Modelli murini di ingegneria genomica somatica mediante microiniezione ed elettroporazione in vivo
5 maggio 2023
Questo protocollo descrive la microiniezione e l'elettroporazione in vivo per l'editing del genoma mediato da CRISPR limitato a livello regionale nell'ovidotto del topo.
Il protocollo presentato è un metodo altamente flessibile per la manipolazione del genoma nell'ovidotto del topo. Permette la formazione di cellule mutate sporadicamente circondate da cellule inedite all'interno di un ambiente immunocompetente. Questo è vantaggioso per studiare l'iniziazione del cancro.
Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua elevata adattabilità nel colpire un organo, un'area, una regione o un tipo di cellula di interesse con set facilmente intercambiabili di combinazioni di mutazioni, il tutto senza l'assoluta necessità di una linea di topo. Questo metodo può essere facilmente adattato per l'uso in organi con il lume e parenchima d'organo. Per iniziare, tirare un tubo capillare di vetro in una punta acuminata usando un estrattore di micropipette.
Utilizzando un paio di pinze affusolate a punta ultra fine, tagliare l'estremità appuntita del tubo capillare tirato sotto un microscopio da dissezione per creare un'apertura. Assicurarsi che l'apertura non sia troppo grande, in quanto danneggerà l'ovidotto e impedirà l'iniezione lenta. Quindi, disporre l'attrezzatura chirurgica sterile, il microscopio, il micromanipolatore e l'elettroporatore su un banco pulito e sterile o all'interno dell'armadio di biosicurezza.
Riscaldare il termoforo su un disco e posizionarlo sotto una gabbia pulita e completamente attrezzata. Versare 1X PBS sterile in una capsula di Petri. Usando un paio di forbici pulite, tagliare la carta assorbente in quadrati uno per un centimetro.
Lasciali cadere in PBS per immergerli. Quindi, collegare l'ago capillare tirato al micromanipolatore a morsetto, stabilizzato da un supporto magnetico. Pipettare due microlitri della soluzione iniettabile su una capsula di Petri sterile.
Durante l'osservazione al microscopio, prelevare lentamente da uno a due microlitri della soluzione di iniezione nell'ago di microiniezione utilizzando la siringa ad aria compressa collegata al micromanipolatore. Evitare di prendere bolle nell'ago. Dopo aver anestetizzato un topo femmina di sei-otto settimane e somministrato carprofen per via sottocutanea, posizionare il topo sulla carta assorbente riscaldata con il lato dorsale rivolto verso l'alto.
Applicare lubrificante per gli occhi su ciascun occhio per prevenire l'essiccazione durante l'intervento chirurgico. Dopo aver confermato l'arresto anestetico pizzicando la punta con un paio di pinze, rimuovere la pelliccia dorsale attorno al sito di incisione prospettica e pulire la pelle nuda con antisettico. Usa un paio di pinze dritte e smussate per pizzicare la pelle nuda e creare un'incisione lunga un centimetro lungo la linea mediana del corpo usando un paio di forbici sterili.
Pizzicare e tenere premuto un lato del sito di taglio usando un paio di pinze sterili Adson. Quindi, utilizzando un paio di pinze sterili, curve e seghettate, separare delicatamente la pelle dalla parete del corpo, iniziando dall'incisione della linea mediana e spostandosi lateralmente. Dopo aver individuato il cuscinetto di grasso sotto il rene, utilizzare un paio di pinze sterili, dritte e smussate per pizzicare la parete del corpo direttamente sopra il cuscinetto adiposo.
Crea una piccola incisione nella parete del corpo usando un paio di forbici da dissezione sterili, affilate e appuntite, facendo attenzione ad evitare i vasi sanguigni. Mentre si pizzica ancora la parete del corpo con una pinza dritta, smussata, inserire un paio di pinze sterili, smussate e curve nell'incisione e allargare l'incisione creata nella parete del corpo. Prendi il cuscinetto di grasso visibile con la pinza smussata e curva e tiralo fuori dal foro per esporre l'ovaio, l'ovidotto e l'utero.
Mantenere la traccia riproduttiva esposta bloccando il cuscinetto di grasso con un morsetto sterile per bulldog. Posizionare con attenzione il topo anestetizzato con la traccia riproduttiva esposta sul palco di un microscopio da dissezione. Regolare il micromanipolatore in modo tale che l'ago per iniezione con la soluzione sia osservato al microscopio.
Quindi manipolare il microscopio per osservare facilmente l'ovaio, l'ovidotto e l'utero. Utilizzando un paio di pinze sterili, affusolate, a punta ultra fine, tenere la regione dell'ovidotto da iniettare. La regione deve allinearsi con la direzione dell'ago di microiniezione.
Regolare il micromanipolatore per perforare l'ovidotto con l'ago per microiniezione, alimentando contemporaneamente l'ovidotto sull'ago utilizzando la pinza affusolata a punta ultra fine. Spostare delicatamente l'ago per microiniezione per confermare che è stato inserito nell'ovidotto. Iniettare lentamente un microlitro della soluzione di iniezione e il blu di tripano filtrato al 5% nell'ovidotto, osservando il movimento della soluzione blu e l'espansione del lume dell'ovidotto.
Evitare di introdurre bolle nel lume. Dopo l'iniezione, rimuovere l'ago dall'ovidotto e coprire l'area da prendere di mira con un pezzo di carta assorbente pre-imbevuto di PBS. Afferrare la carta pre-imbevuta e l'area da colpire con un paio di pinzette per elettrodi e allontanare dal corpo.
Elettroporare la regione target utilizzando tre impulsi unipolari a 30 volt per 50 millisecondi con intervalli di un secondo. Dopo l'elettroporazione, rimuovere la carta assorbente e riposizionare il mouse sul termoforo. Sblocca il morsetto del bulldog e spingi con attenzione la traccia riproduttiva esposta sotto la parete del corpo.
Dopo che entrambi gli ovidotti sono stati elettroporati e riposti sotto la parete del corpo, utilizzare un portaaghi per afferrare l'ago. Pizzicare e tenere premuto un lato del sito di taglio usando un paio di pinze sterili, curve e seghettate. Quindi, utilizzare il supporto dell'ago per manipolare la sutura e chiudere la ferita.
Spostare il mouse in una gabbia pulita posizionata sopra una piastra elettrica e monitorare fino a quando il mouse è attivo. Dopo l'elettroporazione con elettrodi di tipo pinzetta da tre o un millimetro, l'area mirata etichettata con TdTomato è stata limitata all'epitelio dell'ovidotto distale. Con elettrodi di tipo pinzetta da tre millimetri, un'area molto più ampia delle ampolle è stata presa di mira rispetto al targeting solo della punta più distale, l'infundibulum, utilizzando elettrodi di tipo pinzetta da un millimetro.
Nella regione mirata, le cellule elettroporate contrassegnate da TdTomato sono state distribuite in modo casuale tra le cellule non elettroporate. Inoltre, le cellule elettroporate erano limitate all'epitelio della mucosa e non osservate nello strato stromale o muscolare sottostante. Per confermare l'editing del genoma mediato da CRISPR, la cellula fluorescente può essere isolata mediante ordinamento FACS per l'isolamento e il sequenziamento del DNA.
Questo ci permette di quantificare la frequenza degli alleli mirati traccia le comunicazioni uniche tra campione per seguire l'evoluzione coronale in vivo del tumore primario e metastasi in ambiente immunocompetente.
Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo flessibile per l'editing del genoma mediato da CRISPR nell'ovidutto del topo, che consente mutazioni mirate in un organo specifico. Questa tecnica facilita lo studio dell'iniziazione del cancro creando cellule sporadicamente mutanti all'interno di un ambiente immunocompetente.
Componenti chiave dello studio
Area di Scienza
- Neuroscienze
- Genetica
- Oncologia
Sfondo
- La tecnologia CRISPR consente una modifica precisa del genoma.
- Il targeting di organi o tipi cellulari specifici è cruciale per studiare i meccanismi delle malattie.
- L'ovidutto del topo serve come modello per la ricerca sul cancro.
- L'elettroporazione migliora l'efficienza della consegna genica.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo per l'editing mirato del genoma nell'ovidutto del topo.
- Indagare l'iniziazione del cancro in un ambiente controllato.
- Consentire un targeting flessibile di vari tipi cellulari senza la necessità di linee di topi specifiche.
Metodi utilizzati
- Microiniezione di componenti CRISPR nell'ovidutto.
- Elettroporazione per facilitare l'editing genico.
- Uso di marcatori fluorescenti per identificare le cellule modificate.
- Isolamento delle cellule per il sequenziamento del DNA per confermare l'editing.
Risultati principali
- Iniezione e elettroporazione dell'ovidutto con successo.
- Creazione di cellule sporadicamente mutanti tra le cellule non modificate.
- Le cellule elettroporate erano limitate all'epitelio mucosa.
- Il sorting fluorescente ha confermato l'editing del genoma mediato da CRISPR.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce uno strumento robusto per studiare la funzione genica in vivo.
- Consente l'esame dei meccanismi di iniziazione del cancro.
- La flessibilità della tecnica può essere adattata per varie esigenze di ricerca.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
Somatic genome engineering via in vivo microinjection and electroporation enables rapid, region-specific genetic manipulation in immunocompetent mouse models, directly addressing the limitations of traditional germline models. This approach accelerates hypothesis-driven cancer initiation studies and supports flexible, cost-effective target validation in disease-relevant tissues. Its adaptability and precision provide strategic value for oncology discovery pipelines and translational research continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene function and pathway involvement in specific tissue microenvironments.
- Supports biological de-risking by modeling sporadic mutations within immunocompetent hosts.
- Facilitates functional target validation through regionally restricted genome editing.
- Improves predictive confidence for candidate gene prioritization in oncology portfolios.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, region-specific disease models for downstream phenotypic screening.
- Enables reproducible generation of mosaic tissues for quantitative readouts.
- Supports assay standardization by controlling mutation frequency and cell-type targeting.
- Allows scalable adaptation to different organs or cell populations with minimal colony management.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mouse models with human disease initiation sites, enhancing translational relevance.
- Enables tracking of tumor evolution and metastasis in immunocompetent settings.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by modeling clinically relevant genetic events.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation in cancer research.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and preclinical model development, bridging hypothesis testing and translational validation in oncology research.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and mechanistic de-risking by enabling targeted somatic mutations in vivo.
- Screening: Provides reproducible, region-specific models for quantitative phenotypic assays.
- Analytics: Supports quantitative measurement of mutation frequency and spatial distribution via FACS and sequencing.
- Translational Research: Models human disease initiation sites, supporting biomarker alignment and preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to multiple genes, tissues, and experimental designs without new mouse lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines model generation, reduces colony costs, and enhances reproducibility.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in oncology pipelines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of disease-relevant targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection, electroporation, and surgical techniques.
- Needs access to micromanipulators, electroporators, and FACS for cell isolation and analysis.
- Demands cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptable across organs with lumens or parenchyma, but tissue-specific optimization may be necessary.
- Mutation frequency and spatial targeting must be empirically validated for each application.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:01
Preparing Microinjection Needle, Surgery Area, Solution, and Needle for Injection
2:26
Exposing the Female Reproductive Tract
4:11
In Vivo Oviduct Injection and Electroporation
6:29
Results: Validation of Successful In Vivo Injection and Electroporation of Oviduct Epithelial Cells
7:16
Conclusion
