High-throughput CRISPR vettore Costruzione e caratterizzazione di modifiche del DNA da Generazione di Roots pomodoro Peloso

L'obiettivo generale di questa procedura di clonazione e trasformazione è generare in modo efficiente vettori CRISPR ed eliminare le radici di pomodoro mutanti che possono essere utilizzate negli studi di genomica funzionale. Questo metodo è uno strumento utile nel campo della genomica vegetale perché può generare un gran numero di mutanti knockout che possono essere utilizzati in una varietà di processi radicali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la procedura di clonazione può essere eseguita in un'unica fase, consolidando che i materiali del gruppo possono essere ottenuti in poche settimane.

In primo luogo, la guida alla progettazione di oligo di RNA o gRNA per includere la porzione GN19 dei motivi target affiancata dalle cinque sequenze nucleotidiche prime e tre prime 20 necessarie per l'assemblaggio del DNA. Digerire da uno a cinque microgrammi di plasmide caznina P201N con l'enzima di restrizione Spe1 a 37 gradi Celsius per due ore. Dopo aver purificato il digestato secondo le istruzioni del produttore, risospendere in 15 microlitri di Trs HCL da 10 millimolari.

Quantificare la quantità di DNA mediante spettrofotometria UV. Eseguire una seconda digestione con un enzima di restrizione Swa1 a 25 gradi Celsius per due ore. Controlla da 100 a 200 nanogrammi su un gel di agarosio dell'otto percento per confermare la completa digestione.

Un plasmide correttamente digerito avrà una singola banda a 14.313 coppie di basi. Per la PCR amplificare la truncatula medicago utilizzare sei DNA promotori e impalcature dal plasmide navetta gRNA del disco. Utilizzare il primer Swa1 e Mtu6F e MTU6R e lo scaffold F nello scaffold Spe1 R, in una polimerasi ad alta fedeltà.

Visualizzare aliquat da tre microlitri di prodotti PCR su un gel di agarosio all'uno per cento per confermare l'amplificazione. L'amplicone MTU6 è composto da 377 coppie di basi e l'amplicone da ponteggio è composto da 106 coppie di basi. Colonna purificare i restanti prodotti PCR secondo le istruzioni del produttore.

Quantificare mediante spettrofotometria UV come prima e conservare a 20 gradi Celsius negativi. Quindi, risospendere l'intero tubo di oligo di gRNA a 100 micromolari in acqua di laboratorio. Aggiungere un microlitro di oligo a 500 microlitri di tampone 1xNEB due virgola uno e mescolare bene.

Programmare un termociclatore con un coperchio riscaldato per mantenere una temperatura di 50 gradi Celsius. Combina 100 nanogrammi del vettore linearizzato, 50 nanogrammi di promotore MtU6, 12 nanogrammi di Scaffold e un microlitro di gRNA oligo diluito in acqua fino a un volume finale di cinque microlitri. Aggiungi cinque microlitri di 2X DNA Assembly Mastermix ad alta fedeltà.

Mescolare bene e centrifugare. Incubare la reazione per 60 minuti nel termociclatore a 50 gradi Celsius. Dopo un'ora a 50 gradi Celsius, posizionare la reazione sul ghiaccio e quindi utilizzare due microlitri per trasformare le cellule di E.Coli competenti utilizzando tecniche standard.

Piastra la trasformazione su LB Agar integrato con 50 milligrammi per millilitro di kanamicina e incuba a 37 gradi Celsius durante la notte. Screening delle colonie mediante PCR con il primer StUb3p 218R e 1Sce1R. Diluire un alquat della restante reazione di assemblaggio del DNA con acqua da uno a cinque e utilizzare un microlitro come controllo positivo per lo screening della colonia.

Includere anche un nanogrammo di plasmide casnine circolare P201N come controllo senza inserto. Dopo l'amplificazione della PCR utilizzando i parametri contenuti nella parte scritta del protocollo, visualizzare il prodotto PCR su un gel di agarosio all'uno percento. Gli inserimenti corretti hanno una banda di 725 coppie di basi e i vettori senza inserti avranno una banda di 310 coppie di basi.

Coltiva colonie positive in colture liquide LB Can50 durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, purificare i plasmidi utilizzando un kit di purificazione dei plasmidi secondo le istruzioni del produttore. Dopo aver sequenziato con Sanger i plasmidi purificati con il primer StuB3P218R, allineare i cromatogrammi al promotore MtU6, al target e alle sequenze di scaffold per assicurarsi che non siano stati introdotti errori durante la clonazione.

Eseguire un digest diagnostico digerendo un microgrammo di plasmide con EcoR5 e Sti1. Quando viene visualizzato su un gel di agarosio a virgola zero otto, questo picchiettio a bande dovrebbe essere visto. Infine, trasformare i plasmidi nel ceppo ARqua1 di Agrobacterium rhizogenes aggiungendo un microlitro di preparato plasmidico a 50 microlitri di cellule elettrocompetenti ed elettroporando in una cuvetta da un millimetro.

Aggiungere circa 500 microlitri di SOC Media e agitare a 28 gradi Celsius per due ore. Quindi impiattare su piastre LB Can50 e far crescere a 28 gradi Celsius per due giorni. Inizia questa sezione della procedura sterilizzando i semi di pomodoro in candeggina domestica al 20% per 15 minuti mescolando costantemente.

Quindi trasferire i semi in una cappa a flusso laminare. Rimuovere la candeggina e lavare tre volte in acqua sterile di laboratorio. Piastra 30 semi in una scatola GA7 contenente metà MS Media.

Lasciate germogliare per circa due giorni al buio. Una volta che i semi sono germogliati, sposta le scatole GA7 alla luce Il giorno prima della trasformazione, strisci le colture di A. rhizogenes su LB solido contenente Can50 e cresci a 28 gradi Celsius durante la notte. Il giorno della trasformazione, lavorare nella cappa a flusso laminare per aggiungere 25 microlitri di acetosiringone a 50 millilitri di mezzo MS e versare sei millilitri in ciascuna provetta di coltura.

Utilizzare una punta piegata da 200 microlitri per raschiare le cellule di A.rhizogenes dalla piastra e risospendere nei sei millilitri di mezzo liquido MS. Agitare il tubo per risospendere completamente le cellule. Dopo aver risospeso le cellule da ciascun vettore, prelevare un millilitro di cellule e misurare la densità ottica a una lunghezza d'onda fissa di 600 nanometri.

Aggiungere due millilitri di mezzo liquido MS in una capsula di Petri con carta da filtro sterile. Estrarre i cotiledoni dalle piantine e posizionarli sulla carta da filtro inumidita. Una volta raccolti tutti i cotiledoni, tagliare il centimetro più distale dei cotiledoni, ottenendo pezzi di cotiledone con due estremità tagliate.

Aggiungere le piante ex alle soluzioni di A.rhizogenes e mescolare. Incubare per 20 minuti con capovolgimento occasionale. Durante l'incubazione di A. rhizogenes, aggiungere un pezzo di carta da filtro a una capsula di Petri per ogni trasformazione del costrutto.

Inoltre, mettere ad asciugare metà del terreno solido MS senza antibiotici nella cappa a flusso laminare. Utilizzare una pinza sterile per estrarre i cotiledoni dalla soluzione di A.rhizogenes e posizionarli su carta da filtro asciutta. Coprire con un coperchio per piastre di Petri per assicurarsi che i fazzoletti non si secchino durante il procedere alla trasformazione successiva.

Quindi, tamponare i cotiledoni sulla carta da filtro e trasferire il lato aassiale fino a metà del mezzo MS. Avvolgere le piastre con nastro chirurgico e co-coltivare al buio a temperatura ambiente per due giorni. Dopo la co-coltivazione, trasferire i cotiledoni con il lato abassiale rivolto verso l'alto in un mezzo MS integrato.

Avvolgere con nastro chirurgico. Mantenere le colture sotto luci fluorescenti a temperatura ambiente con un periodo fotografico di 16 ore. Dopo un punto, cinque o due settimane, utilizzare una pinza sterile e un bisturi per asportare radici di almeno due centimetri di lunghezza dai cotiledoni e trasferirle all'acido Ticarcillon/Clavulanato e alla kanamicina integrata con metà del terreno per la SM.

Trasferisci da dieci a 15 radici su un unico piatto. Segna la posizione delle punte delle radici con un pennarello. Avvolgere con nastro chirurgico e conservare nella sala di coltura.

Dopo una settimana, si vedono le radici di trasformazione crescere sui media selettivi. Raccogliere un sottocampione di radici trasformate per l'estrazione del DNA utilizzando il metodo di estrazione del DNA preferito. Le radici pelose possono essere viste emergere dai cotiledoni 11 giorni dopo la trasformazione.

Le radici sono selezionate su acido Ticarcillon/Clavulanato e Kanamicina integrata con metà di MS Media per circa una settimana. Le barre grigie indicano la posizione delle punte delle radici al momento della placcatura. Questo è un esempio di clonazione e sequenziamento di prodotti PCR per determinare mutazioni del DNA con due diversi bersagli genici in quattro diversi eventi di radice pelosa.

La casella grigia indica la sequenza bersaglio GN20 GG e il delta indica il tipo di mutazione. Il numero di cloni con la mutazione indicata è mostrato a destra. Questo è un esempio di gel di poliacrilammide per determinare le mutazioni del DNA.

Grandi delezioni e bande eteroduplex indicano la presenza di mutazioni del DNA nelle sequenze bersaglio. Sei dei 12 eventi indipendenti sono stati classificati come mutanti, come indicato dal simbolo delta. WT indica il controllo di tipo jolly e NT il controllo no template.

Una volta padroneggiati, decine o centinaia di vettori CRISPR possono essere prodotti in una sola settimana e i materiali del gruppo trendulato possono essere ottenuti nel giro di poche settimane. Durante il tentativo di questa procedura, è importante rimuovere e inibire la crescita di qualsiasi residuo di Agrobacterium. La crescita eccessiva di Agrobacterium inibirà e ucciderà qualsiasi materiale radicale.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare vettori CRISPR utilizzando l'assemblaggio del DNA e di come testare tali vettori utilizzando un sistema di modelli di radici pelose e un pomodoro.