Tecnologia di selezione delle cellule tumorali circolanti ad alto rendimento e sequenziamento di singole cellule basata sulla microfluidica

Ci concentriamo sullo sviluppo di metodi di isolamento e analisi CTC ad alte prestazioni per far avanzare l'oncologia di precisione tramite biopsia liquida. Le attuali piattaforme commerciali di isolamento CTC hanno bassa capacità di produzione ed efficienza. Sono inoltre incompatibili con le piattaforme di analisi a valle, il che limita il recupero di informazioni biologiche.

Questo studio utilizza una piattaforma di isolamento CTC microfluidica per migliorare notevolmente i tassi di rilevamento. Applichiamo anche un chip di sequenziamento a cellula singola rara per un'analisi più profonda della biopsia liquida. Per cominciare, una pipetta di 25 microlitri di streptavidina lavata e sosspesa ha modificato le sfere magnetiche in un tubo contenente un microgrammo di anticorpo EpCAM biotinilato.

Incubare la miscela a temperatura ambiente ruotando a 20 giri al minuto per 40 minuti per preparare le sfere immunomagnetiche. Utilizzando una griglia magnetica, separare le perline dal surnadante. Dopo aver rimosso il sovrantante, risospendere le perline in 25 microlitri di tampone di isolamento.

Pipetta 20 microlitri della sospensione a sfera magnetica entro uno o due secondi, assicurandosi che non vengano introdotte bolle d'aria. Posiziona immediatamente il chip verticalmente su un magnete e lascia che le perline si depositino per cinque minuti senza disturbi. Raccogli quattro millilitri del campione di sangue in una siringa, assicurandoti che le bolle d'aria vengano rimosse.

Sigilla l'ingresso e l'uscita del chip con liquido per eliminare le bolle d'aria, poi inserisci i tubi di entrata e uscita del campione nel chip. Utilizzando una pompa per siringa, inietta il campione a una portata di 1,5 millilitri all'ora. Dopo aver caricato il campione, iniettare 60 microlitri di DPBS nel chip HB a una portata di 0,2 millilitri all'ora per lavare via le celle non legate.

Rimuovere il magnete e iniettare manualmente 1,5 millilitri di 5%BSA per lavare il chip e liberare le cellule tumorali catturate. Prepara una soluzione al 10% di MPTS in etanolo. Introdurre immediatamente 20 microlitri della soluzione nel chip HB e incubare a temperatura ambiente per un'ora.

Sciacquare il chip di HB una volta con etanolo anidro, poi asciugarlo a 100 gradi Celsius per un'ora. Successivamente, prepara la soluzione GMBS in etanolo a una concentrazione di 0,5 milligrammi per millilitro. Dopo aver raffreddato il chip a 37 gradi Celsius, introdurre la soluzione GMBS e incubare.

Risciacqua il chip di HB due volte con acqua distillata doppia, seguita da due risciacqui con DPBS. Aggiungi immediatamente 15 microgrammi per millilitro di streptavidina nel chip HB e incuba a temperatura ambiente per un'ora o tutta la notte a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, risciacqua il chip di HB due volte con soluzione fisiologica DPBS.

Ora prepara il buffer di anticorpi CD45 aggiungendo 0,2% di BSA e 20 microgrammi per millilitro di anticorpo biotinilato CD45 al DPBS e aggiustando fino al volume finale. Iniettare 20 microlitri del tampone di anticorpi CD45 nel chip HB per una selezione negativa dei globuli bianchi. Dopo un'ora di incubazione a temperatura ambiente, risciacqua il chip con DPBS.

Aggiungi una soluzione bloccante contenente 3% BSA e 0,05% Tween 20 nel chip HB. Aspira il campione preparato in una siringa, assicurandoti che non ci siano bolle d'aria. Poi sigilla l'ingresso e l'uscita del chip con il liquido e collega i tubi di presa e uscita al chip.

Utilizzando una pompa a siringa, inietta il campione a una portata di 0,6 millilitri all'ora. Raccogliere cellule tumorali purificate dalla presa del chip per il conteggio e il sequenziamento delle singole cellule. Pipetta 200 microlitri di soluzione allo 0,5% F-68 preparata in DPBS nell'ingresso del chip.

Esegui la sonicazione a bagno d'acqua tenendo il chip. Quando le bolle sono visibili nella regione microporosa, si prosegue la sonicazione per 30 secondi per rimuovere le bolle dai doppi pozzi. Successivamente, iniettare 200 microlitri di sospensione di cellule tumorali nel chip contenente 60.000 pozzi doppi.

Pipetta delicatamente la sospensione della cella nel chip su e giù due volte. Poi metti nuovamente su uno shaker decolorante per cinque minuti per sospendere le cellule non catturate e lasciarle stabilizzarsi di nuovo. Ora aggiungi 200 microlitri di DPBS e soluzione 0,5%F-68 attraverso l'ingresso e aspira dalla presa.

Dopo aver risospeso la sospensione a talone con codice a barre, iniettare immediatamente 200 microlitri di sospensione nell'ingresso del chip e scuotere a 10 giri al minuto per 20 secondi. Pipetta delicatamente la sospensione con la perlina due volte prima di rimetterla sullo shaker. Ora ritira la sospensione a perle con codice a barre dall'uscita, poi pipetta 200 microlitri di 20X Tris-EDTA e soluzione di ditiotreitolo da 50 millimolari.

Preleva liquido dalla presa. Per la lisi cellulare e la cattura del MRNA, aggiungi lentamente 200 microlitri di buffer di lisi cellulare nell'ingresso del chip. Aggiungi immediatamente 200 microlitri di olio minerale per sigillare i doppi pozzi.

Rimuovere la soluzione che scorre dall'uscita del chip al serbatoio di scarto. Poi posiziona il chip orizzontalmente e lascia riposare a temperatura ambiente per cinque minuti. Aggiungi lentamente 200 microlitri di soluzione 6X di citrato di sodio fisiologico nell'ingresso.

Rimuovere il liquido di scarto e aspirare la soluzione residua dalla presa dei chip. Aggiungi lentamente 200 microlitri di citrato di sodio salino 6X per riempire il chip. Tieni un magnete vicino alla superficie del chip e spostalo lentamente dall'ingresso all'uscita per raccogliere le perline con codice a barre.

Aspirare rapidamente la soluzione e formare le perline in un tubo centrifuga contenente 6 volte citrato di sodio salino. Lava le sfere con codice a barre tre volte con 200 microlitri di citrato di sodio salino 6X, seguita da una volta con il buffer di trascrizione inversa. È stata osservata una distribuzione uniforme delle sfere immunomagnetiche sotto un campo magnetico, mentre le sfere residue minime dopo la rimozione magnetica hanno confermato il rilascio riuscito.

Il chip di isolamento CTC ha catturato efficacemente cellule tumorali sia da campioni da 1 millilitro che da 10 millilitri. L'aggiunta del chip di purificazione aumentò ulteriormente la purezza delle cellule tumorali. Nei campioni di sangue periferico con cellule LNCaP minime, il sistema di selezione CTC manteneva un'elevata efficienza e purezza di cattura.

Il chip a barcode a cella singola ha raggiunto un rapporto di occupazione delle perle a barre dell'85,6% e del 95,7%, risultando in un tasso di accoppiamento dell'81,9%. L'aumento del numero di celle cariche ha migliorato il rapporto di occupazione del micropozzo senza ridurre l'efficienza di cattura. Il flusso di lavoro integrato di isolamento CTC e sequenziamento a singola cellula ha prodotto cellule tumorali altamente pure e ha mantenuto accuratamente i rapporti originali delle cellule tumorali. L'analisi TSNE ha separato distintamente le celle PC3, LNCaP e Jurkat in tre cluster, ciascuno caratterizzato da un'espressione unica dei marcatori.

Il cluster di cellule di Jurkat è stato identificato tramite una forte espressione di TRBC1, IGLL1, CD1E e CD3D, confermata dall'arricchimento delle vie per l'attivazione delle cellule T. I cluster PC3 e LNCaP sono stati distinti da geni espressi differenzialmente, con PC3 che mostrava un'elevata espressione microseminoproteica e LNCaP che esprimeva NEDD4.