Scambio Buffer Microfluidic per senza interferenze micro / nanoparticelle cellulare Ingegneria

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di dimostrare una tecnologia di purificazione microfluidica conveniente, efficiente e ad alto rendimento, per separare le nanoparticelle libere dalle cellule, seguendo l'ingegneria cellulare con le nanoparticelle. La principale mancanza di questa tecnologia è quella di consentire la rimozione rapida ed efficiente delle nanoparticelle non legate Dopo la procedura di travaglio cellulare, raccogliamo tutte le nostre ses-fa-tion. Questa tecnologia di purificazione delle celle microfluidiche consente di ottenere un'efficiente separazione basata sulle dimensioni grazie agli effetti di focalizzazione inerziale differenziale di cellule e nanoparticelle in un microdispositivo a spirale.

Può elaborare fino a 10 milioni di cellule per mil di concentrazione, il che è molto utile per la medicina rigenerativa, nonché per l'elaborazione delle cellule in volume di latch. Questa tecnologia è molto desiderata per il campo dell'ingegneria cellulare, che spesso utilizza nanoparticelle per lavorare le cellule, per scopi di imaging o controllo della funzione. A dimostrare la procedura saranno Hui Min Tay, un assistente di ricerca del mio laboratorio, e il dottor David Yeo, un ricercatore post-medico del laboratorio del professor Xi.

Coltivare le cellule staminali mesenchimali con una confluenza superiore all'80% su una piastra a sei pozzetti prima di etichettare le cellule con le nanoparticelle. Allo stesso modo, le cellule THP-1 vengono coltivate fino a una densità di un milione di cellule per millilitro. Quindi, sciogliere un milligrammo di nanoparticelle di silice con un millilitro di soluzione di colorante di calcio duecento micromolari.

E mescola le particelle durante la notte. Inoltre, fabbricare nanoparticelle di calcio AM PLGA utilizzando i metodi descritti nel riferimento mostrato qui. Mescolare un milligrammo di nanoparticelle di calcio AM PLGA o 150 microgrammi di nanoparticelle di silice di calcio in una soluzione di poli-l-lisina allo 01% in acqua pipettando la soluzione su e giù per un minuto.

E poi lascialo incubare a temperatura ambiente per 15-20 minuti. Quindi centrifugare le nanoparticelle. Rimuovere il surnatante di poli-l-lisina in eccesso e risospendere le nanoparticelle in un millilitro del terreno di coltura appropriato per il tipo di cellula da marcare.

Aggiungere 1 milligrammo di nanoparticelle marcate a un millilitro di terreno per ogni milione di cellule in coltura. Pipettare accuratamente la miscela di cellule, nanoparticelle e terreno per un minuto. E poi incubare la miscela per circa 24 ore.

Una volta marcate, dissociare e raccogliere le cellule staminali e risospenderle a una concentrazione compresa tra 100.000 e 1.000.000 di cellule per millilitro per il trattamento microfluidico. Utilizzare cellule THP-1 marcate alla stessa concentrazione. Per fabbricare il dispositivo a spirale microfluidica, preparare prima uno stampo master per wafer in silicone utilizzando tecniche di microfabbricazione standard.

Quindi, mescolare accuratamente 30 grammi di prepolimero PDMS di base e tre grammi di un agente indurente in una barca di pesatura. Degasare il composto sottovuoto per 60 minuti per eliminare eventuali bolle d'aria. Versare la miscela PDMS sullo stampo master, modellato con il design del canale a spirale, con cura a un'altezza compresa tra cinque e 10 millimetri.

Quindi degassare la miscela per 60 minuti per eliminare eventuali bolle d'aria. Ripetere questo processo fino a quando tutte le bolle non sono state eliminate. Quindi, posizionare il wafer in un forno e assicurarsi che il wafer non sia inclinato durante l'indurimento, per garantire un'altezza costante del dispositivo.

Polimerizzare il PDMS a 80 gradi Celsius per due ore. Una volta raffreddato, ritagliare il dispositivo a spirale PDMS utilizzando un bisturi e staccare con cura la lastra PDMS dallo stampo master. Quindi, utilizzare un bisturi per tagliare i bordi del dispositivo per garantire una superficie liscia per l'incollaggio.

Quindi, utilizzare un punzone per biopsia da 1,5 millimetri per creare due fori per gli ingressi e due fori per le uscite. Lavare il dispositivo con isopropanolo per rimuovere eventuali detriti. E asciugare il dispositivo in un forno a 80 gradi Celsius per cinque minuti.

Quindi, utilizzare del nastro adesivo per pulire la superficie inferiore del dispositivo PDMS e un lato di un vetrino. Posizionare con cautela il vetrino e il dispositivo PDMS in una camera al plasma con le superfici pulite esposte. Accendere l'alimentazione del plasma al massimo, abbassare la pressione della camera fino a quando la camera non diventa di colore rosa ed esporre i componenti per 60 secondi.

Quindi, rimuovere il vetrino e il dispositivo PDMS dalla camera. E uniscili insieme premendo strettamente insieme le superfici esposte al plasma. Assicurarsi che non vi siano bolle intrappolate tra le due superfici.

Riscaldare il dispositivo incollato su una piastra riscaldante impostata a 80 gradi Celsius per due ore per rafforzare il legame. Tagliare due pezzi di tubo lunghi da 15 a 20 centimetri per gli ingressi e attaccare un ago calibro 23 su un'estremità di ciascun tubo. Quindi, taglia due pezzi dello stesso tubo che sono lunghi da cinque a 10 centimetri per le prese e attaccali ai fori di uscita del dispositivo.

Prima di eseguire il campione, adescare manualmente il dispositivo con una siringa contenente il 70% di etanolo fino a quando non fuoriesce dal tubo di uscita. Lasciare riposare l'etanolo nel dispositivo per almeno 30 secondi per sterilizzarlo. Quindi, caricare 30 millilitri di PBS filtrato con l'1% di BSA in una siringa da 60 millilitri.

Inoltre, caricare tre millilitri di cellule marcate in una siringa da tre millilitri e controllare che non vi siano bolle d'aria intrappolate in nessuna delle siringhe. Rimuovere eventuali bolle d'aria espellendo delicatamente alcune gocce di liquido dall'ugello. Collegare le punte della siringa di ingresso e il tubo alle siringhe e fissare le siringhe alle pompe a siringa.

Inserire i tubi nei rispettivi ingressi del dispositivo e assicurarsi che non vi siano bolle lungo il tubo. Con la fluidica ora configurata, montare il dispositivo su un microscopio a contrasto di fase invertito per l'imaging in tempo reale durante il processo di selezione delle cellule. Fissare un piccolo becher per rifiuti e due provette da 15 millilitri vicino al dispositivo sul tavolino del microscopio.

Posizionare il tubo di uscita da entrambe le uscite del dispositivo nel becher dei rifiuti. Ora, impostare il rapporto di flusso tra il campione e il tampone della guaina da uno a 10 impostando la velocità di flusso della siringa del campione a 120 microlitri al minuto e della siringa della guaina a 1.200 microlitri al minuto. Far funzionare il dispositivo per un minuto e mezzo per dare alla portata la possibilità di stabilizzarsi.

Utilizzare una telecamera ad alta velocità per confermare la presenza di celle focalizzate inerzialmente vicino alla parete interna del canale in campo chiaro con contrasto di fase. Una volta raggiunto il flusso allo stato stazionario e il dispositivo funziona correttamente, posizionare i tubi di uscita in fiale diverse per raccogliere gli eluenti separati dall'uscita della cella e dall'uscita di scarico. Questo dispositivo è in grado di selezionare correttamente una sospensione marcata di cellule monocitiche THP-1 da nanoparticelle di silice fluorescente.

Sono state ottenute elevate efficienze di separazione, come confermato sia dall'imaging ad alta velocità che dall'analisi della citometria a flusso. La strategia di purificazione in un'unica fase consente il recupero continuo di una sospensione marcata e di cellule aderenti sospese in una soluzione tampone fresca senza la necessità di centrifugazione. Il dispositivo è in grado di separare ad alta efficienza sia con nanoparticelle di silice che con nanoparticelle di PLGA e può separare fino a 10 milioni di cellule per millilitro con la stessa elevata efficienza.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come etichettare le cellule con nanoparticelle. E come purificare le cellule marcate rimuovendo le particelle non legate in eccesso utilizzando il nostro dispositivo microfluidico specializzato.