteggi di qualità. Utilizzare Casava per demultiplex dati in base all&#39;identità di codici a barre e generare file FASTQ individuali per ogni campione. </li></ol> 9. Dati Anallisi <ol><li> Sequenze adattatore Trim dalla fine del 3 &#39;della sequenza di legge nei file FASTQ utilizzando Cutadapt ( <a href="http://code.google.com/p/cutadapt/">http://code.google.com/p/cutadapt/</a> ). La lunghezza minima di sovrapposizione (-O) è 3 con un tasso di errore (-e) del 1%. La lunghezza minima di base per il mantenimento di Gemellaggio legge dopo il taglio è di 25. </li><li> Allineare sequenza di legge alle hg19 genoma umano di riferimento utilizzando lo strumento Burrows-Wheeler Aligner (BWA) 12. Eseguire le operazioni di post-processing, tra cui la marcatura duplicato, sequenza locale riallineamento multipla, e la qualità di base il punteggio ricalibrazione usando l&#39;analisi del genoma Toolkit (GATK) secondo le migliori prassi standard ( <a href="http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic?name=best-practices">http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic? name = best practice</a> ) 13. Quando profilatura più campioni dello stesso paziente (es. tumore accoppiati e normali), sequenza locale riallineamento multipla dovrebbe essere prestazioniMED congiuntamente. L&#39;output di questi passaggi di post-processing è un file BAM separato per ogni campione, che contiene tutte le sequenze, la qualità e le informazioni di allineamento e può essere caricato direttamente nella Integrative Genomics Viewer (IGV) per la visualizzazione di letture e di varianti di sequenza 14. </li><li> Calcola metriche di performance sequenza utilizzando strumenti Picard ( <a href="http://picard.sourceforge.net/">http://picard.sourceforge.net/</a> ). Metriche informativi includono tasso di allineamento, distribuzione dimensione del frammento, GC-content pregiudizi di copertura associato, on-target capture specificità, PCR duplicare frequenza, complessità biblioteca e media copertura del bersaglio. Valori rappresentativi sono indicati in Figura 1. Frequenze alleliche nei siti comune polimorfismo calcolati utilizzando DepthOfCoverage da GATK vengono utilizzati per monitorare la contaminazione da DNA estranei e per garantire che i campioni abbinati provenivano dagli stessi pazienti. I seguenti analisi computazionali dipendono dalla presenza di abbinatocampioni tumorali e normali per la rilevazione di alterazioni genetiche somatiche. I tumori senza precedenti possono anche essere analizzati utilizzando un campione di controllo normale separato, ma mutazioni più somatiche non possono essere facilmente distinti da varianti di sequenza ereditate. </li><li> Chiamare varianti somatiche singolo nucleotide (SNVs) per ogni coppia tumore-normale usando un chiamante mutazione somatica, come muTect 15, SomaticSniper 16, o Strelka 17. Usiamo muTect con criteri di filtro modificati, consentendo varianti con bassa (non zero) conta allele nel campione normale purché la frequenza allele è almeno 5 volte maggiore nel tumore. Varianti ricorrentemente chiamato in un pannello di DNA normali vengono rimossi come probabili manufatti sistematiche di sequenziamento o l&#39;allineamento. Ogni SNV passando filtri viene poi accuratamente esaminato utilizzando IGV. </li><li> Chiama indels somatiche per ogni coppia di tumore normale utilizzando algoritmi come SomaticIndelDetector 13, Dindel 18, o SOAPindel 19 </sup&gt;. Usiamo SomaticIndelDetector con i seguenti criteri: almeno il 10% allele frequenza con almeno 3 sostenere legge, o almeno il 2% allele frequenza con almeno 10 sostegno letture. Permessi per indels con basso (non zero) conta allele nel campione normale purché la frequenza allele è almeno 5 volte maggiore nel tumore. Indels chiamati in un pannello di DNA normali vengono rimossi, come sopra. Ogni Indel passando filtri viene poi accuratamente esaminato utilizzando IGV. </li><li> Estrapolare copia dello stato numero dalla copertura sequenza in esoni bersaglio. Per ogni singolo campione, eseguire una normalizzazione Loess di copertura sequenza media per tutti gli esoni bersaglio, regressione sopra percentuale GC. Regolare i valori di copertura normalizzate sottraendo la misura Loess e aggiungendo la copertura mediana a livello di campione. Calcolare il rapporto di copertura in sequenza normalizzata in tutti gli esoni bersaglio per le coppie tumore normale. In assenza di un campione normale accoppiati e / o per diminuire il rumore, altri diploide per sessopossono essere utilizzati normali controlli che mancano varianti del numero di copie germinali. Determinare somatici utili e le perdite di numero di copia basato su aumenti o diminuzioni del rapporto di copertura. </li><li> Chiamare riarrangiamenti somatici tra geni tumorali in cui almeno un punto di interruzione genomico cade all&#39;interno o vicino a un intervallo mirato del genoma. Algoritmi suggeriti includono GASV 20, Breakdancer 21, CREST 22, e Dranger 23. Intrachromosomal inversioni, delezioni e duplicazioni tandem possono essere distinti in base alla posizione relativa e l&#39;orientamento di sostenere legge in coppie discordanti. Tutti i riarrangiamenti candidati dovrebbero essere rivisti manualmente con IGV. Si consiglia di validazione sperimentale mediante PCR e sequenziamento Sanger di tutti i punti di interruzione riarrangiamento putativi. </li></ol>

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<li>Drier, Y., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+rearrangements+across+cancer+reveal+classes+of+samples+with+distinct+patterns+of+DNA+breakage+and+rearrangement-induced+hypermutability%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Somatic rearrangements across cancer reveal classes of samples with distinct patterns of DNA breakage and rearrangement-induced hypermutability.</a> Genome Res. 23 (2), 228-235 (2012).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Roychowdhury, S., Iyer, M. K., Robinson, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+oncology+through+integrative+high-throughput+sequencing%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Personalized oncology through integrative high-throughput sequencing: a pilot study.</a> Sci. Transl. Med. 3 (111), 111ra121 (2011).</li>
<li>Kerick, M., Isau, M., Timmermann, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+high+throughput+sequencing+in+clinical+cancer+settings%3A+formaldehyde+fixed-paraffin+embedded+%28FFPE%29+tumor+tissues%2C+input+amount+and+tumor+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Targeted high throughput sequencing in clinical cancer settings: formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues, input amount and tumor heterogeneity.</a> BMC Med. Genomics. 4, 68(2011).</li>
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Il dottor Berger ha ricevuto compensi per consulenze e finanziamenti per la ricerca da Medicine Foundation, una società di diagnostica del cancro.

Il nostro test IMPACT produce un alto tasso di allineamento, alto tasso on-target, elevata copertura di destinazione, e ad alta sensibilità per le mutazioni rilevamento, indels, e numero di esemplari alterazioni. Abbiamo dimostrato la capacità del nostro test IMPACT alla sequenza di DNA sia fresco congelato e archiviato campioni FFPE di ingresso DNA bassa. Eseguendo mirata esone sequenziamento dei geni del cancro-associata chiave, si può ottenere una copertura sequenza molto profondo per gli esoni di questi geni più cri...

L&#39;identificazione di &quot;driver&quot; tumorali eventi genetici in oncogeni chiave e geni oncosoppressori gioca un ruolo essenziale nella diagnosi e nel trattamento di molti tumori 1. Attività di ricerca su larga scala che utilizzano massicciamente parallelo sequenziamento &quot;next-generation&quot; hanno permesso l&#39;identificazione di molti di questi geni del cancro-associata negli ultimi anni 2. Tuttavia, queste piattaforme di sequenziamento in genere richiedono grandi quantità di DNA isolate da tessuti freschi congelati, ponendo così una limitazione importante nella caratterizzazione e l&#39;analisi di mutazioni del DNA dai tessuti conservati, come la paraffina fissato in formalina incorporato (FFPE) campioni tumorali. Miglioramento sforzi per caratterizzare in modo efficiente e affidabile informazioni genomiche &quot;fruibili&quot; da campioni tumorali FFPE consentiranno l&#39;analisi retrospettiva di campioni precedentemente sopraelevate e ulteriormente incoraggiare approcci individualizzati alla gestione del cancro. Tradizionalmente, d molecolarelaboratori iagnostic hanno fatto affidamento su termini di tempo, metodologie a basso rendimento come il sequenziamento Sanger e real-time PCR per la mutazione del DNA profiling. Più di recente, i metodi più elevato throughput utilizzando PCR multiplex o spettrometria di massa genotipizzazione sono stati sviluppati per studiare le mutazioni somatiche ricorrenti nei geni chiave del cancro 3-5. Questi approcci, tuttavia, sono limitati dal fatto che solo &quot;hotspot&quot; mutazioni predesignated vengono dosati, che li rende inadatti per la rilevazione delle mutazioni inattivanti nei geni oncosoppressori. Sequenziamento massivamente parallelo offre diversi vantaggi rispetto a queste strategie, tra cui la possibilità di interrogare interi esoni per le mutazioni sia comuni che rare, la capacità di rivelare ulteriori classi di alterazioni genomiche quali utili e perdite del numero di copie, e una maggiore sensibilità di rilevazione in campioni eterogenei 6, 7 . Intero sequenziamento del genoma rappresenta l&#39;approccio più completo per la scoperta mutazione, anche se è relativoly costoso e comporta grandi esigenze computazionali per l&#39;analisi e l&#39;archiviazione dei dati. Per le applicazioni cliniche, dove solo una piccola frazione del genoma può essere di interesse clinico, due particolari innovazioni nella tecnologia di sequenziamento sono stati trasformativa. In primo luogo, attraverso la cattura esone basato sull&#39;ibridazione, si può isolare DNA corrispondente ai geni cancro-associate chiave per mirata mutazione profiling 8,. In secondo luogo, attraverso la legatura di codici a barre molecolare (cioè sequenze di DNA 6-8 nucleotidi di lunghezza), si possono riunire centinaia di campioni per analisi di sequenziamento e di sfruttare appieno la crescente capacità degli strumenti di sequenziamento massivamente parallelo 10. Quando combinati, queste innovazioni consentono di tumori ad essere sagomate per i costi più bassi e in un throughput più elevato, con minori requisiti di calcolo 11. Inoltre, ridistribuendo copertura della sequenza soltanto a quei geni più critici per la particolare applicazione, si può Achieve maggiore profondità di sequenziamento per la sensibilità di rilevazione più elevato per gli eventi a bassa frequenza allele. Qui descriviamo il nostro impatto saggio (Integrated Mutazione Profiling di obiettivi Actionable Cancro), che utilizza la cattura esone su piscine Biblioteca sequenza di codici a barre mediante ibridazione con oligonucleotidi personalizzate per catturare tutti gli esoni codificanti proteine ​​e selezionare introni di 279 geni del cancro-associata chiave (Tabella 1 ). Questa strategia consente l&#39;identificazione di mutazioni, indels, numero di copie alterazioni, e seleziona riarrangiamenti strutturali che coinvolgono questi 279 geni. Il nostro metodo è compatibile con il DNA isolato sia fresco tessuto congelato e FFPE nonché aspirati con ago sottile e altri campioni citologici.

<table><tbody><tr><td>NEBNext End Repair Module</td><td>New England Biolabs</td><td>E6050L</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NEBNext dA-Tailing Module</td><td>New England Biolabs</td><td>E6053L</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NEBNext Modulo di legatura rapida</td><td>New England Biolabs</td><td>E6056L</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter Genomica</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Codici a barre NEXTflex senza PCR &ndash; 24</td><td>Bioo Scientific</td><td>514103</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit di amplificazione per librerie HiFi</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2612</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>COT DNA umano, grado fluorimetrico</td><td>Roche Diagnostics</td><td>05 480 647 001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NimbleGen SeqCap EZ Kit di ibridazione e lavaggio</td><td>Roche NimbleGen</td><td>05 634 261 001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SeqCap EZ Libreria Esche</td><td>Roche NimbleGen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit di purificazione per PCR QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit di analisi Qubit dsDNA ad ampio intervallo (BR)</td><td>Life Technologies</td><td>Q32850</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit di test Qubit dsDNA ad alta sensibilità (HS)</td><td>Life Technologies</td><td>Q32851</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit Agilent DNA HS</td><td>Tecnologie Agilent</td><td>5067-4626, 4627</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bioanalizzatore Agilent 2100</td> Tecnologie <td></td><td>Agilent</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Covaris E220</td><td>Covaris</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Supporto Magnetico-96</td><td>Ambion</td><td>AM10027</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Illumina Hi-Seq 2000</td><td>Illumina</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

rilevamento somatici genetiche alterazioni in campioni tumorali da exon capture e sequencing massively parallel

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Gli sforzi per individuare e indagare principali mutazioni oncogene si sono rivelate preziose per facilitare il trattamento appropriato per i pazienti oncologici. L&#39;istituzione di high-throughput, massicciamente parallelo sequenziamento &quot;next-generation&quot; ha favorito la scoperta di molte di queste mutazioni. Per migliorare l&#39;utilità clinica e traslazionale di questa tecnologia, piattaforme devono essere ad alta produttività, conveniente e compatibile con paraffina fissato in formalina incorporato (FFPE) campioni di tessuto che possono produrre piccole quantità di DNA degradato o danneggiato. Qui, descriviamo la preparazione di librerie di DNA barcode e multiplex seguite da base di ibridazione-cattura di esoni mirati per la rilevazione delle mutazioni tumorali associate a tumori freschi congelati e FFPE di sequenziamento massivamente parallelo. Questo metodo consente l&#39;identificazione di mutazioni di sequenza, copia numero di alterazioni, e seleziona riarrangiamenti strutturali che coinvolgono tutti i geni target. Mirato esone sequenziamento offre tegli beneficia di throughput elevato, a basso costo, e la copertura sequenza profondo, conferendo ad alta sensibilità per la rilevazione di mutazioni a bassa frequenza.

Una piscina di 24 biblioteche sequenza codice a barre (12 paia tumore-normale) è stato catturato utilizzando sonde corrispondenti a tutti gli esoni codificanti proteine ​​di 279 geni del cancro e sequenziato da 2 x 75 bp legge su una sola corsia di una cella di flusso HiSeq 2000. Tumore e biblioteche normali sono stati raggruppati in un rapporto 2:1. Metriche di performance Esempio per una piscina di surgelati campioni di DNA del tumore sono mostrati in figura 1, tra cui il tasso di allineamento, distri...

Descriviamo la preparazione di librerie di DNA codici a barre e la successiva base di ibridazione-esone cattura per la rilevazione di mutazioni tumorali associate chiave in campioni tumorali clinici di massively parallel sequencing &quot;prossima generazione&quot;. Mirato esone sequenziamento offre i vantaggi di elevata produttività, basso costo, e la copertura sequenza profondo, ottenendo così elevata sensibilità per la rilevazione delle mutazioni a bassa frequenza.

Rilevamento somatici genetiche Alterazioni in campioni tumorali da Exon Capture e Sequencing Massively Parallel

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare le mutazioni somatiche nei geni associati al cancro di cellule di tessuto tumorale utilizzando librerie di DNA multiplex con codice a barre, seguite da un sequenziamento massivo parallelo. Ciò si ottiene legando prima gli adattatori di sequenziamento con codice a barre ai frammenti di DNA isolati da tumori conservati. La seconda fase della procedura è l'ibridazione con oligonucleotidi biotinilati personalizzati, complementari a tutti gli esoni di rivestimento proteico di 279 oncogeni e geni oncosoppressori.Il terzo passaggio consiste nell'eseguire il sequenziamento parallelo massivo dei pool di codici a barre dalle librerie acquisite. Il passo finale consiste nel cercare i dati di sequenza per le alterazioni associate al cancro per i 279 geni bersaglio. Questa procedura può rivelare mutazioni di sequenza, piccole inserzioni, piccole delezioni, alterazioni del numero di copie e alterazioni strutturali selezionate.Quindi i principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti sono che consente di studiare interi esoni sia per le mutazioni comuni che per quelle rare, nonché di identificare ulteriori alterazioni genom

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Biologia

Questo manoscritto descrive i protocolli clinici per due pannelli di sequenziamento di nuova generazione. Un pannello interroga le neoplasie ematologiche, mentre l'altro pannello prende di mira i geni comunemente mutati nei tumori solidi. La classificazione molecolare delle mutazioni driver nelle neoplasie umane offre preziose informazioni prognostiche e predittive.

Successivo sequenziamento di nuova generazione per il rilevamento di Actionable mutazioni nei tumori solidi e liquidi

Viene descritto un sistema integrato per il sequenziamento mirato di nuova generazione di campioni oncologici. Questo sistema multipiattaforma è ottimizzato per biopsie tumorali di bassa qualità e bassa quantità, accoglie bassi input di DNA, include controlli multivariante ben caratterizzati e presenta un nuovo chiamante di varianti informato da misure quantitative di controllo di qualità pre-analitiche.

Integrazione di Wet and Dry processi banco Ottimizza Targeted sequenziamento di prossima generazione di bassa qualità e di biopsie di tumori a bassa quantità

Questo manoscritto descrive una tecnica per la rilevazione di mutazioni di bassa frequenza in ctDNA, ER-segg. Questo metodo si differenzia per il suo uso unico di correzione degli errori di bi-direzionale, un fondo speciale filtro ed efficiente acquisizione molecolare.

Rilevazione di mutazioni Rare in CtDNA mediante sequenziamento di nuova generazione

L'ottenimento di DNA genomico di alta qualità dai tessuti del tumore è un primo passo essenziale per analizzare le alterazioni genetiche mediante sequenziamento di nuova generazione. In questo articolo, presentiamo un metodo semplice e rapido per arricchire le cellule del tumore e ottenere DNA intatto dal tocco impronta campioni citologici.

Metodo semplice e veloce per ottenere alta qualità tumore del DNA da campioni clinico-patologiche utilizzando Touch Imprint citologia

Qui presentiamo un protocollo per rilevare le mutazioni somatiche tumorali nel DNA circolante presente nei fluidi biologici dei pazienti (biofluidi). Il nostro metodo basato sulla reazione a catena della polimerasi digitale delle goccioline (dPCR) consente la quantificazione della frequenza allelica della mutazione tumorale (MAF), facilitando un complemento minimamente invasivo alla diagnosi e al monitoraggio temporale della risposta tumorale.

Rilevamento e monitoraggio del DNA circolante associato al tumore nei biofluidi dei pazienti

Questo articolo descrive un metodo per identificare le alterazioni clonali e subclonali tra campioni diversi di un determinato paziente. Anche se gli esperimenti qui descritti si concentrano su un tipo di tumore specifico, l'approccio è ampiamente applicabile ad altri tumori solidi.

Analisi comparativa delle lesioni attraverso un approccio di sequenziamento mirato

Questo articolo descrive in dettaglio l'uso di un kit di preparazione della libreria a catena di reazione a catena multiplea Vengono descritte entrambe le fasi di analisi wet-bench e dei dati.

Rilevamento oncogenico della fusione genica utilizzando la reazione della catena di polimerasi multiplex ancorata seguita dal sequenziamento di nuova generazione

Qui presentiamo un protocollo per testare l'efficacia delle terapie mirate selezionate in base alla trucco genomico di un tumore. Il protocollo descrive l'identificazione e la convalida dei riarrangiamenti strutturali del DNA, l'innesto dei tumori dei pazienti nei topi e il test delle risposte ai farmaci corrispondenti.

Test delle terapie mirate nel cancro utilizzando l'analisi dell'alterazione strutturale del DNA e gli Xenogrini derivati dal paziente

L'aumento dei biomarcatori molecolari da testare per la gestione della cura del carcinoma polmonare non squamoso non a piccole cellule (NS-NSCLC) ha spinto lo sviluppo di metodi di rilevamento molecolare rapidi e affidabili. Descriviamo un flusso di lavoro per la valutazione dell'alterazione genomica per i pazienti NS-NSCLC utilizzando un approccio di sequenziamento di nuova generazione (NGS) ultraveloce.

Sequenziamento ultraveloce di nuova generazione basato su ampliconi nel carcinoma polmonare non squamoso non a piccole cellule

Questo protocollo fornisce un metodo riproducibile per visualizzare l'amplificazione genica in campioni di tessuto inclusi in paraffina (FFPE) fissati in formalina.

Rilevamento robusto dell'amplificazione genica in campioni inclusi in paraffina fissati in formalina mediante ibridazione in situ a fluorescenza

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro di sequenziamento di nuova generazione automatizzato e accreditato ISO15189 per rilevare alterazioni genomiche mirabili in tessuti inclusi in paraffina fissati in formalina per carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC).

Rilevamento di alterazioni mirabili nel carcinoma polmonare non a piccole cellule utilizzando il sequenziamento di nuova generazione

Scopri come rilevare mutazioni somatiche in campioni tumorali mediante cattura di esoni e sequenziamento massivamente parallelo. Questo metodo consente l'analisi di 279 geni oncogeni con elevata sensibilità per la medicina personalizzata.

Rilevamento somatici genetiche Alterazioni in campioni tumorali da Exon Capture e Sequencing Massively Parallel

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