Un test immunologico basato su nanoparticelle magnetiche utilizzando un dispositivo microfluidico

Prendete un dispositivo microfluidico fissato a un tavolino da microscopio, comprendente un ingresso per l'erogazione dei reagenti, canali interconnessi per il flusso del fluido e uscite per lo spurgo dei fluidi.

Il canale principale contiene una restrizione centrale sfalsata con microparticelle di ferro aggregate intrappolate.

I canali vengono incubati con una soluzione bloccante per prevenire il legame di anticorpi non specifici.

Far scorrere un tampone di lavaggio, rimuovendo la soluzione bloccante in eccesso.

Introdurre una sospensione di immunocomplesso a una velocità di flusso definita. L'immunocomplesso è costituito da nanoparticelle magnetiche, rivestite con antigeni legati ad anticorpi primari, che sono ulteriormente legati ad anticorpi secondari coniugati con perossidasi.

Applicare un campo magnetico esterno, magnetizzando le microparticelle aggregate e trasformandole in una trappola magnetica per la cattura degli immunocomplessi.

Introdurre un substrato fluorogenico che viene convertito dalla perossidasi in un prodotto fluorescente e scorre attraverso la trappola.

Utilizzando il microscopio, confrontare la fluorescenza prima e dopo la trappola, confermando la cattura degli immunocomplessi.

Riempire i canali con acqua distillata utilizzando una siringa. Immergere il dispositivo in un bagno a ultrasuoni per 10 minuti. Quindi, svuotare l'acqua all'interno dei canali del dispositivo e utilizzare una siringa per introdurre la soluzione BSA al 5%.

Preparare una sospensione di microparticelle di ferro del diametro di 7,5 micrometri al 5% BSA. Incubare il chip e la sospensione di microparticelle con la soluzione bloccante per almeno 1 ora a temperatura ambiente. Quindi, inserire le microparticelle nel chip con un ago da siringa attraverso il tubo di uscita del canale laterale.

Posizionare il chip verticalmente, quindi ruotare il chip in due fasi di 90 gradi in modo che le microparticelle mirino e si compongano alla restrizione di 5 micrometri. Sigillare tutti i tubi flessibili del dispositivo acrilico con il calore. Tagliare il tubo di alimentazione fino a quando non rimangono solo pochi millimetri.

Riempire l'ago di erogazione con il tampone di lavaggio e inserirlo nel tubo di taglio. Lasciare gocciolare la soluzione, quindi collegare l'ago al dispositivo. Tagliare il tubo di uscita dal canale laterale, quindi collegarlo alla pompa a siringa. Quindi, ripetere la stessa procedura per il tubo di uscita del canale principale, quindi collegare il chip al magnete.

Per la rilevazione immunologica, mantenere il tampone di lavaggio in flusso per 10 minuti a 50 microlitri all'ora. Rimuovere il tampone di lavaggio rimanente dall'ago di erogazione con una micropipetta e aggiungere 50 microlitri di sospensione di nanoparticelle. Far scorrere la sospensione di nanoparticelle per 7 minuti a una velocità di flusso di 100 microlitri all'ora. Quindi, modificare la portata a 50 microlitri all'ora e continuare il flusso per altri 15 minuti.

Sostituire l'ago di erogazione e far scorrere il tampone di lavaggio per 10 minuti alla stessa velocità. Rimuovere il tampone di lavaggio rimanente dall'ago di erogazione con una micropipetta e aggiungere 100 microlitri di substrato fluorogenico. Regolare la portata e i parametri temporali per l'input del substrato, la misurazione della fluorescenza e la fase di lavaggio.

Attivare il flusso di ingresso del substrato fluorogenico per 6 minuti a 50 microlitri all'ora. 15 secondi prima che il flusso del substrato si interrompa, attivare la fluorescenza del microscopio. Avviare l'acquisizione dell'immagine con il software della fotocamera del microscopio 10 secondi prima che il substrato si fermi con un tempo di esposizione di 1.000 millisecondi.

Fare clic sul pulsante di avvio del parametro di portata desiderato subito dopo l'arresto del lavaggio del substrato. Eseguire l'imaging per 6 minuti a un fotogramma al secondo. Fare clic sul pulsante di avvio del flusso di lavaggio subito dopo l'arresto del flusso di misurazione selezionato.