Name: Perle di separazione e celle a multi-canale dispositivi Microfluidic Utilizzando dielettroforesi e flusso laminare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-04T18:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Impara a manipolare e separare cellule e perle in dispositivi microfluidici utilizzando dielettroforesi con schede a circuito stampato. Questo metodo offre un approccio pratico per la manipolazione senza contatto di particelle.

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Esprimiamo apprezzamento per Woo-Jin Chang per fornire i canali trifurcating per DEP attuazione e di Mitchell Collens per la sua assistenza nella configurazione del dispositivo. Il lavoro è stato sostenuto dagli Stati Uniti attraverso la concessione OISE NSF-0951647 e da Taiwan NSC attraverso Concessione 99-2911-1-002-007.

Uno schema generale della installazione delle attrezzature è mostrato nella Figura 1A. Il PCB-campione di assemblaggio è ulteriormente dettagliato in una sezione trasversale schematica in Figura 1B. 1. Preparazione di elettrodi PCB: <ol><li> PCB Design elettrodi alla geometria desiderata per generare una non uniforme campo elettrico. Personalizzati chip elettrodo PCB possono essere ordinati attraverso impianti di fabbricazione commerciale (Figura 1C). </li><li> Preparare prefabbricati PCB elettrodi per saldatura 16-gauge filo fino alla fine di ciascun elettrodo metallico stampato (Figura 1D). <ol><li> Posizionare il filo sull'estremità dell'elettrodo. Tenere il filo in posizione sulla superficie metallica del PCB con il saldatore per scaldare il filo. </li><li> Alimentare una piccola quantità di saldatura in filo riscaldato per riempire il filo di saldatura. </li><li> Dopo che il filo è pieno di saldatura, rimuovere il saldatore, tenendo il filo in posizione durante la saldatura si raffredda. </li></ol></li><li> Ripetere il processo di saldatura per ogni connessione elettrica sul PCB (Figura 1D). </li></ol> 2. Preparare Canali Microfluidic: <ol><li> Polidimetilsilossano canali microfluidica (PDMS)-base sono preparati utilizzando l'elastomero PDMS, Sylgard 184 di Dow Corning. Uno stampo master che definisce i canali di solito è creato attraverso processi di microfabbricazione standard con un wafer di silicio e SU-8 photoresist. </li><li> Mix composto base e catalizzatore in un rapporto di 10:1 per 5 minuti. </li><li> Versate il liquido PDMS sul SU-8 prefabbricati stampo master e rimuovere le bolle d'aria esponendo liquido PDMS a vuoto per qualche minuto. Ripetere il processo di vuoto, se necessario, per rimuovere completamente tutte le bolle. </li><li> Curare il PDMS a 70 ° C per 2 ore. </li><li> Rimuovere lastra PDMS con canali microfluidica dal wafer con una lametta, attenzione a non rompere wafer. </li><li> Dei buchi per l'introduzione di liquidi e le cellule nel dispositivo microfluidica. (Nota: Siringa di pompaggio, gravità o di tensione superficiale del flusso base possono essere utilizzati con DEP). </li><li> Ispezionare il dispositivo a microfluidi per assicurarsi che sia privo di polvere e detriti. Pulizia del PDMS può essere facilmente realizzato utilizzando 3M Scotch Magic Tape. </li><li> Plasma il legame PDMS canali microfluidica per un ambiente pulito No.0 spessore (80-130 micron) coprioggetto. Riscaldare il coprioggetto-microfluidico montaggio a 100 ° C per un minimo di 15 min. </li></ol> 3. Preparare bassa conducibilità Media: <ol><li> Bassa conducibilità media è preparata mescolando 8,5% di saccarosio + glucosio 0,3% (w / v) in acqua deionizzata (DI) 1. Nota:. Abbiamo già dimostrato che le cellule possono essere coltivate per giorni sui media tradizionali di coltura cellulare dopo essere stato esposto a bassa conducibilità per brevi periodi (circa 30 min) 11 </li></ol> 4. Montare Canali Microfluidic Onto Elettrodi PCB: <ol><li> Mettete una piccola quantità (circa 10 mL) di olio minerale sul PCB per garantire un contatto stretto tra il PCB e il coprioggetto. Nota: Un passo opzionale per ridurre la visualizzazione elettrodo è per rivestire la superficie del circuito stampato con uno strato molto sottile di pennarello indelebile nero o vernice. </li><li> Posizionare il coprioggetto-microfluidico assemblaggio canale sul PCB oliato, con contatto coprioggetto formando con l'olio (coprioggetto in basso). Premere delicatamente il copri-microfluidica montaggio che garantiscano un buon contatto e di ridurre al minimo le bolle d'aria che possono compromettere la visualizzazione delle cellule e tallone. Un esempio di dispositivo completato è mostrato nella Figura 1D. </li></ol> 5. Ordinare e concentrato Perline e cellule utilizzando DEP: <ol><li> Riempire i canali microfluidica con acqua deionizzata o bassa conducibilità media, il processo di incollaggio plasma facilita il facile caricamento di soluzioni acquose nei canali microfluidici temporaneamente per rendere la superficie idrofoba normalmente PDMS idrofilo. </li><li> Introdurre cellule e / o perle di polistirene nel serbatoio canale (Figura 1C). Qui usiamo l'adenocarcinoma del colon umano (HT-29) le cellule. </li><li> Collegare l'uscita di un generatore di funzioni per l'ingresso di un amplificatore di rete e poi collegare l'uscita dell'amplificatore per i fili degli elettrodi. Coprire tutti i fili elettrici e le superfici della configurazione con del nastro isolante per proteggere gli utenti dalla potenziale esposizione agli urti. Un diagramma schematico della configurazione apparecchiatura è mostrato nella Figura 1A. </li><li> Impostare il generatore di funzioni per produrre un output a onda sinusoidale pari a 1,0-1,5 Mhz. L'ampiezza della produzione deve essere regolata per l'amplificatore di potenza RF di produrre una potenza di 80-100V al PCB. L'amplificatore di potenza RF in questo lavoro richiede una tensione di ingresso intorno 220-330 mV. Di separare le cellule e perline, il tasso di flusso laminare devono essere conformi con la forza DEP per spostare le cellule e perline all'interno del canale principale (larghezza w = 100 micron, altezza h = 27 micron) nei canali di destinazione (larghezza w = 100 micron , altezza h = 27 micron). Attenzione: consultare con il produttore di PCB per determinare la mtensioni di funzionamento aximum per evitare problemi come il surriscaldamento PCB o di fusione. Controllare le specifiche dei costruttori di apparecchiature 'per il generatore di funzioni e produttori di amplificatori di potenza per stabilire le impostazioni di funzionamento sicuro. </li><li> Avviare DEP alle cellule ordinare e perline. Cellule esperienza positiva-DEP mentre perle di polistirene esperienza negativa-DEP in modo non uniforme campo elettrico all'interno delle frequenze specificato. Ciò consente DEP-force-attivati ​​bioactuation e separazione di cellule e di altre particelle all'interno di dispositivi microfluidici utilizzando PCB accessibile e riutilizzabile come elettrodi. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Quando DEP è efficace a cellule di azionamento o di particelle, un allineamento robusto all'interno dei campi elettrici non uniformi si osserva per i bagni statici o velocità del fluido lento. In condizioni di velocità del fluido superiore, il comportamento delle cellule o di particelle dipende dall'orientamento relativo del flusso assiale al campo elettrico e la velocità del flusso. Inoltre, i comportamenti delle cellule e particelle dipendono anche l'intensità di campo elettrico e il grado di non uniformità all'interno del campo elettrico. Comportamenti tipici di cellule o particelle includono 'catene di perla,' bicicletta, stallo o di svolta. Condizioni che compromettono o abolire DEP comprendono la presenza di sali o di altre molecole nel liquido ionico, debole intensità del campo elettrico, velocità di flusso eccessivo, coprioggetto che sono troppo spesse, o soluzioni conduttivo tra il coprioggetti e gli elettrodi PCB (ad esempio un coprioggetto incrinato può indurre la miscelazione di acqua e olio minerale). Qui, quando si usa No.0 coprioggetto spessore (80-130 micron) e un elettrodo di distanza (231 micron), la pendenza del quadrato dell'intensità del campo elettrico applicato alle cellule HT-29 e perline è stimata essere tra 2 -8 a 6 -8 V 2 / 3 micron 1. La forza DEP può essere stimata misurando la velocità della particella, manipolato da DEP in un fluido statico (Figura 2A-B). A causa della bassa inerzia della particella e l'ambiente altamente viscosi del canale microfluidica, la forza di resistenza idrodinamica sarà uguale a, ma in direzione opposta con la forza DEP. La velocità media tallone nella bassa conducibilità media è 34,5 micron / s con una tensione di 93 Vpp DEP e 1,5 Mhz. La forza di resistenza idrodinamica può essere calcolato con la seguente formula 1. F = trascinare 6πηRv La media viscosità η della bassa conducibilità media a 20 ° C è 1,27 mPa • s e il raggio R tallone è di 7,5 micron. La forza di resistenza idrodinamica per la microbead polistirolo è stimato in 6,19 pN. Per dimostrare la capacità di azionare perline all'interno dei canali microfluidica (Figura 2C-F), abbiamo iniziato il flusso dei mezzi di comunicazione a bassa conducibilità con l'impiego della tensione superficiale del flusso mediata. La velocità media tallone nel canale d'ingresso singolo è stato 1.540 micron / sec, mentre la velocità media all'interno dei singoli canali è stata ridotta a 565 micron / sec (Figura 2C). Avviando DEP, le perle sono state mantenute all'interno del canale centrale invece di essere rilasciato nel canale laterale. Così, in queste condizioni, le forze DEP sono stati sufficienti per superare la forza di resistenza del fluido nei due canali laterali. Lo stesso principio è stato utilizzato anche per deviare le perle dal cannel centrale di un canale laterale singolo semplicemente cambiando l'orientamento dei canali e il flusso tallone a quella degli elettrodi DEP (Figura 2E-F). Da pesca l'elettrodo metallico sul lato del canale di ingresso singolo, quando DEP è stato avviato, le perle sono stati guidati a lato del canale, come le perline avvicinato ad un punto triforcazione. Qui, le forze DEP sono stati sufficienti per tirare le palline in uno dei canali laterali dove il flusso laminare continuato a spingere giù il canale (Figura 2F). Poiché le cellule e di perle di polistirene sono notevoli differenze nella loro capacità di essere polarizzata e azionato in campi elettrici non uniformi, si usa DEP per dimostrare la capacità di eseguire on-chip di separazione delle cellule e perline, contemporaneamente. Abbiamo utilizzato la stessa struttura del canale microfluidica ed elettrodi PCB come configurato nella Figura 2E-F, ma ha introdotto una sospensione di cellule HT-29 e perline in condizioni di scarsa conduttività dei media nel canale d'ingresso singolo (Figura 3). Quando DEP è introdotto, e in queste condizioni, l'HT-29 cellule sono state conservate nei due canali di uscita a sinistra, mentre le perle sono state mantenute nel canale di uscita individuale sulla destra. Qui le cellule mostrano il comportamento di un caratteristico 'perla-chaining' come sono raccolti nel canale di uscita a sinistra. Occasionalmente un cordolo e la cella si attaccano insieme in cui sono raccolti insieme, spesso in canali di uscita della cellula. Da questo esperimentoAl dati, determinare il tasso di smistamento da 713 particelle (cellule e perline) al minuto, o l'equivalente di 14.260 cellule e perline in 20 minuti. Il numero di cellule e perline recuperate è rilevante e utile per la biologia molecolare, imaging, biochimici e lab-on-a-chip. <img src="/files/ftp_upload/2545/2545fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. PCB a base di DEP di cellule e particelle nei canali microfluidica. (A) L'impostazione attrezzature per Protezione esecuzione programmi a base di actuation inizia con un generatore di funzioni per definire la frequenza e l'ampiezza del segnale elettrico, poi un amplificatore di potenza per aumentare la potenza del segnale della campo elettrico generato sul PCB. (B) L'assemblea dispositivo a microfluidi per l'azionamento del campione è costituito da PDMS canali microfluidica irreversibilmente legato a un no. 0 spessore coprioggetto (80-130 micron) attraverso plasma di ossigeno, non conduttivi per fare il bagno delle cellule e / o perline. (C) Gli elettrodi PCB usati qui sono composti da due regioni in cui sono interdigitati gli elettrodi per generare una forte non uniforme campo elettrico. (D) Il dispositivo completato: un PCB con un dispositivo suddivise ancora microfluidi su un unico vetrino, inserto mostra tutto il dispositivo con i fili degli elettrodi. (CD) Per le dimensioni, le misure PCB sono 8.4 cm (l), 2.1 cm (w), con 5 mm di larghezza elettrodi. <img src="/files/ftp_upload/2545/2545fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Immagini rappresentative delle cellule e perline nei canali prima e durante la DEP attuazione. (A) 15 perle di polistirene micron fluorescente in una soluzione a bassa conducibilità-media all'interno di un canale microfluidica PDMS, senza flusso laminare (tempo trascorso, 1.23 sec). (B) Al momento della DEP iniziazione, le perle migrare verso modelli di elettrodi del PCB (strisce nere), piuttosto che tra gli elettrodi (tempo trascorso, 8,18 sec). (C) Perle nei canali stessi sotto flusso laminare sono divisi tra i tre canali separati (tempo trascorso, 5.3 sec), quando il DEP è iniziato (D), le perle vengono azionati a fluire solo nel canale centrale (tempo trascorso, 4.3 sec). (E) Cambiando l'orientamento dei canali agli elettrodi PCB, sfere possono essere dirette in modo differenziale nei canali laterali (F) con DEP, piuttosto che il canale centrale come mostrato in (D). (EF) Tempo trascorso è 8.23 ​​sec e 5.16 sec, rispettivamente. Tutte le barre di scala = 100 micron. <img src="/files/ftp_upload/2545/2545fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Immagini rappresentative delle cellule e perline nei canali prima e durante la DEP attuazione. (AB) Prima di iniziare il DEP, una soluzione mista di adenocarcinoma del colon umano (HT-29) le cellule e il flusso di perle da un canale a 3 canali di uscita separati. La freccia aperta indica la direzione del flusso laminare e canali sono delineati con linee tratteggiate per l'orientamento e chiarimenti. (CD) Con DEP inducendo, perline e selettivamente le cellule sono azionati in canali separati individuate. HT-29 cellule uscire dal canale centrale e di sinistra, mentre perle di uscire dal canale destro. Concatenamento perla caratteristica di perline e cellule si osserva durante la Protezione esecuzione programmi di attuazione. (A, C) Interferenza di imaging differenziale di contrasto di cellule e perline in microcanali rende le perle facilmente visibile. Glow immagini intensità di scala (B, D) delle immagini stesse DIC (A, C) migliorare la visualizzazione delle cellule nei canali. Gli elettrodi di metallo riflettente ((A, C) striscia di luce e (B, D), giallo e verde) forniscono un punto di riferimento importante per l'allineamento microcanali agli elettrodi per una efficace funzionalità Protezione esecuzione programmi a base di attuazione. Barre di scala = 100 micron.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Manipolazione cellulare a dispositivi microfluidici è auspicabile per l'ordinamento o il posizionamento selettivo di singole cellule o per studi di popolazione. 2 a flusso laminare viene utilizzato in combinazione con valvole e pompe di manipolare le cellule all'interno di dispositivi microfluidici. Tuttavia, questi metodi da soli sono impegnativi e richiedono processi di fabbricazione dettagliato e abilità 3 centrifugazione può semplificare le richieste per il posizionamento delle cellule, ma di immagini simultanee è una sfida;. Inoltre, l'architettura canale per centrifugazione deve essere considerato con attenzione nella progettazione del manipolazioni desiderato e considerando gli effetti di forze centripete. 4 pinzette laser può essere utilizzato per il posizionamento delle cellule, ma il metodo è costoso e non suscettibili di high-throughput separazione delle cellule. 5 Eppure, la DEP ha dimostrato come un efficace sistema di "pinzette elettriche" per il posizionamento efficace delle cellule, la caratterizzazione e la manipolazione. 6,7 In particolare, DEP è stato utilizzato per catturare selettivamente le cellule e ordinare on-chip per l'elaborazione di vivere e di cellule morte, 7-10 e per la raccolta di cellule su sensori di risonanza per la misura della massa cellulare. 11 Abbiamo precedentemente dimostrato che aumentando la DEP vigore batteri o perline di sopra della forza di resistenza fluidico, l'on-chip concentrazione e la cattura di perle di polistirene e Listeria monocytogenes V7 può essere realizzato. 12 popolazioni miste di E. coli e L. batteri monocytogenes può anche essere diretto e rilasciato attraverso impulsi DEP. Inoltre, le particelle più grandi possono essere catturati in modo differenziato e concentrato sugli elettrodi in base alle dimensioni delle particelle di grandi dimensioni, mentre le particelle più piccole non sono di cattura, ma vengono rimossi con il flusso fluido. 13 Quando le forze di Protezione esecuzione programmi non superano le forze fluidico trascinando le particelle, il tallone o cella non viene catturato, ma piuttosto spostato all'interno del flusso fluido. Come mostrato nella Figura 2C, sfere possono essere concentrati nella regione centrale del flusso di liquido sufficiente a mantenere le perline nel canale centrale. Questo potrebbe essere dovuto all'effetto combinato di particelle a particelle influenze all'interno del campo elettrico, velocità del fluido superiore DEP forze trascinamento, la combinazione di questi, o qualche altro effetto indefinito. Più recenti progressi nella DEP contactless permettono di massimizzare la cattura e la manipolazione delle cellule con il campo minimo richiesto, proteggendo così i tipi di cellule, nella maggior misura, durante la manipolazione DEP. 1,9 contatto promessa DEP offre alla comunità microfluidica per l'ordinamento, la raccolta e il posizionamento delle cellule all'interno di dispositivi microfluidici. Ci aspettiamo che con l'aumento della domanda per, l'attuazione, il DEP per la manipolazione all'interno di dispositivi microfluidici, ulteriori scoperte e innovazioni espandere la comprensione e l'influenza delle forze DEP. PCB può essere prodotto attraverso processi ad alto volume ad un prezzo accessibile, con un tempo di risposta rapido di fabbricazione, che li rende buoni piattaforme per la commercializzazione. Inoltre, i PCB sono facili da usare e accessibile per gli scienziati in una vasta gamma di discipline per le on-chip manipolazioni delle cellule e l'ordinamento. Nel progettare la superficie degli elettrodi PCB, occorre tenere in considerazione nella posizione desiderata particella / cellula traiettoria. I fattori chiave per l'esame includono la dimensione delle particelle e tipo (perline e / o cellulare), tipo di cellula, la dimensione a microcanali, velocità di flusso, distanza tra gli elettrodi (che determina l'intensità di campo elettrico), spessore coprioggetto, e la conduttività dei fluidi. Questi fattori influenzano la forza necessaria e disponibile per manipolare la particella o cellula, e in ultima analisi, l'efficienza di separazione. Il nostro protocollo presentato qui dimostra una configurazione efficace per l'avvio di Protezione esecuzione programmi per microsfere e la separazione delle cellule. Per potenziali applicazioni, gli utenti dovrebbero corrispondere l'architettura del disegno canale microfluidica con i percorsi di flusso desiderato per le cellule e perline, così come i modelli di elettrodi per ottimizzare l'efficienza per ogni applicazione. Distanza tra gli elettrodi e lo spessore coprioggetto può essere utilizzato secondo le linee guida precedentemente riportati durante la progettazione del layout microfluidica canale 1. La conducibilità e la permettività della cellula / particella e dei media circostante deve essere abbastanza differenti da facilitare DEP positivo o negativo, pur mantenendo intatte le cellule. La polarità di Protezione esecuzione programmi per una particella sferica può essere determinato dalla parte reale di un valore complesso delle seguenti Clausius-Mosotti fattore alla frequenza ω della tensione DEP. <img src="/files/ftp_upload/2545/2545eq1.jpg" alt="Equazione 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equazione 1"> Equazione 1 In questa equazione ε, è permittività, σ è la conducibilità, e ε * è permettività complessa. Gli indici p e mdenotano la particella e dei media, rispettivamente. Quando una cellula ha una permittività superiore alla media, o la parte reale del Clausius-Mosotti diventa fattore positivo, la particella diventa più polarizzato rispetto ai media circostante. A causa di una non uniforme campo elettrico, la polarizzazione della particella diventa non uniforme e questo crea un DEP positivo (+ DEP) forza che trae la cellula verso la regione con maggiore intensità del campo elettrico. Se una cellula ha una permittività inferiore a quella media circostante, o la parte reale del Clausius-Mosotti fattore diventa negativo, subirà DEP negativo (-DEP), e la cellula è costretta verso la regione di campo minima. Se la cella e dei media hanno circa la permittività stesso complesso, nessuna forza può essere generata per manipolare le cellule. Per questo motivo, l'acqua pura è un supporto preferito per la manipolazione di particelle DEP. Tuttavia, per evitare lo stress osmotico sulla cella da acqua pura, media bassa conducibilità è stato formulato per mantenere inalterata la conducibilità, ma per aumentare osmolarità per diminuire lo stress osmotico alle cellule. Tradizionali terreni di coltura cellulare o tamponi fisiologici, come DMEM o PBS, hanno alta conducibilità, che non è adatto per la manipolazione DEP. Abbiamo anche precedentemente dimostrato che le cellule possono essere catturati su sensori con DEP con bassa conducibilità media. Dopo un breve periodo per l'attacco delle cellule, i media bassa conducibilità può essere sostituito per il supporto richiesto colture cellulari a supportare la crescita delle cellule per giorni 11. Dalla nostra esperienza, perline fluorescenti sono molto luminose rispetto alla fluorescenza delle cellule vive, quindi può essere una sfida per abbinare l'intensità tallone per l'intensità di una cellula vivente e fluorescenti. Per migliorare la visualizzazione di entrambe le celle e le perline, abbiamo usato la microscopia DIC un microscopio verticale per l'imaging entrambi. Per visualizzare le celle e perline, abbiamo presentato i dati in un'immagine intensità luce scala, che conserva i dati in un ampio spettro di colori per facilitare la visione. Così, quando si progetta lo studio di interesse, i parametri di imaging e le risorse devono essere considerati. In sintesi, abbiamo dimostrato la possibilità di azionare perline e selettivamente le cellule in canali separati con DEP. Con l'utilità sempre maggiore di canali microfluidica per la biologia cellulare, biochimica e le applicazioni della bioingegneria, DEP è un'opzione auspicabile per la raccolta delle cellule, il posizionamento e l'ordinamento. La fabbricazione PCB elettrodi è economico e conveniente, gli elettrodi sono facili da usare, ei tempi di realizzazione rapidi sono ideali per l'attuazione del DEP.

<table><tbody><tr><td>Kit Sylgard 184 (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>Dow Corning Sylgard</td></tr><tr><td>Filo di rame 16 awg</td><td>Belden</td><td>8521</td><td>(Tipo MW) Mil-W-76C-PVC</td></tr><tr><td>Vetro sigillato in oro</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>260320</td><td>Spessore n. 0, 24 x 60 mm</td></tr><tr><td>Punzone da biopsia Miltex</td><td>VWR international</td><td>95039-104</td><td>Miltex, dimensioni assortite</td></tr><tr><td>Elettrodi personalizzati su PCB</td><td>Bay Area Circuits</td><td>Componenti personalizzati</td><td></td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Fisher Scientific</td><td>O121-1</td><td></td></tr><tr><td>Acqua deionizzata</td><td>Alimentazione idrica deionizzata in loco</td><td>Nessuno</td><td>Utilizzare acqua deionizzata filtrata</td></tr><tr><td>D-Glucosio anidro granulare AR</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>4912-06</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio, cristallino</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>8360-06</td><td></td></tr><tr><td>Microsfere polimeriche fluorescenti</td><td>Bangs Laboratories</td><td>FS07F/9277</td><td>Microsfere verdi Dragon da 15&amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>Linea cellulare HT-29</td><td>ATCC</td><td>HTB-38D</td><td>Adenocarcinoma del colon umano</td></tr><tr><td>Tripsina 0,05% EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio eretto Eclipse E600FN</td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse E600FN</td><td></td></tr><tr><td>Telecamera per immagini ad alta velocità Phantom V310</td><td>Phantom</td><td>V310</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio eretto da ricerca BX51</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Telecamera SpotFlex a colori ad alta risoluzione</td><td>Diagnostic Instruments</td><td>FX1520</td><td></td></tr><tr><td>Generatore di funzioni</td><td>Agilent Technologies</td><td>3325A</td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore di potenza RF</td><td>EIN</td><td>2100L</td><td></td></tr></tbody></table>

perle di separazione e celle a multi-canale dispositivi microfluidic utilizzando dielettroforesi e flusso laminare

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Dispositivi microfluidici hanno avanzato studi sulle cellule, fornendo un ambiente dinamico fluidico sulla scala della cellula per lo studio, manipolazione, selezione e conteggio delle cellule. Tuttavia, la manipolazione della cella all&#39;interno del dominio fluidico rimane una sfida e richiede protocolli di fabbricazione complicato per le valvole di formazione ed elettrodi, o richieste attrezzature speciali come pinzette ottiche. Qui, abbiamo dimostrato che convenzionali circuiti stampati (PCB) possono essere utilizzati per la non-contatto manipolazione di cellule utilizzando dielettroforesi (DEP) per la manipolazione delle cellule tallone e in campi a flusso laminare per bioactuation, e per la separazione delle cellule e perline in microfluidica multicanale dispositivi. In primo luogo, vi presentiamo il protocollo per il montaggio degli elettrodi DEP e dispositivi microfluidici, e preparare le cellule per DEP. Poi, ci caratterizzano l&#39;operazione DEP con perle di polistirene. Infine, mostriamo i risultati rappresentante della separazione tallone e cellulare in un dispositivo multicanale microfluidica. In sintesi, DEP è un metodo efficace per la manipolazione di particelle (granuli o cellule) all&#39;interno di dispositivi microfluidici.

Dielettroforesi (DEP) è un metodo efficace per manipolare le cellule. Circuiti stampati (PCB) in grado di fornire elettrodi economico, riutilizzabile ed efficace per il contatto senza manipolazione cellulare all&#39;interno di dispositivi microfluidici. Grazie alla combinazione di canali microfluidica PDMS-based con coprioggetto sul PCB, dimostriamo la manipolazione tallone e cellulare e di separazione all&#39;interno multicanale dispositivi microfluidici.

Perle di separazione e celle a multi-canale dispositivi Microfluidic Utilizzando dielettroforesi e flusso laminare

I dispositivi microfluidici hanno fatto progredire gli studi cellulari fornendo un ambiente fluidico dinamico su scala cellulare per lo studio, la manipolazione, lo smistamento...

L'obiettivo generale di questa procedura è manipolare cellule e microsfere all'interno di dispositivi microfluidici utilizzando l'elettroforesi dielettrica, o DEP, mediante schede a circuito stampato (PCB). Questo risultato si ottiene innanzitutto progettando e preparando gli elettrodi in PCB e i canali microfluidici. Il secondo passaggio della procedura consiste nel preparare l'assemblaggio microfluidico su PCB e le soluzioni di microsfere e cellule.Il terzo passaggio della procedura consiste nel riempire i canali con un mezzo a bassa conducibilità, quindi caricare le perle e le cellule. L'ultimo passaggio della procedura è collegare l'assemblaggio PCB all'amplificatore di potenza e al generatore di funzioni, quindi avviare la DEP. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la separazione e la manipolazione di cellule e perle in dispositivi microfluidici mediante l'utilizzo della DEP.Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà poiché è necessario che l'utente comprenda i principi della DEP al fine di sviluppare un elettrodo efficace, da utilizzare con un dispositivo microfluidico, per la manipolazione di cellule o microsfere. D'altro canto, l'uso di circuiti stampati (PCB) come elettrodi rende la manipolazione di cellule e microsfere nei dispositivi microfluidici accessibile a diverse discipline scientifiche. Il primo passo di questa procedura consiste nel progettare gli elettrodi del circuito stampato (PCB) con la geometria desiderata per generare un campo elettrico non uniforme.Una volta completata la progettazione, ordinare le schede elettrodi PCB personalizzate presso un'azienda commerciale di produzione. Dopo aver ricevuto il PCB personalizzato, aprirlo e ispezionarlo per questa dimostrazione. Il PCB è lungo 8,4 centimetri e largo 2,1 centimetri.Gli elettrodi metallici hanno una larghezza di cinque millimetri. In questo esempio, gli elettrodi presentano due strisce metalliche lunghe e due regioni trasversali lunghe 4,5 millimetri in cui gli elettrodi sono intrecciati. Queste regioni intrecciate generano un campo elettrico non uniforme intenso, necessario per creare una connessione tra lo stimolatore e l'elettrodo del circuito stampato (PCB).Posizionare un filo da 16 gauge all'estremità dell'elettrodo. Utilizzare un saldatore caldo per tenere il filo in posizione sull'area metallica della PCB. Questo riscalda il filo.Tenere il saldante sul filo riscaldato e permettere a una piccola quantità di saldante di fluire all'interno del filo. Una volta che il filo è riempito di saldante, rimuovere la saldatura tenendo il filo in posizione mentre il saldante si raffredda. Ripetere il processo di saldatura per l'altra connessione elettrica sulla PCB.Il passo successivo consiste nel preparare canali microfluidici con il modello di ramificazione desiderato. Utilizzando tecniche standard di microfabbricazione, creare un modello maestro per definire i canali, impiegando una piastrina di silicio e il photoresist SU eight. Questo modello maestro presenta un canale di ingresso e tre canali target.La larghezza dei canali è di 100 micrometri e l'altezza dei canali è di 27 micrometri. Una volta creato il modello master, mescolare il polimetil LAANE o l'elastomero PDMS con un agente indurente in un rapporto ponderale di 10 a 1 per cinque minuti. Versare il PDMS liquido sul modello master SU eight prefabbricato ed eliminare le bolle d'aria esponendo il PDMS liquido al vuoto per tre minuti.Ripetere il processo a vuoto se necessario per rimuovere completamente tutte le bolle. Un flusso di gas azoto può essere utilizzato per rimuovere eventuali bolle residue, se necessario. Polimerizzare il PDMS in un forno a 70 gradi Celsius per due ore.Utilizzare una lametta per rimuovere dal wafer il labirinto P-D-M-S-S con i canali microfluidici, facendo attenzione a non rompere il wafer con lo spazio del canale rivolto verso l'alto. Usare una perforatrice per biopsie per praticare fori attraverso cui introdurre fluidi e cellule nel dispositivo microfluidico. Tagliare.Qualsiasi eccesso di PDMS. Ispezionare il dispositivo microfluidico per assicurarsi che sia privo di polvere e detriti. Utilizzare nastro adesivo 3M Scotch Magic per pulire il PDMS.Esponi i canali in PDMS e un'ampolla di vetro numero zero pulita con uno spessore compreso tra 80 e 130 micrometri al gas al plasma per 1,5 minuti. Rimuovi il laboratorio in PDMS e l'ampolla di vetro dal pulitore al plasma in una piastra di Petri; effettua il legame al plasma posizionando i canali microfluidici in PDMS con la parte inferiore rivolta verso il basso sull'ampolla di vetro. Riscalda l'insieme microfluidico composto da ampolla di vetro e PDMS su una piastra riscaldata impostata a 100 gradi Celsius per almeno 15 minuti. L'ultimo passaggio nella preparazione del dispositivo microfluidico consiste nel posizionare i canali in PDMS e l'ampolla di vetro sopra gli elettrodi della PCB.Iniziare posizionando circa 10 microlitri di olio minerale sulla PCB. Per garantire un contatto stretto tra la PCB e il vetrino, posizionare l'assiemblea del canale microfluidico con il vetrino sulla PCB oliata con il vetrino. A contatto con l'olio, premere delicatamente l'assiemblea microfluidica con il vetrino verso il basso per assicurare un buon contatto e ridurre al minimo le bolle d'aria che potrebbero compromettere la visualizzazione delle cellule e delle microsfere.Un altro passaggio importante è preparare la miscela di mezzo a bassa conducibilità, costituita da saccarosio all'8,5% e glucosio allo 0,3% (peso su volume) in acqua deionizzata. Il dispositivo microfluidico è ora pronto per l'uso: utilizzando una pipetta, riempire ogni canale microfluidico con da 15 a 20 microlitri del mezzo a bassa conducibilità, se necessario. Utilizzare l'aspirazione sotto vuoto per rimuovere eventuali bolle d'aria nei canali.Il passo successivo consiste nell'introdurre le particelle di prova nel dispositivo microfluidico. Questa dimostrazione utilizza una sospensione di 550 perle di polistirene per microlitro di mezzo a bassa conducibilità; poiché le perle possono sedimentare nel tempo, ri-sospendere le perle agitando. Successivamente, utilizzando una pipetta, introdurre 200 microlitri della sospensione di perle di polistirene nel canale.Il passo successivo consiste nel preparare gli elettrodi, collegando l'uscita di un generatore di funzioni all'ingresso di un amplificatore di potenza in corrente alternata. Successivamente, collegare l'uscita dell'amplificatore ai cavi degli elettrodi. Coprire tutti i cavi elettrici e le superfici elettriche dell'apparato con del nastro isolante per proteggere l'utente da possibili contatti con scosse elettriche.Impostare il generatore di funzioni per produrre un'onda sinusoidale in uscita da uno a 1,5 megahertz. Avviare la DEP per iniziare la separazione di cellule e microsfere in questa configurazione. Il canale di ingresso è a destra e i tre canali bersaglio si separano al giunto triforcuto.Gli elettrodi PCB corrispondono alle strisce nere senza flusso laminare e senza DEP. I microsferini sono essenzialmente stazionari all'avvio della DEP, ma in assenza di flusso. I microsferini migrano verso gli elettrodi PCB e lontano dallo spazio tra gli elettrodi quando il flusso laminare è attivo.Tuttavia, in assenza di DEP, le microsfere che scorrono attraverso i canali di ingresso vengono suddivise tra i tre canali target. Quando viene attivato il DEP e il flusso laminare è presente, le microsfere vengono indirizzate a fluire esclusivamente nel canale centrale. Nei prossimi video, il dispositivo microfluidico viene ruotato sopra gli elettrodi PCB, provocando un cambiamento nell'orientamento dei canali.Rispetto agli elettrodi del PCB, il canale di ingresso, che precedentemente era perpendicolare agli elettrodi del PCB, è ora quasi parallelo agli elettrodi con il flusso laminare attivo. Tuttavia, con la forza dielettroforetica disattivata (DEP off), le microsfere entrano in modo uguale in tutti e tre i canali bersaglio.Quando viene attivata la DEP, le perline si avvicinano al punto di triforcazione e la forza dielettroforetica spinge le perline nel canale laterale sopra l'elettrodo. Questo successivo insieme di figure nel video mostra una miscela di cellule di adenocarcinoma del colon umano o cellule HT 29 e perline fluorescenti all'interno del dispositivo microfluidico. In questa immagine DIC, la freccia aperta indica la direzione del flusso laminare, e i canali sono delineati con linee tratteggiate.Gli elettrodi metallici riflettenti possono essere visti come la striscia chiara sullo sfondo; la microscopia DIC viene utilizzata per acquisire immagini delle perline durante il fenomeno di luminescenza. Intensità della scala. Le immagini vengono utilizzate per rendere le cellule più visibili.Questa figura è la stessa immagine dell'altra figura, ma mostrata come un'immagine di intensità su scala cromatica, utile per visualizzare sia le cellule che le perle. Le elettrodi metallici riflettenti appaiono come strisce gialle e verdi in questa figura. Con la DEP, le perle escono dal canale destro come mostrato nell'immagine DIC, mentre le cellule HT 29 escono dai canali centrale e sinistro, come mostrato nell'immagine su scala cromatica prima dell'avvio della DEP. Una soluzione mista di cellule e perle fluisce da un canale di ingresso verso i tre canali target separati.Dopo aver indotto la DEP, le microsfere e le cellule vengono attivate selettivamente in canali separati. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come iniziare a implementare l'elettroforesi a disco per la manipolazione di cellule e microsfere all'interno di dispositivi microfluidici.

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