Name: Modelli murini di ingegneria genomica somatica mediante microiniezione ed elettroporazione in vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Impara la modifica genomica CRISPR nell'ovidotto murino mediante microiniezione ed elettroporazione in vivo. Questo metodo flessibile consente di studiare l'iniziazione tumorale in un ambiente immunocompetente.

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Gli autori ringraziano Katie Teng e il Dr. Matthew J. Ford per aver fornito plasmidi utilizzati per generare risultati rappresentativi e ottimizzazione del protocollo. K.H. è stato sostenuto da Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS) borsa di dottorato, Donnor Foundation, Delta Kappa Gamma World Fellowship, Centre for Research in Reproduction and Development (CRRD), Hugh E. Burke, Rolande & Marcel Gosselin e Alexander McFee studenty.

Gli animali sono stati alloggiati in gabbie statiche di microisolamento con piani filtranti, situati in una stanza dedicata contenente un armadio di biosicurezza di tipo II. Tutto il lavoro sugli animali è stato eseguito in conformità con le linee guida istituzionali ed è stato approvato dal Comitato per la cura degli animali della Facoltà di Medicina e Scienze della Salute della McGill University (AUP # 7843).
1. Preparazione dell'ago per microiniezione
<ol><li>Tirare un tubo capillare di vetro in una punta affilata usando un estrattore di micropipette con il seguente programma: P = 500, Calore = 576, PULL = 50, VEL = 80, DEL = 70.</li>
	<li>Utilizzando un paio di pinze a punta ultrafine affusolate, tagliare l'estremità appuntita del tubo capillare tirato sotto un microscopio da dissezione per creare un'apertura, come mostrato in Figura 1A,B. Assicurarsi che l'apertura non sia troppo grande, in quanto ciò danneggerebbe l'ovidotto e impedirebbe l'iniezione lenta.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65131/65131fig01.jpg"> Figura 1: Preparazione dell'ago per microiniezione. (A,B) Tubo capillare tirato con un'estremità appuntita (A) che è stato tagliato per creare un'apertura (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65131/65131fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
2. Preparazione dell'anestetico per l'iniezione intraperitoneale
<ol><li>Preparare l'avertin filtrato e diluito il giorno dell'intervento. La soluzione madre di Avertin (2,2,2-tribromoetanolo) viene preparata ad una concentrazione di 1,6 g/ml in alcool terz-amilico mediante agitazione vigorosa e conservata al buio.</li>
	<li>Diluire la soluzione madre di avertin con soluzione salina isotonica all'1,25% v/v fino a una concentrazione finale di 20 mg/ml all'interno di una cappa aspirante. Vortice l'avertina diluita e filtrare attraverso un filtro sterile da 0,22 μm. Tenere al buio.</li>
</ol>3. Preparazione dell'area chirurgica
<ol><li>L'area chirurgica dovrebbe essere un ambiente sterile dedicato, preferibilmente un banco pulito o un armadietto di biosicurezza. Disporre l'attrezzatura chirurgica sterile, il microscopio, il micromanipolatore e l'elettroporatore secondo necessità. Un esempio di ciò è illustrato nella Figura 2.</li>
	<li>Riscaldare la piastra riscaldante/disco e posizionarla sotto una gabbia pulita e completamente attrezzata. Questa gabbia sarà utilizzata per ospitare i topi dopo l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Versare 1x soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS) in una capsula di Petri sterile. Usa un paio di forbici pulite per tagliare la carta assorbente in quadrati, con dimensioni approssimative di 1 cm x 1 cm. Lascia cadere questi pezzi di carta assorbente nel PBS 1x per immergerli.</li>
</ol>4. Preparazione della soluzione e dell'ago per l'iniezione
<ol><li>Preparare la soluzione per iniezione il giorno dell'intervento. Mescolare il DNA / RNA / RNP con blu tripano filtrato ad una concentrazione finale minima di 200 ng / μL ciascuno e 5%, rispettivamente. Conservare a temperatura ambiente prima dell'iniezione. NOTA: Utilizzare una siringa da 1 mL per assumere il 100% di trypan blue e filtrare attraverso un filtro sterile da 0,22 μm prima dell'uso.</li>
	<li>Collegare l'ago capillare tirato, d'ora in poi chiamato ago per microiniezione, al micromanipolatore a morsetto stabilizzato da un supporto magnetico (configurazione mostrata in Figura 2B).</li>
	<li>Pipettare 2 μL della soluzione iniettabile su una capsula di Petri sterile. Durante l'osservazione al microscopio, assumere lentamente 1-2 μL di questa soluzione nell'ago di microiniezione utilizzando la siringa ad aria compressa collegata al micromanipolatore. Evitare bolle/prendere bolle nell'ago di microiniezione.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65131/65131fig02.jpg"> Figura 2: Preparazione dell'area chirurgica. (A) Configurazione dell'area chirurgica all'interno di un banco pulito. (B) Microscopio da dissezione e micromanipolatore per un individuo destrorso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65131/65131fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
5. Esposizione del tratto riproduttivo femminile
<ol><li>Anestetizzare una femmina di topo di 6-8 settimane somministrando avertin (anestetico) filtrato e diluito per via intraperitoneale alla dose di 0,25-0,5 mg / g. Successivamente, somministrare carprofen (analgesico preventivo) per via sottocutanea alla dose di 5 mg/kg. NOTA: Altre alternative che possono essere utilizzate come anestetico sono isoflurano o ketamina / xilazina.</li>
	<li>Posizionare la carta assorbente su un tampone/disco pulito e riscaldato. Quindi, posizionare il topo anestetizzato su questa carta assorbente riscaldata con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Applicare lubrificante per gli occhi su ciascun occhio per prevenire l'essiccazione durante l'intervento chirurgico. NOTA: Verificare che il termoforo/disco sia leggermente caldo al tatto testando con il dorso della mano.</li>
	<li>Test per l'arresto anestetico profondo pizzicando la punta del topo anestetizzato con un paio di pinze. Rimuovere la pelliccia dorsale attorno al sito di incisione prospettica (posizione mostrata in Figura 3A) e pulire la pelle nuda con antisettico.</li>
	<li>Utilizzare un paio di pinze smussate dritte per pizzicare la pelle nuda e creare un'incisione lunga 1 cm lungo la linea mediana del corpo usando un paio di forbici smussate sterili e affilate. Pulire l'area intorno all'incisione con antisettico.</li>
	<li>Pizzicare e tenere premuto un lato del sito di taglio usando un paio di pinze sterili Adson. Quindi, utilizzando un paio di pinze seghettate sterili e curve, separare delicatamente la pelle dalla parete del corpo, iniziando dall'incisione della linea mediana e spostandosi lateralmente.</li>
	<li>Individuare il cuscinetto di grasso sotto il rene. Utilizzando un paio di pinze dritte sterili, pizzicare la parete del corpo direttamente sopra il cuscinetto adiposo. Crea una piccola incisione nella parete del corpo usando un paio di forbici da dissezione sterili a punta affilata, facendo attenzione ad evitare i vasi sanguigni.</li>
	<li>Mentre si pizzica ancora la parete del corpo con una pinza dritta e smussata, inserire un paio di pinze curve smussate sterili nell'incisione e allargare l'incisione creata nella parete del corpo.</li>
	<li>Prendi il cuscinetto di grasso visibile con la pinza curva smussata e tiralo fuori dal foro per esporre l'ovaio, l'ovidotto e l'utero.</li>
	<li>Per mantenere esposto il tratto riproduttivo, bloccare il cuscinetto adiposo con un morsetto sterile per bulldog, come mostrato nella Figura 3B.</li>
</ol>6. Iniezione ed elettroporazione in vivo dell'ovidotto
<ol><li>Posizionare con attenzione la carta assorbente riscaldata e il topo anestetizzato con il tratto riproduttivo esposto sul palco di un microscopio da dissezione, in modo tale che il tratto possa essere osservato. Un esempio della vista osservata al microscopio è mostrato nella Figura 3B.</li>
	<li>Regolare il micromanipolatore in modo che l'ago per iniezione con la soluzione possa essere osservato anche al microscopio.</li>
	<li>Utilizzando un paio di pinze sterili affusolate a punta ultrafine, tenere ferma la regione dell'ovidotto che deve essere iniettata. La regione da iniettare deve essere in linea con la direzione dell'ago per microiniezione. NOTA: Utilizzare il morsetto bulldog ancorando il cuscinetto adiposo e il tratto riproduttivo per ruotare delicatamente / spostare il tratto in una posizione ottimale, se necessario.</li>
	<li>Regolare il micromanipolatore per perforare l'ovidotto con l'ago da microiniezione, alimentando contemporaneamente l'ovidotto sull'ago utilizzando la pinza a punta ultrafine affusolata. Spostare delicatamente l'ago per microiniezione per confermare che è stato inserito nell'ovidotto. NOTA: Inserire l'ago per microiniezione in un segmento dritto anziché in un punto di svolta dell'ovidotto arrotolato per evitare forature multiple e perdite di soluzione iniettabile.</li>
	<li>Iniettare lentamente fino a 1 μL di soluzione nell'ovidotto, osservando il movimento della soluzione blu e l'espansione del lume dell'ovidotto al microscopio. Fare attenzione a non introdurre bolle nel lume. Immagini rappresentative di ovidotti iniettati con blu tripano al 100% sono mostrate nella Figura 3C,D.</li>
	<li>Rimuovere l'ago dall'ovidotto. Coprire l'area da prendere di mira con un pezzo di carta assorbente imbevuto di 1x PBS sterile (dal punto 3.3).</li>
	<li>Afferrare la carta impregnata e l'area/regione da colpire con una coppia di pinzette per elettrodi (1 mm, 3 mm o 5 mm, a seconda delle dimensioni della regione da colpire) e allontanarsi dal corpo, prima di elettropare utilizzando queste impostazioni sul generatore di impulsi/elettroporatore: 30 V, tre impulsi, intervallo di 1 s, Lunghezza dell'impulso 50 ms, unipolare. NOTA: La distanza tra gli elettrodi deve essere impostata in modo tale che gli elettrodi possano bloccarsi sulla regione target senza deformare l'ovidotto. La distanza consigliata è di circa 1 mm.</li>
	<li>Dopo l'elettroporazione, rimuovere la carta assorbente e posizionare il mouse (con la carta assorbente riscaldata sotto) su un termoforo. Sblocca il morsetto del bulldog e spingi con attenzione il tratto riproduttivo esposto sotto la parete del corpo. Ripetere la sezione 5 per esporre il tratto riproduttivo sull'altro lato. NOTA: L'elettroporazione ha successo indipendentemente dallo stadio estrale del mouse, purché il lume sia riempito con la soluzione.</li>
	<li>Coprire il tratto esposto con carta assorbente imbevuta di 1x PBS sterile per evitare che si secchi, quindi preparare l'ago per microiniezione per la seconda iniezione ripetendo i passaggi 4.2 e 4.3. NOTA: Sostituire l'ago per microiniezione secondo necessità. Prevenire l'essiccazione del tessuto esposto applicando 1x PBS sterile quando necessario.</li>
	<li>Ripetere i passaggi precedenti per iniettare ed elettropore l'ovidotto sul lato opposto. NOTA: Riapplicare il lubrificante per gli occhi secondo necessità durante e dopo l'intervento.</li>
	<li>Dopo che entrambi gli ovidotti sono stati elettroporati e riposti sotto la parete del corpo, suturare o graffettare il sito di incisione dorsale. Per la sutura, utilizzare un emostatico per afferrare l'ago delle suture intrecciate di seta (3/8 cerchio; calibro: 5-0; dimensione dell'ago: 18 mm; lunghezza del filo: 75 cm). Pizzicare e tenere premuto un lato del sito di taglio usando un paio di pinze seghettate curve sterili, quindi utilizzare l'emostatico per manipolare la sutura per chiudere la ferita.</li>
	<li>Spostare il mouse in una gabbia pulita posizionata sopra un tampone/disco riscaldato (dal punto 3.2) e monitorare fino a quando il mouse non è attivo.</li>
	<li>Somministrare 5 mg/kg di carprofen per via sottocutanea ogni 24 ore per i prossimi 3 giorni e monitorare nei successivi 10 giorni.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65131/65131fig03.jpg"> Figura 3: Esposizione del tratto riproduttivo femminile e microiniezione . (A) Posizione dell'incisione della linea mediana (indicata come una linea gialla) sul lato dorsale di un topo Rosa-LSLtdTomato. (B) Esposizione del tratto riproduttivo femminile. Il cuscinetto grasso è stato bloccato usando un morsetto sterile per bulldog per ancorare il tratto e tenerlo esposto. (C,D) Immagini rappresentative dell'iniezione in vivo dell'ovidotto. Un ago di microiniezione è stato inserito nell'ampolla distale (marcata AMP) e filtrato al 100% di blu tripano è stato iniettato nel lume dell'ovidotto mentre il tratto era esposto (C). Immagine rappresentativa di un ovidotto sezionato, che dimostra che la soluzione di blu tripano iniettato si distribuisce in tutto il lume dell'ovidotto distale e prossimale (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65131/65131fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I passaggi cruciali di questo protocollo dettagliato sono la microiniezione di DNA / RNA / RNP nel lume dell'ovidotto e il controllo della forza e dell'area dell'elettroporazione. La perdita di soluzione DNA/RNA/RNP durante la microiniezione può causare la trasfezione di aree/cellule indesiderate. Per un'elettroporazione coerente ed efficiente, è preferibile riempire il lume dell'ovidotto con la soluzione (Figura 3C,D). Questo perché l'area di elettroporazione è controllata principalmente dalla dimensione e dal posizionamento dell'elettrodo. L'elettroporazione debole riduce il numero di cellule elettroporate e l'elettroporazione dura può causare l'elettroporazione di cellule indesiderate o interrompere la struttura del tessuto. Il numero di cellule elettroporate può essere variato regolando la concentrazione della soluzione di DNA/RNA/RNP o i parametri di elettroporazione. Tuttavia, poiché alte tensioni / produzione di calore durante l'elettroporazione potrebbero danneggiare il tessuto, questi parametri devono essere testati prima dell'uso su topi vivi / anestetizzati. Infine, a causa della natura impegnativa di questa procedura, si raccomanda di praticare l'esposizione del tratto e la microiniezione su topi morti prima di eseguire questo intervento chirurgico su topi vivi / anestetizzati.
È riconosciuto che più geni sono coinvolti nell'inizio del cancro, quindi, ricapitolare questo evento richiede la modifica multi-allelica di diversi geni. Inoltre, è anche noto che non tutte le cellule sono ugualmente suscettibili alle mutazioni oncogeniche9. La modellazione del cancro, quindi, richiede specifiche linee di topi Cre per ottenere uno stretto controllo degli insulti oncogeni. Tuttavia, la loro disponibilità e specificità causa varie sfide, compresi gli effetti nei tessuti non bersaglio e la letalità19. Inoltre, i G-GEMM tradizionali comportano costi elevati per la manutenzione e richiedono tempo per la generazione della linea di mouse. Lo sviluppo della tecnologia di editing del genoma CRISPR / Cas9 e il miglioramento della consegna genica in specifiche cellule somatiche ci ha permesso di superare questi problemi. In questo protocollo, presentiamo un metodo di consegna DNA / RNA / RNP per la manipolazione del genoma somatico che può essere utilizzato per la modellazione del cancro, senza l'assoluta necessità di linee di topo specifiche12. Iniettando soluzioni DNA/RNA/RNP nel lume e utilizzando diverse dimensioni di elettrodi a pinzetta per la somministrazione basata sull'elettroporazione, vengono prese di mira aree ristrette dell'epitelio mucoso dell'ovidotto di topo (Figura 4A-F). Ciò è particolarmente utile nella modellazione dell'inizio di HGSC che hanno origine dall'estremità distale della tuba di Falloppio.
Il metodo di microiniezione e elettroporazione in vivo presentato è altamente versatile per colpire tessuti / organi con un lume. Anche il parenchima d'organo è bersagliabile utilizzando questo metodo14. Anche gli approcci di consegna virale, come i sistemi lentivirali e adenovirali, possono essere utilizzati per scopi simili. Tuttavia, i vantaggi dell'elettroporazione rispetto agli approcci di consegna virale sono: 1) somministrazione multipla di plasmidi in singole cellule, 2) nessuna restrizione sulla dimensione dell'inserto15 e 3) facile controllo dell'area e dei tempi di consegna. Inoltre, la specificità del targeting può essere migliorata utilizzando promotori specifici del lignaggio. Questo a volte è difficile nei sistemi virali a causa del limite sulla confezione virale.
Come è la natura dell'elettroporazione, le cellule epiteliali elettroporate sono intervallate casualmente da cellule sane e non modificate (Figura 4G). Tuttavia, questo mosaicismo nelle cellule geneticamente modificate e non modificate potrebbe essere vantaggioso per studiare l'inizio del cancro, in quanto ricapitola la natura sporadica dell'inizio precoce del cancro all'interno di un microambiente immunocompetente. La frequenza delle cellule elettroporate può essere regolata variando le concentrazioni della soluzione DNA/RNA/RNP e/o i parametri di elettroporazione. Utilizzando l'editing genico mediato da CRISPR-Cas in combinazione con il protocollo presentato, è facile selezionare più geni e generare modelli eterogenei di mutazioni / combinazioni alleliche in geni mirati; ciò è particolarmente utile nella modellazione di tumori che presentano un numero considerevole di alterazioni genomiche come HGSCs20,21. Inoltre, sequenziando geni mirati durante la progressione del cancro, è possibile seguire l'evoluzione clonale in vivo di tumori e metastasi in topi immunocompetenti12.

La tuba di Falloppio, chiamata ovidotto nei topi, è una struttura tubolare che collega l'utero all'ovaio. Svolge un ruolo essenziale nella riproduzione dei mammiferi, fornendo l'ambiente per la fecondazione interna e lo sviluppo preimpianto 1,2. Nonostante la sua importanza, poco si sa sulla sua funzione e omeostasi, in parte a causa dello sviluppo di tecniche di fecondazione in vitro che aggirano qualsiasi problema di infertilità correlato a questo organo3. Tuttavia, è stato riconosciuto che le lesioni precancerose del carcinoma ovarico sieroso di alto grado (HGSC), un istotipo aggressivo di cancro ovarico che rappresenta circa il 75% dei carcinomi ovarici e l'85% dei decessi correlati4, sono limitate all'epitelio distale delle tube di Falloppio 5,6,7,8 . Ciò indica che non tutte le cellule del nostro corpo sono ugualmente suscettibili agli insulti oncogeni, ma piuttosto solo le cellule uniche / sensibili in ciascun tessuto / organo diventano la cellula di origine nel cancro - definita flessibilità cellulare9. Lungo queste linee, è stato dimostrato che le cellule epiteliali della tuba di Falloppio distale, situate adiacenti all'ovaio, sono distinte dal resto della tuba10,11. Pertanto, i modelli murini tradizionali di HGSC, che colpiscono tutte le cellule dell'ovidotto, non ricapitolano la condizione umana. In uno studio recente, abbiamo utilizzato una combinazione di editing del genoma mediato da CRISPR, elettroporazione dell'ovidotto in vivo e tracciamento del lignaggio basato su Cre per indurre con successo HGSC mutando quattro geni oncosoppressori nell'ovidotto distale del topo12,13. Questo manoscritto presenta un protocollo passo-passo che descrive questa procedura di microiniezione e elettroporazione in vivo per colpire l'epitelio mucoso dell'ovidotto di topo.
Questo metodo ha diversi vantaggi. Può essere adattato per colpire altri tessuti / organi, incluso il parenchima d'organo14. Sebbene altri approcci di consegna genica in vivo come i sistemi lentivirali e adenovirali possano essere utilizzati per ottenere un targeting simile specifico per tessuto / organo, l'area di targeting è più facilmente regolata utilizzando diverse dimensioni di elettrodi di tipo pinzetta per la consegna basata sull'elettroporazione. A seconda della concentrazione di DNA/RNA/ribonucleoproteine (RNP), dei parametri di elettroporazione e delle dimensioni degli elettrodi, il numero di cellule elettroporate può essere alterato. Inoltre, specifici tipi di cellule possono essere mirati quando utilizzati in combinazione con promotori per l'espressione di Cas9, senza l'assoluta necessità di modelli murini geneticamente modificati (G-GEMM) della linea germinale. Inoltre, a differenza dei sistemi di consegna virale, l'elettroporazione consente la consegna multipla di plasmidi in singole cellule e meno vincoli nella dimensione del DNA dell'inserto15. Lo screening in vivo delle mutazioni genetiche può anche essere eseguito con relativa facilità grazie a questa elevata flessibilità. Inoltre, le cellule elettroporate possono essere tracciate o rintracciate quando questo metodo viene utilizzato in combinazione con linee di reporter Cre come Tdtomato o Confetti16,17.

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; m unità filtrante sterile&nbsp;</td><td>LifeGene</td><td>SF0.22PES</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td>Terumo Medical Corportation</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Elettrodi a pinzetta da 1 mm</td><td>BEX CO., LTD</td><td></td><td></td></tr> LF650P1 <tr><td>Elettrodi a pinzetta da 3 mm</td><td>BEX CO., LTD</td><td></td><td></td></tr> LF650P3 <tr><td>Ago BD da 30 G x 1/2</td><td></td> BD <td>305106</td><td>L'ago è collegato alla siringa da 1 ml quando si utilizza un anestetico iniettabile o un analgesico.</td></tr><tr><td>Pinze Adson</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-000-451</td><td></td></tr><tr><td>Siringa ad aria compressa</td><td>BD</td><td>B302995</td><td>Attaccata al micromanipolatore; come mostrato nella Figura 2B</td></tr><tr><td>Analgesico</td><td>-</td><td>-</td><td>Carprofene, dose: 5mg/kg.</td></tr><tr><td>Antisettico</td><td>Cardinal Health</td><td>OMEL0000017</td><td>Baxedin: 2% di clorexidina in alcol isopropilico al 70%</td></tr><tr><td>Avertin (2,2,2-tribromoetanolo) - Anestetico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T48402-25G</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore a morsetto</td><td>AD Instruments</td><td>MM-33</td><td></td></tr><tr><td>Pinze seghettate curve</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0696845</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td> <td>da dissezioneZeiss</td><td>SteREO Discovery.V8</td><td>Apochromat S, 0,63X, FWD 107mm. LED KL 200 montato per luce superiore, etichettato come sorgente luminosa nella Figura 2B.</td></tr><tr><td>Lubrificante per gli occhi</td><td></td><td></td> <td>Alcon-Systane unguento (Unguento lubrificante per gli occhi)</td></tr><tr><td>Aghi capillari in vetro</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B100&ndash; 50-10</td><td>Diametro esterno: 1 mm, diametro interno: 0,5 mm, lunghezza: 10 cm</td></tr><tr><td>Emostatici Hartman</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-822-711</td><td></td></tr><tr><td>Fornello/disco riscaldante&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>In questo protocollo è stato utilizzato il termoforo per microonde SnuggleSafe Pet Bed. Microonde per 2-5 minuti e prova con il dorso della mano guantata.</td></tr><tr><td>Supporto magnetico per micromanipolatore</td><td>AD Instruments</td><td>MB-B</td><td>Utilizzato per mantenere stabile e verticale il micromanipolatore con montaggio a morsetto durante l'iniezione.</td></tr><tr><td>Morsetto per micro bulldog</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-822-230</td><td>Estrattore</td></tr><tr><td>per micropipette</td> da 3 cm <td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>P-97 Estrattore per micropipette di tipo fiammante/marrone. Programma utilizzato: P = 500, Heat = 576, PULL = 50, VEL = 80, DEL = 70</td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>263991</td><td>È possibile utilizzare anche petradischi di vetro sterilizzati/autoclavati.</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>PD8117</td><td>10X PBS è stato diluito a 1X con acqua deionizzata. Autoclave prima dell'uso.</td></tr><tr><td>Generatore di impulsi/Elettroporatore</td><td>BEX CO., LTD</td><td>CUY21 EDIT II</td><td>Impostazioni dell'elettroporazione: 30 V, 3 impulsi, intervallo di 1 s, lunghezza P. = 50 ms, unipolare</td></tr><tr><td>Rosa-LSLtdTopi pomodoro</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>7914</td><td>Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td></tr><tr><td>Forbici da dissezione affilate</td><td>Fisher Scientific</td><td>28251</td><td></td></tr><tr><td>Forbici da dissezione a punta affilata</td><td>Fisher Scientific</td><td>Rasoio SDI130</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>-</td><td></td> <td>È possibile utilizzare anche una crema depilatoria.</td></tr><tr><td>Suture intrecciate in seta</td><td>Ethicon</td><td>682G</td><td>3/8 cerchio, calibro: 5-0, misura dell'ago: 18 mm, lunghezza del filo: 75 cm. Possono essere utilizzate anche graffette.</td></tr><tr><td>Pinza a punta ultrafine affusolata&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-122</td><td></td></tr><tr><td>Carta assorbente sottile</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34120</td><td>Kimwipes</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7050</td><td>Filtrato utilizzando 0,22 &; m filtro sterile prima dell'uso per microiniezione.</td></tr></tbody></table>

modelli murini di ingegneria genomica somatica mediante microiniezione ed elettroporazione in vivo

Somatic Genome-Engineered Mouse Models Using In Vivo Microinjection and Electroporation

I modelli murini geneticamente modificati germinali (G-GEMM) hanno fornito preziose informazioni sulla funzione genica in vivo nello sviluppo, nell'omeostasi e nella malattia. Tuttavia, i tempi e i costi associati alla creazione e alla manutenzione delle colonie sono elevati. I recenti progressi nell'editing del genoma mediato da CRISPR hanno permesso la generazione di GEMM somatiche (S-GEMM) mirando direttamente alla cellula / tessuto / organo di interesse.
L'ovidotto, o tuba di Falloppio nell'uomo, è considerato il tessuto di origine del cancro ovarico più comune, i carcinomi ovarici sierosi di alto grado (HGSC). Gli HGSC iniziano nella regione della tuba di Falloppio distale all'utero, situata adiacente all'ovaio, ma non nella tuba di Falloppio prossimale. Tuttavia, i modelli murini tradizionali di HGSC prendono di mira l'intero ovidotto e quindi non ricapitolano la condizione umana. Presentiamo un metodo di microiniezione di soluzione di DNA, RNA o ribonucleoproteina (RNP) nel lume dell'ovidotto e elettroporazione in vivo per colpire le cellule epiteliali della mucosa in regioni ristrette lungo l'ovidotto. Ci sono diversi vantaggi di questo metodo per la modellazione del cancro, come 1) elevata adattabilità nel colpire l'area / tessuto / organo e la regione di elettroporazione, 2) elevata flessibilità in tipi cellulari mirati (flessibilità cellulare) quando usato in combinazione con promotori specifici per l'espressione di Cas9, 3) alta flessibilità nel numero di cellule elettroporate (frequenza relativamente bassa), 4) non è richiesta alcuna linea murina specifica (modelli di malattia immunocompetenti), 5) elevata flessibilità nella combinazione di mutazioni geniche e 6) possibilità di tracciare cellule elettroporate quando utilizzate in combinazione con una linea di reporter Cre. Pertanto, questo metodo economico ricapitola l'inizio del cancro umano.

La Figura 1 e la Figura 2 illustrano rispettivamente la preparazione dell'ago per microiniezione e la configurazione dell'area chirurgica per la microiniezione in vivo e l'elettroporazione dell'ovidotto del topo. Durante l'intervento chirurgico, il tratto riproduttivo femminile è stato esposto attraverso incisioni praticate nella pelle dorsale (Figura 3A) e nella parete corporea di un topo anestetizzato Rosa-LSLtdTomato (Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)17. Un morsetto per bulldog è stato bloccato sul cuscinetto adiposo sopra il tratto per tenerlo esposto e ancorato (Figura 3B). La soluzione iniettabile contenente plasmidi PCS2 CreNLS18 a 400 ng/μL è stata iniettata nell'ampolla (marcata AMP) dell'ovidotto arrotolato e lasciata disperdere lungo tutto il lume dell'ovidotto (Figura 3C,D). Sebbene i plasmidi PCS2 CreNLS siano stati utilizzati per generare risultati rappresentativi in questo manoscritto, il metodo descritto può essere utilizzato con DNA/RNA/RNP facilmente intercambiabili nella soluzione di iniezione per l'editing genico mediato da CRISPR/Cas nell'ovidotto del topo. Quindi, sono stati posizionati elettrodi di tipo pinzetta da 1 mm o 3 mm, in modo tale che l'ovidotto distale fosse tra gli elettrodi per la consegna basata sull'elettroporazione.
Gli ovidotti sono stati raccolti 4 giorni dopo l'intervento chirurgico e allungati rimuovendo il mesosalpinx per visualizzare la specificità dell'elettroporazione. Utilizzando elettrodi di tipo pinzetta da 1 mm o 3 mm, l'area mirata, marcata con TdTomato, è stata limitata all'epitelio dell'ovidotto distale (Figura 4A,D). La dimensione di questa area mirata è stata ulteriormente controllata utilizzando elettrodi di diverse dimensioni. Utilizzando elettrodi di tipo pinzetta da 3 mm, abbiamo mirato a un'area molto più ampia dell'AMP (Figura 4B, C), rispetto al targeting solo della punta più distale, l'INF (Figura 4E, F), utilizzando elettrodi di tipo pinzetta da 1 mm. Questi ovidotti raccolti sono stati fissati, trattati con un gradiente di saccarosio e sezionati utilizzando un criostato per analisi dettagliate. Le sezioni sono state controcolorate con Hoescht 33342 e Phalloidin per colorare rispettivamente i nuclei e il citoscheletro, quindi sono state visualizzate utilizzando un microscopio confocale a scansione puntiforme. Nella regione mirata, le cellule elettroporate, contrassegnate da TdTomato, sono state distribuite in modo casuale tra le cellule non elettroporate (TdTomato-ve) (Figura 4G). Inoltre, le cellule elettroporate erano limitate all'epitelio della mucosa e non si trovavano nello strato stromale o muscolare sottostante (Figura 4G,H). Infine, per confermare l'editing genico mediato da CRISPR-Cas, le cellule TdTomato+ve possono essere isolate mediante selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS) per l'isolamento del DNA e il sequenziamento MiSeq12.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65131/65131fig04.jpg"> Figura 4: Validazione dell'iniezione in vivo riuscita e dell'elettroporazione di cellule epiteliali dell'ovidotto, 4 giorni dopo l'intervento. (A-C) Elettroporazione con elettrodi di tipo pinzetta di dimensioni 3 mm. L'ovidotto è stato srotolato rimuovendo il mesosalpinx per una migliore visualizzazione della specificità dell'elettroporazione (A). L'area di elettroporazione, identificata dall'espressione di TdTomato, era limitata all'ovidotto distale, marcato con AMP (B,C). (D-F) Elettroporazione con elettrodi di tipo pinzetta di 1 mm. L'ovidotto è stato srotolato rimuovendo il mesosalpinx per una migliore visualizzazione della specificità dell'elettroporazione (D). L'area di elettroporazione era limitata all'infundibolo (marcato INF), la punta più distale dell'ovidotto (E,F). (G,H) Sezione trasversale dell'ovidotto distale 4 giorni dopo elettroporazione con plasmidi PCS2 CreNLS. Le cellule elettroporate marcate con TdTomato (G) erano limitate al monostrato epiteliale (H). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65131/65131fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

Questo protocollo descrive la microiniezione e l'elettroporazione in vivo per l'editing del genoma mediato da CRISPR limitato a livello regionale nell'ovidotto del topo.

Modelli murini di ingegneria genomica somatica mediante microiniezione ed elettroporazione in vivo

Germline genetically engineered mouse models (G-GEMMs) have provided valuable insight into in vivo gene function in development, homeostasis, and disease. ...

Il protocollo presentato è un metodo altamente flessibile per la manipolazione del genoma nell'ovidotto del topo. Permette la formazione di cellule mutate sporadicamente circondate da cellule inedite all'interno di un ambiente immunocompetente. Questo è vantaggioso per studiare l'iniziazione del cancro.Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua elevata adattabilità nel colpire un organo, un'area, una regione o un tipo di cellula di interesse con set facilmente intercambiabili di combinazioni di mutazioni, il tutto senza l'assoluta necessità di una linea di topo. Questo metodo può essere facilmente adattato per l'uso in organi con il lume e parenchima d'organo. Per iniziare, tirare un tubo capillare di vetro in una punta acuminata usando un estrattore di micropipette.Utilizzando un paio di pinze affusolate a punta ultra fine, tagliare l'estremità appuntita del tubo capillare tirato sotto un microscopio da dissezione per creare un'apertura. Assicurarsi che l'apertura non sia troppo grande, in quanto danneggerà l'ovidotto e impedirà l'iniezione lenta. Quindi, disporre l'attrezzatura chirurgica sterile, il microscopio, il micromanipolatore e l'elettroporatore su un banco pulito e sterile o all'interno dell'armadio di biosicurezza.Riscaldare il termoforo su un disco e posizionarlo sotto una gabbia pulita e completamente attrezzata. Versare 1X PBS sterile in una capsula di Petri. Usando un paio di forbici pulite, tagliare la carta assorbente in quadrati uno per un centimetro.Lasciali cadere in PBS per immergerli. Quindi, collegare l'ago capillare tirato al micromanipolatore a morsetto, stabilizzato da un supporto magnetico. Pipettare due microlitri della soluzione iniettabile su una capsula di Petri sterile.Durante l'osservazione al microscopio, prelevare lentamente da uno a due microlitri della soluzione di iniezione nell'ago di microiniezione utilizzando la siringa ad aria compressa collegata al micromanipolatore. Evitare di prendere bolle nell'ago. Dopo aver anestetizzato un topo femmina di sei-otto settimane e somministrato carprofen per via sottocutanea, posizionare il topo sulla carta assorbente riscaldata con il lato dorsale rivolto verso l'alto.Applicare lubrificante per gli occhi su ciascun occhio per prevenire l'essiccazione durante l'intervento chirurgico. Dopo aver confermato l'arresto anestetico pizzicando la punta con un paio di pinze, rimuovere la pelliccia dorsale attorno al sito di incisione prospettica e pulire la pelle nuda con antisettico. Usa un paio di pinze dritte e smussate per pizzicare la pelle nuda e creare un'incisione lunga un centimetro lungo la linea mediana del corpo usando un paio di forbici sterili.Pizzicare e tenere premuto un lato del sito di taglio usando un paio di pinze sterili Adson. Quindi, utilizzando un paio di pinze sterili, curve e seghettate, separare delicatamente la pelle dalla parete del corpo, iniziando dall'incisione della linea mediana e spostandosi lateralmente. Dopo aver individuato il cuscinetto di grasso sotto il rene, utilizzare un paio di pinze sterili, dritte e smussate per pizzicare la parete del corpo direttamente sopra il cuscinetto adiposo.Crea una piccola incisione nella parete del corpo usando un paio di forbici da dissezione sterili, affilate e appuntite, facendo attenzione ad evitare i vasi sanguigni. Mentre si pizzica ancora la parete del corpo con una pinza dritta, smussata, inserire un paio di pinze sterili, smussate e curve nell'incisione e allargare l'incisione creata nella parete del corpo. Prendi il cuscinetto di grasso visibile con la pinza smussata e curva e tiralo fuori dal foro per esporre l'ovaio, l'ovidotto e l'utero.Mantenere la traccia riproduttiva esposta bloccando il cuscinetto di grasso con un morsetto sterile per bulldog. Posizionare con attenzione il topo anestetizzato con la traccia riproduttiva esposta sul palco di un microscopio da dissezione. Regolare il micromanipolatore in modo tale che l'ago per iniezione con la soluzione sia osservato al microscopio.Quindi manipolare il microscopio per osservare facilmente l'ovaio, l'ovidotto e l'utero. Utilizzando un paio di pinze sterili, affusolate, a punta ultra fine, tenere la regione dell'ovidotto da iniettare. La regione deve allinearsi con la direzione dell'ago di microiniezione.Regolare il micromanipolatore per perforare l'ovidotto con l'ago per microiniezione, alimentando contemporaneamente l'ovidotto sull'ago utilizzando la pinza affusolata a punta ultra fine. Spostare delicatamente l'ago per microiniezione per confermare che è stato inserito nell'ovidotto. Iniettare lentamente un microlitro della soluzione di iniezione e il blu di tripano filtrato al 5% nell'ovidotto, osservando il movimento della soluzione blu e l'espansione del lume dell'ovidotto.Evitare di introdurre bolle nel lume. Dopo l'iniezione, rimuovere l'ago dall'ovidotto e coprire l'area da prendere di mira con un pezzo di carta assorbente pre-imbevuto di PBS. Afferrare la carta pre-imbevuta e l'area da colpire con un paio di pinzette per elettrodi e allontanare dal corpo.Elettroporare la regione target utilizzando tre impulsi unipolari a 30 volt per 50 millisecondi con intervalli di un secondo. Dopo l'elettroporazione, rimuovere la carta assorbente e riposizionare il mouse sul termoforo. Sblocca il morsetto del bulldog e spingi con attenzione la traccia riproduttiva esposta sotto la parete del corpo.Dopo che entrambi gli ovidotti sono stati elettroporati e riposti sotto la parete del corpo, utilizzare un portaaghi per afferrare l'ago. Pizzicare e tenere premuto un lato del sito di taglio usando un paio di pinze sterili, curve e seghettate. Quindi, utilizzare il supporto dell'ago per manipolare la sutura e chiudere la ferita.Spostare il mouse in una gabbia pulita posizionata sopra una piastra elettrica e monitorare fino a quando il mouse è attivo. Dopo l'elettroporazione con elettrodi di tipo pinzetta da tre o un millimetro, l'area mirata etichettata con TdTomato è stata limitata all'epitelio dell'ovidotto distale. Con elettrodi di tipo pinzetta da tre millimetri, un'area molto più ampia delle ampolle è stata presa di mira rispetto al targeting solo della punta più distale, l'infundibulum, utilizzando elettrodi di tipo pinzetta da un millimetro.Nella regione mirata, le cellule elettroporate contrassegnate da TdTomato sono state distribuite in modo casuale tra le cellule non elettroporate. Inoltre, le cellule elettroporate erano limitate all'epitelio della mucosa e non osservate nello strato stromale o muscolare sottostante. Per confermare l'editing del genoma mediato da CRISPR, la cellula fluorescente può essere isolata mediante ordinamento FACS per l'isolamento e il sequenziamento del DNA.Questo ci permette di quantificare la frequenza degli alleli mirati traccia le comunicazioni uniche tra campione per seguire l'evoluzione coronale in vivo del tumore primario e metastasi in ambiente immunocompetente.

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