Rilevazione simultanea di c-Fos attivazione da mesolimbico e mesocorticali Siti Reward dopamina seguito Ingenuo zuccheri e grassi ingestione in Rats

L'obiettivo generale di questo protocollo sperimentale è determinare se il VTA e le sue principali zone di proiezione DA mesotelencefatica mostrerebbero un'attivazione coordinata e simultanea di c-Fos dopo una nuova assunzione di soluzioni di olio di mais, glucosio, fruttosio o saccarina. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurobiologia, come la motivazione, e identificare se più siti cerebrali vengono attivati in modo coordinato in risposta a stimoli appetibili. Il vantaggio principale di questa tecnica è che combina i saggi comportamentali consolidati, le tecniche di attivazione cellulare e le analisi statistiche.

Per configurare l'apparato, utilizzare una provetta da centrifuga calibrata con un tappo antifurto e un tubo da sorseggiare in metallo con angolo di 45 gradi per fornire una misurazione accurata della soluzione presentata al ratto. Fissarlo alla gabbia di casa con una molla metallica tesa e per consentire la visibilità della calibrazione. Da tre a cinque giorni prima dell'allenamento, limitare le razioni di cibo al ratto per ridurre il suo peso corporeo all'85% del suo peso originale, al fine di aumentare la motivazione a consumare la soluzione.

Nel frattempo, fornire 10 millilitri di soluzione pre-allenamento, con uno 0,2% di saccarina, all'animale per quattro giorni, in una sessione di un'ora, per massimizzare la probabilità che il ratto campiona la successiva soluzione di test con breve latenza. Pesare il tubo prima e dopo ogni sessione per ottenere la misurazione dell'aspirazione. Quindi, eseguire un test di assunzione il quinto giorno sui sottogruppi che ricevono una delle sei soluzioni.

Assicurarsi che i ratti campionano la soluzione con una latenza breve ed escludere i soggetti dallo studio se questo requisito non è soddisfatto. Per preparare il tessuto, dopo aver sacrificato l'animale, rimuovere rapidamente il cervello dal cranio. Usa i rongeur per rompere e rimuovere con cura l'osso dal cervello, iniziando da dietro in avanti.

Lavora nell'area sotto il cervelletto e assicurati che i rongeurs siano tra l'osso e la pia madre meningea. Una volta rimossa la parte superiore e i lati del cranio, usa una piccola spatola per sollevare il cervello dalla sua base e taglia i nervi cranici con piccole forbici. Quindi, fissare il cervello in una soluzione di paraformaldeide al 4% durante la notte a quattro gradi Celsius.

Il giorno successivo, metti il cervello nella soluzione di saccarosio a temperatura ambiente, fino a quando non si deposita sul fondo del contenitore. Successivamente, rimuovi il bulbo olfattivo. Successivamente, rimuovere il cervelletto e il ponte.

Quindi, montare il cervello coronalmente, con la parte caudale fissata allo stadio del microtomo, e tagliare sezioni coronali di 40 mirometri. In questa procedura, trattare le sezioni con cinque millilitri di siero di capra normale al 5% e Triton x-100 allo 0,2% in PBS, per un'ora. Successivamente, incubare le sezioni trattate con anticorpi primari a quattro gradi Celsius per 36 ore, nei pozzetti contenenti un millilitro di PBS.

Dopo 36 ore, sciacquare le sezioni tre volte con cinque millilitri di PBS per 10 minuti ogni volta. Quindi, incubare le sezioni con anticorpo secondario a temperatura ambiente per due ore, nei pozzetti contenenti un millilitro di PBS. Successivamente, sciacquare le sezioni tre volte in cinque millilitri di PBS per 10 minuti ogni volta.

Successivamente, incubare le sezioni risciacquate per due ore in una miscela di perossidasi di rafano Avidin disponibile in commercio. Dopo due ore, sciacquare le sezioni tre volte in cinque millilitri di PBS, per dieci minuti ogni volta. Successivamente, far reagire le sezioni con DAB in presenza di perossido di idrogeno, per cinque-dieci minuti.

Successivamente, etichettare due volte le sezioni di VTA incubandole con un anticorpo tirosina idrossilasi, in cinque millilitri di PBS, per una notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, sciacquare le sezioni tre volte in cinque millilitri di PBS, per dieci minuti ogni volta. Successivamente, incubare le sezioni con anticorpi secondari in cinque millilitri di PBS, a temperatura ambiente, per due ore.

Dopo due ore, sciacquare le sezioni tre volte in cinque millilitri di PBS, per dieci minuti ogni volta. Per visualizzare l'anticorpo utilizzando un complesso secondario di anticorpo perossidasi, farlo reagire con una combinazione di DAB e una soluzione di solfato di nichel allo 0,3%, per cinque-dieci minuti. Conta le celle facendo doppio clic sull'icona del software.

Vai alla barra dei menu, fai clic su Acquisizione, quindi su Immagine dal vivo. Successivamente, metti a fuoco la regione di interesse e fai clic sullo schermo per stabilire un punto di riferimento. Quindi, vai alla barra degli strumenti della griglia e fai clic su Visualizza griglia e Usa etichette griglia.

Delinea la regione di interesse con una traccia predeterminata. Quindi, conta tutte le celle in ogni regione di interesse e seleziona Più nella barra laterale sinistra per registrare i conteggi delle celle c-Fos. Si consideri una cellula positiva per c-Fos quando si osserva un cerchio rosso scuro definito.

Ripetere questo processo per ogni sito e assicurarsi che l'affidabilità tra i due valutatori non informati per ogni sezione in ogni regione di interesse sia sempre superiore a 0,8. Successivamente, conta i neuroni c-Fos positivi nelle regioni di interesse. Delineare se l'immunoreattività c-Fos è presente nelle cellule TH-positive e TH-negative nel VTA.

Questa immagine mostra che l'assunzione di grassi o zuccheri aumenta in modo differenziale l'attivazione di c-Fos nell'intera amigdala, così come nelle sottoaree dell'amigdala basolaterale e centrale-cortico-mediale. In questa immagine, l'attivazione effettiva dell'amigdala c-Fos è stata osservata negli animali esposti all'assunzione di olio di mais, glucosio e fruttosio. L'attivazione di C-Fos nel VTA è stata osservata anche in animali esposti a olio di mais e acqua.

Le frecce nere indicano le cellule c-Fos c-Fos rappresentative, con doppia marcatura, mentre le frecce grigie indicano le celle c-Fos solo rappresentative. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro settimane, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di seguire una metodologia precisa, la conservazione e il conteggio.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.