High-throughput CRISPR vettore Costruzione e caratterizzazione di modifiche del DNA da Generazione di Roots pomodoro Peloso

L'obiettivo generale di questa procedura di clonaggio e trasformazione è generare in modo efficiente vettori CRISPR e radici di pomodoro con mutazioni knock-out che possono essere utilizzati in studi genomici funzionali. Questo metodo rappresenta uno strumento utile nel campo della genomica vegetale poiché consente di ottenere un elevato numero di mutanti knock-out impiegabili in diversi processi radicali. Il principale vantaggio di questa tecnica è che il procedimento di clonaggio può essere completato in un unico passaggio, consentendo di ottenere i materiali di gruppo in sole poche settimane.

Per prima cosa, progettare oligonucleotidi di RNA guida o gRNA includendo la porzione GN19 dei motivi bersaglio, flanqueggiata dalle sequenze di 20 nucleotidi al capo cinque prime e al capo tre prime necessarie per l'assemblaggio del DNA. Digestire da uno a cinque microgrammi di plasmide P201N caznine con l'enzima di restrizione Spe1 a 37 gradi Celsius per due ore. Dopo aver purificato il prodotto di digestione mediante colonna seguendo le istruzioni del produttore, risospendere in 15 microlitri di Tris HCl 10 millimolare.

Quantificare la quantità di DNA mediante spettrofotometria UV. Eseguire una seconda digestione con l'enzima di restrizione Swa1 a 25 gradi Celsius per due ore. Analizzare da 100 a 200 nanogrammi su un gel di agarosio allo zero virgola otto percento per confermare la digestione completa.

Un plasmide digerito correttamente mostrerà una singola banda a 14.313 paia di basi. Per amplificare tramite PCR il promotore di medicago truncatula, utilizzare sei DNA promotori e dello scheletro dal plasmide shuttle gRNA puck. Utilizzare i primer Swa1 e Mtu6F e MTU6R, e lo scheletro F in Spe1 e lo scheletro R, in una polimerasi ad alta fedeltà.

Visualizzare aliquote di tre microlitri di prodotti PCR su un gel di agarosio all'uno percento per confermare l'amplificazione. L'amplicone MTU6 è di 377 paia di basi, mentre l'amplicone scaffold è di 106 paia di basi. Purificare i prodotti PCR rimanenti mediante colonna seguendo le istruzioni del produttore.

Quantificare mediante spettrofotometria UV come in precedenza e conservare a meno 20 gradi Celsius. Successivamente, risospendere l'intero contenuto del tubo di oligonucleotidi gRNA a 100 micromolari in acqua di grado di laboratorio. Aggiungere un microlitro degli oligonucleotidi a 500 microlitri di buffer 1xNEB due punto uno e mescolare accuratamente.

Programmare un termociclatore con coperchio riscaldato per mantenere una temperatura di 50 gradi Celsius. Combinare 100 nanogrammi del vettore linearizzato, 50 nanogrammi del promotore MtU6, 12 nanogrammi dello scaffold e un microlitro dell'oligo di gRNA diluito in acqua fino a un volume finale di cinque microlitri. Aggiungere cinque microlitri di 2X DNA Assembly Mastermix ad alta fedeltà.

Mescolare accuratamente e centrifugare. Incubare la reazione per 60 minuti nel termociclatore a 50 gradi Celsius. Trascorso l'intervallo di un'ora a 50 gradi Celsius, porre la reazione sul ghiaccio e quindi utilizzare due microlitri per trasformare cellule di E. coli competenti seguendo tecniche standard.

Piastri la trasformazione su Agar LB supplementato con 50 milligrammi per millilitro di Kanamicina e incuba a 37 gradi Celsius per tutta la notte. Analizza le colonie mediante PCR utilizzando i primer StUb3p 218R e 1Sce1R. Diluisci un’aliquota della restante reazione di assemblaggio del DNA con acqua da uno a cinque e utilizza un microlitro come controllo positivo per l’analisi delle colonie.

Includere anche un nanogrammo del plasmide circolare P201N casnine come controllo senza inserzione. Dopo l'amplificazione PCR utilizzando i parametri indicati nella parte scritta del protocollo, visualizzare il prodotto PCR su un gel di agarosio all'uno percento. Le inserzioni corrette presentano una banda di 725 paia di basi, mentre i vettori senza inserzioni mostreranno una banda di 310 paia di basi.

Coltivare le colonie positive in colture liquide LB Can50 durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, purificare i plasmidi utilizzando un kit di purificazione dei plasmidi seguendo le istruzioni del produttore. Dopo il sequenziamento Sanger dei plasmidi purificati con il primer StuB3P218R, allineare i cromatogrammi alle sequenze del promotore MtU6, della sequenza bersaglio e del scaffold per verificare che non siano stati introdotti errori durante il clonaggio.

Eseguire un digestione diagnostica digerendo un microgrammo di plasmide con EcoR5 e Sti1. Quando viene visualizzato su un gel di agarosio allo zero virgola otto, questo profilo di bande dovrebbe essere osservato. Infine, trasformare i plasmidi in Agrobacterium rhizogenes ceppo ARqua1 aggiungendo un microlitro della preparazione di plasmide a 50 microlitri di cellule elettocompetenti ed eseguendo l’elettroporazione in una cuvetta da un millimetro.

Aggiungere circa 500 microlitri di terreno SOC e agitare a 28 gradi Celsius per due ore. Successivamente, seminare su piastre LB Can50 e coltivare a 28 gradi Celsius per due giorni. Iniziare questa sezione della procedura sterilizzando i semi di pomodoro in una soluzione di candeggina domestica al 20% per 15 minuti con mescolamento costante.

Trasferire quindi i semi in una cappa a flusso laminare. Rimuovere la candeggina e lavare con acqua sterile di laboratorio per tre volte. Piastrare 30 semi in una scatola GA7 contenente mezzo MS Media dimezzato.

Lasciare germinare per circa due giorni al buio. Una volta che i semi hanno germinato, spostare le scatole GA7 alla luce. Il giorno precedente la trasformazione, seminare in striscia colture di A.rhizogenes su LB solido contenente Can50 e far crescere a 28 gradi Celsius per tutta la notte. Il giorno della trasformazione, lavorare nell'incubatore a flusso laminare aggiungendo 25 microlitri di acetosiringone a 50 millilitri di MS a metà concentrazione e versare sei millilitri in ogni provetta di coltura.

Utilizzare una punta da 200 microlitri piegata per raschiare le cellule di A.rhizogenes dalla piastra e risospendere in sei millilitri di MS liquido alla metà. Vortexare il tubo per risospendere completamente le cellule. Dopo aver risospeso le cellule di ciascun vettore, prelevare un millilitro di cellule e misurare la densità ottica a una lunghezza d'onda fissa di 600 nanometri.

Aggiungere due millilitri di MS liquido alla metà in una piastra di Petri contenente una carta da filtro sterile. Asportare i cotiledoni dalle piantine e posizionarli sulla carta da filtro inumidita. Una volta raccolti tutti i cotiledoni, tagliare l'apice distale di un centimetro dai cotiledoni, ottenendo frammenti di cotiledone con due estremità recise.

Aggiungere le piante esogene alle soluzioni di A.rhizogenes e mescolare. Incubare per 20 minuti con inversioni occasionali. Durante l'incubazione con A.rhizogenes, aggiungere un pezzo di carta da filtro in una piastra di Petri per ogni trasformazione del costrutto.

Inoltre, preparare una piastra con mezzo solido MS senza antibiotici nel capo a flusso laminare affinché si asciughi. Utilizzare pinze sterili per prelevare i cotiledoni dalla soluzione di A.rhizogenes e posizionarli su carta da filtro asciutta. Coprire con il coperchio della piastra di Petri per evitare che i tessuti si secchino durante il passaggio alla trasformazione successiva.

Successivamente, asciugare i cotiledoni sulla carta da filtro e trasferirli, con il lato abassiale rivolto verso l'alto, su mezzo MS alla metà. Avvolgere le piastre con nastro chirurgico e co-coltivare al buio a temperatura ambiente per due giorni. Dopo la co-coltivazione, trasferire i cotiledoni, con il lato abassiale rivolto verso l'alto, su mezzo MS alla metà supplementato.

Avvolgere con nastro chirurgico. Mantenere le colture sotto luci fluorescenti a temperatura ambiente con un fotoperiodo di 16 ore. Dopo una volta e mezza a due settimane, utilizzare pinze sterili e un bisturi per escindere le radici lunghe almeno due centimetri dai cotiledoni e trasferirle su un mezzo MS a mezza concentrazione integrato con acido Ticarcillina/Clavulanato e Kanamicina.

Trasferire da dieci a 15 radici su una singola piastra. Contrassegnare la posizione delle punte radicali con un pennarello. Avvolgere con nastro chirurgico e mantenere in stanza di coltura.

Dopo una settimana, si osservano radici trasformate in crescita sul mezzo selettivo. Raccogliere un sottocampione di radici trasformate per l'estrazione del DNA utilizzando il metodo di estrazione del DNA preferito. Le radici pelose possono essere viste emergere dai cotiledoni 11 giorni dopo la trasformazione.

Le radici vengono selezionate su mezzo MS semiliquido integrato con Ticarcillina/Ácido Clavulanico e Kanamicina per circa una settimana. Le barre grigie indicano la posizione delle punte radicali al momento della semina. Questo è un esempio di clonaggio e sequenziamento di prodotti PCR per determinare mutazioni del DNA con due diversi bersagli genici in quattro diversi eventi di radici pelose.

Il riquadro grigio indica la sequenza bersaglio GN20 GG e delta indica il tipo di mutazione. Il numero di cloni con la mutazione indicata è mostrato a destra. Questo è un esempio di un gel di poliacrilamide utilizzato per determinare mutazioni del DNA.

Delezioni di grandi dimensioni e bande eteroduplex indicano la presenza di mutazioni del DNA nelle sequenze bersaglio. Sei eventi su 12 indipendenti sono stati classificati come mutanti, come indicato dal simbolo delta. WT indica il controllo di tipo selvatico e NT il controllo senza stampo.

Una volta acquisita padronanza, è possibile produrre decine o centinaia di vettori CRISPR in una singola settimana e ottenere materiali di gruppo in poche settimane. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale rimuovere e inibire la crescita di qualsiasi residuo di Agrobacterium. Una crescita eccessiva di Agrobacterium inibirà e ucciderà qualsiasi materiale radicale.

Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare vettori CRISPR utilizzando l'assemblaggio del DNA e di come testare tali vettori mediante un sistema modello di radici pelose e pomodoro.